蛋白质组学、临床诊断和食品分析等领域均涉及氨基酸的手性分析与拆分。氨基酸的拆分方法包括化学拆分法、色谱拆分法、酶拆分法和诱导结晶法等,其中色谱法因高效、可靠、精确而得到广泛应用^[1]。基于不同手性识别机理的手性固定相相继被研制出来,如涂覆、化学键合手性配体^[2]以及手性冠醚^[3,4,5,6]等,这些手性固定相对氨基酸具有不同的手性识别机理,例如通过奎宁的离子交换作用^[7,8,9]和冠醚的络合作用^[3,4,5,6]对氨基酸进行手性拆分。本课题组制备了奎宁-冠醚组合型手性固定相^[10],固定相与氨基酸的作用模式如图1所示。通过离子交换和络合的协同作用,对氨基酸的手性对映体有良好的拆分能力。

图1

Fig. 1

图1 奎宁-冠醚组合型手性固定相与氨基酸的作用模式 Fig.1 Action model between chiral stationary phase combined with quinine and crown ether and amino acids

1998年,Fornstedt等^[11]通过测定手性对映体在固定相上的等温吸附线证实了手性固定相表面是不均匀的。多数键合型手性固定相表面的作用位点可分为手性作用位点和非手性作用位点^[12,13],手性作用位点主要影响化合物的选择性。通过测定手性对映体在固定相表面的等温吸附线,分析了其在固定相表面的吸附行为,这对揭示手性拆分机理以及固定相结构的进一步优化具有重要的意义,该方法已经广泛应用于手性固定相的研究领域^[14,15,16]。

理想色谱模型下,谱带的迁移方程如下:

矩形浓度进样^[15]时,吸附容量的计算公式为:

通过测定不同浓度下样品在固定相中的吸附容量,可以获得样品的等温吸附线。目前测定等温吸附线的方法主要有迎头分析(FA)法、特殊点洗脱(ECP)法和迎头特殊点洗脱(FACP)法^[17]。其中FACP法相对简单,准确度较高,因此本文采用FACP法测定Trp在奎宁-冠醚组合型固定相上的等温吸附线,建立了Trp的等温吸附模型,并对Trp在固定相上的手性拆分机理进行了研究。

Waters高效液相色谱仪配备515型HPLC泵、1500型柱温箱和2996型紫外检测器(美国Waters公司); KH5200B型超声波清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司); Milli-Q超纯水发生器(美国Millipore公司)。

氨基酸(纯度＞95%)、甲酸(FA)、二乙胺(DEA)、高氯酸锂(LiClO₄)、奎宁(QN)和三乙胺(TEA)均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司;甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)、乙醇(EtOH)、4-硝基苯基氯甲酸酯和γ-巯丙基三甲氧基硅烷购自北京百灵威科技有限公司;氢氧化锂(LiOH\5H₂O)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)和硼氢化钠(NaBH₄)均购自上海凌峰化学试剂有限公司;球形硅胶(粒径为5 μm,比表面积为300 m²/g)由华谱新创科技有限公司提供;3′-苯并十八冠-6-醚、活化奎宁^[10]和(1S,2S)-2-氨基环己基苯基氨基甲酸酯^[18]根据文献合成;实验用水均为超纯水。

QN-CR CSP的合成过程如下:3′-苯并十八冠-6-醚(C-1)与(1S,2S)-2-氨基环己基苯基氨基甲酸酯经缩合反应得到席夫碱,其经硼氢化钠还原得C-2。将C-2经氯乙酰化和氨水氨解反应得C-3,其与4-硝基苯基氯甲酸酯活化的奎宁C-4反应制得选择器C-5。选择器C-5与γ-巯丙基三乙氧基硅烷修饰的硅胶经自由基加成反应得固定相QN-CR CSP。最后将其置于20 mL乙醇中匀浆,以乙醇为顶替液在50 MPa下填装于不锈钢柱管(150 mm×4.6 mm)中。合成路线见图2。

图2

Fig. 2

图2 QN-CR CSP的合成路线 Fig.2 Synthesis route of QN-CR CSP

色谱条件:流动相为80%(体积分数)MeOH-120 mmol/L FA-60 mmol/L MOH(MOH中的M代表不同的阳离子,分别为Li、Na和K);流速为0.8 mL/min;检测波长为254和305 nm;色谱柱为QN-CR CSP(150 mm×4.6 mm,150 μm);柱温为30 ℃。用1,3,5-三叔丁基苯测定死时间为2.21 min。

采用FACP法测定氨基酸的等温吸附线,实验配置的定量环为5 mL。为保证进样浓度分布接近矩形浓度,采用截点进样(cut up injection)的方式进样^[19],进样时间为3.5 min。

手性选择器C-5的¹H-NMR(CDCl₃) (δ值)数据:1.25(t,3H),1.46～1.48(t,2H),1.60(s,1H),1.71(s,2H),1.84(s,1H),2.03(s,2H),2.11(s,2H),2.27(s,2H),3.00(d,1H),3.38(t,1H),3.59(s,2H),3.65(s,7H),3.73(s,4H),3.88～3.93(m,6H),4.11～4.16(m,6H),4.29(s,2H),4.41(d,1H),4.61(s,1H),4.76(d,1H),4.90～4.95(t,2H),5.42(s,1H),6.63(d,1H),6.78(d,1H),6.89～6.96(t,2H),7.21(t,2H),7.35～7.44(m,6H),7.89(s,1H),8.10(d,1H),8.28(s,1H),8.72(s,1H)。

选取系列氨基酸对映体为分析物对QN-CR CSP的手性拆分性能进行评价,其中12个氨基酸能够得到拆分(见表1),在该固定相上,D-型氨基酸在色谱柱中首先被洗脱。色谱柱对Trp和Tyr的手性拆分能力尤为出色(见图3),手性选择因子(α)分别为1.94和1.90。

图3

Fig. 3

图3 Trp和Tyr的手性分离 Fig.3 Enantioseparations of Trp and Tyr

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 氨基酸在QN-CR CSP上的分离结果 Table 1 Resolution results of amino acids on QN-CR CSP Analyte k1 α Rs EO Mp Analyte k1 α Rs EO Mp Phg 3.98 1.31 2.04 D A Phe 1.78 1.40 1.91 D A Trp 2.59 1.94 3.65 D B Tyr 1.50 1.90 3.84 D B Val 1.93 1.80 2.87 D A Ile 2.55 1.21 1.46 D A Ser 2.87 1.42 2.44 n. d. C Thr 3.36 1.17 1.06 n. d. C 3.76 1.11 ＜ 0.5 D C 6.06 1.04 ＜ 0.5 D A k1: retention factor; α: selectivity factor; Rs: resolution; EO: first configuration enantiomer peak; n. d.: not determined; Mp: mobile phase; A: MeOH (methanol)-FA (formic acid)-DEA (diethylamine) (100∶0.1∶0.1, v/v/v); B: MeOH-25 mmol/L FA-12.5 mmol/L TEA (triethylamine); C: 90% (v/v) ACN (acetonitrile)-5 mmol/L LiClO4.

表1 氨基酸在QN-CR CSP上的分离结果 Table 1 Resolution results of amino acids on QN-CR CSP

固定相结构中的18冠-6基团对Li⁺、Na⁺和K⁺等阳离子产生络合作用^[20,21],本文通过在流动相中添加不同的阳离子,考察了Trp在不同阳离子存在条件下的保留情况和手性选择性,结果见图4。随Li⁺、Na⁺和K⁺半径依次增加,Trp的保留时间变短,手性选择性下降。流动相中的金属离子与Trp中的氨基竞争冠醚的络合位点,其中K⁺与18冠-6的络合能力最强,固定相对Trp的保留和手性选择性下降最明显。

图4

Fig. 4

图4 Trp在不同阳离子条件下的分离 Fig.4 Separations of Trp with different cationic additives

对氨基酸而言,QN-CR CSP结构中存在两种主要的活性吸附位点:离子交换位点(A)和冠醚的络合作用位点(B)。氨基酸的羧基和离子交换位点产生离子交换作用,氨基与冠醚产生络合作用。流动相中的阴离子(FA^-)和氨基酸竞争与奎宁发生离子交换作用,金属离子M(M为Li⁺、Na⁺或K⁺)和氨基酸竞争与冠醚发生络合作用。

在推导等温吸附方程时,做了如下假定:假定1.如果氨基酸的氨基与络合位点相互作用,且离子交换位点和络合作用位点的距离足够近,其羧基会同时与离子交换位点发生静电相互作用,所产生的吸附模式为AB-X,其中X代表氨基酸分子。假定2.金属离子能够与冠醚发生络合作用,如果冠醚络合位点被金属离子所占据,被金属离子占据的位点会形成新的离子交换位点,对氨基酸产生吸附作用,因此随着流动相中金属离子的种类和浓度的变化,固定相中的离子交换位点的总量也随着变化。假定3.氨基酸在流动相中的浓度足够小,氨基酸分子之间的相互作用不予考虑。

根据上述假设,可以算出络合交换和离子交换产生的吸附容量。具体的推导过程如下。

(1)络合交换:

金属离子与冠醚的络合平衡(B+M B-M):

氨基酸与冠醚的络合平衡(B+XB-X→AB-X):

考虑金属离子与氨基酸的络合竞争吸附,通过络合和静电相互协同作用(AB-X)产生的氨基酸吸附容量q_CR^[22]为:

(2)离子交换:

氨基酸的离子交换平衡(A+X A-X):

甲酸根的离子交换平衡(A+FA A-FA):

考虑氨基酸与溶液中阴离子的竞争吸附,由离子交换产生的吸附容量q_ex为:

氨基酸的总吸附容量q为:

在一定的流动相条件下,金属离子的浓度(c_M)和甲酸根离子的浓度(c_FA)是固定的,上式可以改写为如下形式:

该方程与Bi-Langmuir等温吸附线^[17]形式类似,公式(10)中K₃和K₄分别为与金属离子络合平衡和甲酸根离子交换平衡相关常数,K₃=1+K_Mc_M,K₄=1+K_FAc_FA。在流动相中金属离子浓度相同的条件下,对于Li⁺、Na⁺和K⁺应有K_3K＞K_3Na＞K_3Li。

由于氨基酸的结构和构型不同,不同的氨基酸与固定相的离子交换和络合交换作用会受到π-π相互作用、氢键和空间位阻等因素的影响,这些相互作用会影响络合交换常数K₁和离子交换常数K₂的大小。

受氨基酸溶解度的限制,试验中使用添加不同甲酸盐的80%(体积分数)MeOH溶液以考察在更大的浓度范围内Trp的吸附行为。实验中采用FACP方法测定等温吸附线,该方法的准确性主要取决于进样浓度分布是否为矩形。因此试验中采用了截点进样的方式,进样浓度分布如图5a所示,如果将5 mL定量环中的样品全部进样,在进样的后半部分由于扩散作用,进样浓度产生拖尾。如果在流速为0.8 mL/min时,进样3.5 min后立即将进样阀切换到给样位置,得到的进样浓度分布非常接近矩形分布。用流动相配制0.520、1.005、2.001、4.004和4.504 mg/mL的Trp溶液,测定不同质量浓度的Trp溶液的紫外响应值,用二次方程对紫外响应值(A,AU)和质量浓度(C,mg/mL)的关系进行拟合(见图5b),C=0.182A²+2.362A,R²=0.999 96,n=5。将试验测定的FACP洗脱曲线用该方程转换成洗脱质量浓度C与保留时间的关系曲线,并用公式(2)计算出不同浓度下的等温吸附容量,结果如图6所示。

图5

Fig. 5

图5 (a)满环进样和截点进样色谱峰对比图和(b)吸光度对浓度校正曲线图 Fig.5 (a) Comparison of the chromatographic peaks of the full-loop injection and the cut up injection and (b) the absorbance-concentration calibration curve

图6

Fig. 6

图6 不同阳离子条件下Trp的等温吸附线实验点及非线性拟合线 Fig.6 Experimental points of Trp’s adsorptionsisotherms and the nonlinear fitting lines with different cationic additives

将得到的等温吸附数据用方程(10)进行拟合,等温吸附方程中各个参数见表2,在几种不同流动相条件下都有K_1D＜K_1L,K_2D＞K_2L,这两种作用对手性选择性的贡献相反,但络合吸附平衡常数远大于离子交换平衡常数,导致L-Trp在固定相中保留时间更长,说明络合作用对固定相的手性选择性起主要作用。据此,如能对固定相的手性结构进行进一步调整,使络合交换与离子交换对Trp的手性选择性贡献一致,能进一步提高固定相的手性选择性。随着Li⁺、Na⁺、K⁺半径的增大,K₃值增大,这是由于随着阳离子半径增大,金属离子与冠醚的络合作用力增强。金属离子与Trp竞争手性络合吸附位点,络合能力越强的金属离子对固定相的手性选择性影响越大,这与前面试验中观察到的金属离子对手性选择性的影响结果一致。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同阳离子条件下Trp的等温吸附参数 Table 2 Adsorption isotherm parameters of Trp with different cationic additives Cation-Trp q1 q2 K1 K2 K3 K4 R2 Li+-D-Trp 6.858 18.130 1.678 0.0463 6.009 1.161 0.9997 Li+-L-Trp 8.152 16.738 1.753 0.0390 6.010 1.162 0.9997 Na+-D-Trp 1.699 16.255 1.683 0.0458 7.218 1.164 0.9988 Na+-L-Trp 1.732 20.726 1.762 0.0388 7.254 1.152 0.9994 K+-D-Trp 1.423 13.002 1.669 0.0462 8.103 1.163 0.9971 K+-L-Trp 1.635 13.460 1.769 0.0391 8.117 1.164 0.9981 q1, q2, K1, K2, K3 and K4 are the same as in equation (10).

表2 不同阳离子条件下Trp的等温吸附参数 Table 2 Adsorption isotherm parameters of Trp with different cationic additives

固定相的手性结构对甲酸根的离子交换没有影响,固定相与甲酸根离子交换相关的常数K₄应基本相同,在几种流动相条件下,模型拟合得到的甲酸根与固定相的离子交换常数非常接近,符合吸附模型的预期。D-Trp在流动相含Li⁺、Na⁺和K⁺时的络合平衡常数非常接近,L-Trp也是如此,该结果同样符合模型的预测,因为Li⁺、Na⁺和K⁺等的竞争只是影响Trp的吸附量,对Trp的吸附平衡常数影响很小。以上结果说明该吸附模型基本上能够反映Trp在固定相上的吸附行为。

本文报道了一种奎宁-冠醚组合型手性固定相的制备,该固定相对氨基酸的手性对映体具有良好的选择性。根据固定相的结构特点,建立了氨基酸在固定相中的吸附模型,通过考察Li⁺、Na⁺和K⁺等对Trp手性选择性以及等温吸附线的影响,对Trp在该固定相的保留行为进行了详细的研究。奎宁-冠醚组合型手性固定相对氨基酸的手性分离是一个复杂的过程,固定相对Trp的手性选择性主要来源于冠醚的络合与奎宁的离子交换的协同作用,该结果对理解氨基酸在此类固定相中的手性保留行为及固定相结构的进一步优化具有重要的意义。