高效液相色谱系统,包括SPD-16紫外-可见检测器和LC Solution工作站(岛津公司)。离心浓缩系统(Speed Vac Concentrator Iss 110)。

马来酸依那普利片(江苏制药股份有限公司);复方利血平氨苯蝶啶片(华润双鹤药业股份有限公司);呋塞米片(江苏亚邦爱普森药业有限公司);缬沙坦胶囊(北京诺华制药有限公司),其分子结构式见图1。

图 1

Fig. 1

图 1 依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米和缬沙坦的分子结构式 Fig. 1 Structures of enalapril,triamterene, furosemide and valsartan

乙酸铵(天津市盛奥化学试剂有限公司);乙腈(色谱纯);高纯水采自低有机物型超纯水机(FDY2002-SUV,青岛富勒姆科技有限公司);其他试剂均为分析纯。所有试剂均直接使用,未经其他处理。

色谱柱:WondaSil C18-WR(150 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相:A相为10.0 mmol/L 的乙酸铵水溶液(pH 3.90),B相为乙腈;梯度洗脱:0～3.00 min,5%B; 3.01～14.00 min,5%B～60%B; 14.01～16.00 min,60%B～80%B; 16.01～18.00 min,80%B;流速:1.0 mL/min;检测波长:254 nm;柱温:室温;进样体积:20 μ L。

首先采用C18固相萃取柱(WAT03590,100 mg,沃特世科技有限公司)对市售依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米、缬沙坦进行提纯。提纯后的药品经HPLC分析,以保证其纯度。用10.0 mmol/L 乙酸铵水溶液(pH 3.90)准确配成质量浓度分别为3.00×10²、1.00×10²、7.50×10²、1.00×10² mg/L 的标准储备液,于冰箱冷藏保存,备用。分别用10.0 mmol/L 乙酸铵水溶液逐级稀释上述标准储备液,配制含依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米、缬沙坦质量浓度0.15～300 mg/L、0.05～100 mg/L、0.75～750 mg/L、0.05～100 mg/L 的系列混合标准溶液。

于新疆维吾尔自治区人民医院体检中心采集样本,共收集晨起尿样3例,志愿者身体健康,一星期之内未服用任何药物,24 h内未饮用含咖啡因的饮品。同时于住院部肾病科收集患者晨起尿样1例。尿样收集后,在2 h内进行处理,4 ℃下 3 000g离心10 min,以除去固形物,上清液置于-80 ℃冰箱中保存,备用。

尿样在室温下解冻,混合均匀,取200 μ L上清液于1.5 mL具塞离心管中,加冷丙酮800 μ L,4 ℃静置30 min,12 000g离心15 min除去蛋白质,将上清液真空冷冻干燥,并用400 μ L 10.0 mmol/L 乙酸铵水溶液(pH 3.90)复溶作为样品溶液。用10.0 mmol/L 乙酸铵水溶液(pH 3.90)逐级稀释10倍,过0.45 μ m滤膜,备用。

4种肾脏病常用药物的分子结构式如图1所示。其中依那普利结构中有仲氨基、叔氨基和羧基,氨苯蝶啶中只有伯氨基和叔氨基,呋塞米中含伯氨基、仲氨基和羧基,而缬沙坦中含叔氨基和羧基,这说明4种药物的疏水性差异较大;同时由于均含有碱性官能团氨基,这会导致色谱峰形出现较为严重的拖尾现象。为改善峰形,提高定量准确性,参照文献^[18]所建议的色谱优化过程,首先分别考察这4种药物在不同类型缓冲盐(pH 3.90的磷酸盐和乙酸铵体系)、不同乙腈体积分数(1% ～80% )下的等度洗脱色谱行为,以保留时间、峰形等为指标,筛选出最佳缓冲盐及其浓度和乙腈体积分数,然后再对梯度洗脱条件进一步优化,进而筛选出最佳色谱条件(见1.2节)。在此优化色谱条件下,4种药物的典型HPLC色谱图列于图2。

表 1 (Table 1)

表 1 4种药物的线性方程、相关系数、检出限和定量限 Table 1 Regression equations,correlation coefficients (r),limits of detection and limits of quantification of the four drugs Drug Regression equation r Linear range/(mg/L) LOD/(mg/L) LOQ/(mg/L) Enalapril Y=1.266×109X+1.023×104 0.9953 0.15-300 1.38×10-2 4.60×10-2 Triamterene Y=1.203×1010X-5.467×103 0.9994 0.05-100 7.67×10-3 2.56×10-2 Furosemide Y=6.456×108X+6.328×103 0.9998 0.75-750 3.69×10-2 1.23×10-1 Valsartan Y=1.166×1010X+5.493×103 0.9998 0.05-100 1.16×10-2 3.85×10-2 Y: peak area; X: mass concentration,mg/L. LOD: S/N=3; LOQ: S/N=10.

表 1 4种药物的线性方程、相关系数、检出限和定量限 Table 1 Regression equations,correlation coefficients (r),limits of detection and limits of quantification of the four drugs

不同质量浓度的4种药物的混合标准溶液在优化后的色谱条件下进行分析(n=3),以质量浓度-峰面积平均值作图,制作定量标准曲线,以S/N=3确定检出限,S/N=10确定定量限。由表1可以看出,4种药物的线性拟合相关系数r均大于0.995,线性良好,可以用于准确定量。同时检测线性范围达到4～5个数量级,适用浓度范围广。

图 2

Fig. 2

图 2 (a)4种药物混合标准溶液、(b)加标正常人尿样和(c)患者尿样的HPLC典型色谱图 Fig. 2 Typical HPLC chromatograms of (a) a standard mixture of the four drugs,(b) spiked urine sample and (c) a patient urine sample Conditions: WondaSil C18-WR (150 mm×4.6 mm,5 μ m); flow rate,1.0 mL/min; detection wavelength,254 nm; mobile phase A,10 mmol/L CH3COONH4 solution (pH 3.90); B,CH3CN; gradient program: 0-3.00 min,5%B; 3.01-14.00 min,5%B-60%B; 14.01-16.00 min,60%B-80%B; 16.01-18.00 min,80%B. Peak identification: 1. enalapril; 2. triamterene; 3. furosemide; 4. valsartan.

为验证方法的可靠性,首先对3例健康志愿者的尿液样本采用1.5节的方法进行处理,分别在上述3个尿样中添加3个浓度水平的目标物,并在优化的色谱条件下进行分离分析,所得HPLC典型色谱图见图2b;对3个尿样中同一药物在同一加标浓度水平的数据求平均值,并计算回收率和精密度。由表2可知依那普利的平均回收率为93.39% ,氨苯蝶啶的平均回收率为99.20% ,呋塞米的平均回收率为89.49% ,缬沙坦的平均回收率为98.27% ,RSD均小于10% ,表明方法的重现性良好,所建立的方法可用于实际样品中4种药物的分离分析。