ACQUITY UPLC^ 2D Xevo G2-S QTOF液相色谱-质谱联用仪(美国Waters公司); XS204型电子天平(瑞士梅特勒-托多利公司); Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

头孢噻吩钠:生产企业A为苏州中联化学制药有限公司(批号:10110087、10110089、10112026)、生产企业B为上海新亚药业有限公司(批号:100902)、生产企业C为山东罗欣药业股份有限公司(批号:313042102)、生产企业D为齐鲁制药有限公司(批号:2100028AP)、生产企业E为苏州二叶制药有限公司(批号:130304)和Sigma公司(批号:110M0789V);头孢噻吩钠对照品:中国食品药品检定研究院(批号:130407-200707)和欧洲药典委员会(批号:2.0);乙腈和甲酸为色谱级(德国Merck公司);磷酸氢二钾和磷酸为分析级(上海凌峰化学试剂有限公司)。

称取头孢噻吩钠75 mg,置于25 mL容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀。

磷酸盐缓冲液:取磷酸氢二钾1.742 g,加水溶解并稀释至 1000 mL,用磷酸调节pH值至2.5。

色谱柱:Symmetry C18 (250 mm×4.6 mm,5 μ m);柱温:40 ℃;检测波长:220 nm。流动相A:磷酸盐缓冲液(pH 2.5)-乙腈(97 ∶ 3,v/v);流动相B:磷酸盐缓冲液(pH 2.5)-乙腈(3 ∶ 2,v/v);进样量:10 μ L。梯度洗脱条件:0～30 min,从0%B线性升至100%B,保持到35 min; 35～36 min,从100%B线性降至0%B,并保持到41 min。流速:1.0 mL/min。

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18 (50 mm×2.1 mm,1.7 μ m);柱温:40 ℃。流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液;流动相B: 0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液。梯度洗脱条件:杂质峰切峰开始后5 min,流动相B由5%升至70% ,保持到35 min;35～36 min,从70%B线性降至5%B，并保持到41 min。流速:0.45 mL/min。

溶剂:0.1%(v/v)甲酸水溶液;流速:2 mL/min;捕集柱:HLB C18(30 mm×2.1 mm,20 μ m)。

电离源:ESI+;毛细管电压:1.0 kV;源温度:100 ℃;雾化气温度:500 ℃;雾化气流速:800 L/h;锥孔气流速:50 L/h;质谱软件:MassLynx^ 4.1。

通过一维紫外检测色谱图确定各杂质的出峰位置,分别对各杂质进行中心切割,通过在液相色谱方法中设置阀切换时间,将杂质捕集至捕集柱上,同时脱盐。再通过阀切换将杂质从捕集柱上反冲至二维色谱柱上分离,最后进入质谱进行分析。四极杆-飞行时间质谱仪采用MS^E的采集模式,同时得到一级质谱和二级质谱。使用软件通过精确相对分子质量和同位素分布进行元素组成分析,确定分子式,结合生产工艺和二级质谱碎片推导各杂质可能的结构。

图2为头孢噻吩钠(批号:10110087)样品溶液在一维液相色谱条件下的紫外检测色谱图,其中杂质1～6的含量在0.05% ～0.4%之间。本研究分别对这6个杂质进行了结构推导和来源分析。

图2

Fig. 2

图2 头孢噻吩钠样品溶液在一维液相色谱条件下的紫外检测色谱图 Fig.2 First dimensional HPLC-UV chromatogram of cefalotin sodium Peaks 1-6: impurities 1-6.

选择含量较低的杂质4进行重点描述。图3为将杂质4(原位于图3a虚线间)从一维液相色谱系统切至二维液相色谱系统后得到的一维紫外检测色谱图和二维总离子流图。二维谱图中保留时间28 min左右的杂质即一维紫外检测色谱图中的杂质 4。其一级和二级质谱图如图4所示,根据其精确相对分子质量和同位素分布,推测其分子式可能为C₁₄H₁₃NO₆S₂。结合其二级质谱碎片及头孢噻吩钠的生产工艺,推测其可能的结构如图5所示。其中m/z 232的碎片是侧链在a处发生裂解后所得的母核碎片;m/z 186的碎片是同时在a处和b处发生裂解后所得的母核碎片;m/z 97的碎片是侧链在c处发生裂解后所得的噻吩亚甲基碎片。

图3

Fig. 3

图3 杂质4切入二维色谱后的(a)一维紫外检测色谱图和(b)二维总离子流图 Fig.3 (a) First dimensional HPLC-UV chromatogram and (b) the second dimensional total ion current chromatogram after impurity 4 was cut into the second dimensional LC Peaks 1-3,5,6: impurities 1-3,5,6.

图4

Fig. 4

图4 杂质4的(a)一级和(b)二级质谱图 Fig.4 (a) MS and (b) MS2 spectra of impurity 4

图5

Fig. 5

图5 杂质4可能的结构 Fig.5 Proposed structure of impurity 4

用上述方法分别对其余5个杂质进行分析,其MS数据、分子式和推测所得结构式分别如表1所示。其中,杂质1、杂质4和杂质6为头孢噻吩钠中新发现的杂质;杂质2、杂质3和杂质5分别为头孢噻吩钠已知杂质B、D和A,其相对主峰的相对保留时间分别为0.73、0.82和0.96。其中杂质A的相对保留时间与《中国药典》中规定的相对保留时间(0.8)存在较大差异。该研究结果也与我们之前的研究结果^[15]一致,本研究进一步证明《中国药典》2010年版对头孢噻吩钠杂质A认定有误。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 头孢噻吩钠中杂质1～6的MS数据及解析 Table 1 MS data and proposed structures of the impurities 1-6 in cefalotin sodium Impurity number Retention time/min Relative retention time * [M+H] + ( m/z) Key fragment ions of MS 2 ( m/z) Molecular formula Proposed chemical structure 1 18.02 0.70 370.9926 343,325,297,216, 182,156,97 C 14H 11ClN 2O 4S 2 2 18.72 0.73 355.0411 337,309,263,226, 182,156,97 C 14H 14N 2O 5S 2 3 20.97 0.82 337.0308 309,226,182,156, 97 C 14H 12N 2O 4S 2 4 21.73 0.85 356.0266 338,232,186,158, 97 C 14H 13NO 6S 2 5 24.58 0.96 339.0131 309,263,232,182, 156,97 C 14H 14N 2O 4S 2 6 31.76 1.24 338.0158 279,264,226,199, 140,97 C 14H 11NO 5S 2 * Retention time of the impurity with reference to the retention time of cefalotin.

表1 头孢噻吩钠中杂质1～6的MS数据及解析 Table 1 MS data and proposed structures of the impurities 1-6 in cefalotin sodium

对不同产地不同批次的头孢噻吩钠样品进行测定,结果见表2(峰面积比即含量小于0.02%的杂质忽略不计)。可见除欧洲药典对照品检出杂质1～5外,其余样品均检出杂质1～6,说明不同来源的头孢噻吩钠的生产工艺类似。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同产地不同批次的头孢噻吩钠样品中杂质的含量 Table 2 Contents of the impurities in cefalotin sodium from different manufacturers Manufacturer or origin Batch No. Contents of related substances/% Impurity Nos. Highest content of single impurity Total impurity A 10110087 0.42 0.74 1,2,3,4,5,6 10110089 0.47 0.78 1,2,3,4,5,6 10112026 0.39 0.71 1,2,3,4,5,6 B 100902 0.45 0.84 1,2,3,4,5,6 C 313042102 0.32 0.64 1,2,3,4,5,6 D 2100028AP 0.34 0.66 1,2,3,4,5,6 E 130304 0.25 0.53 1,2,3,4,5,6 Sigma 110M0789V 0.42 0.78 1,2,3,4,5,6 CRS of ChP 130407-200707 0.38 0.79 1,2,3,4,5,6 CRS of EP 2.0 0.31 0.61 1,2,3,4,5 A-E: manufacturers A-E; CRS: chemical reference substance; ChP: Chinese Pharmacopoeia; EP: European Pharmacopoeia.

表2 不同产地不同批次的头孢噻吩钠样品中杂质的含量 Table 2 Contents of the impurities in cefalotin sodium from different manufacturers

杂质1从来源上分析可能为头孢噻吩钠合成起始原料7-ACA中的杂质去乙酰7-ACA内酯^[4,15]与另一起始原料2-噻吩乙酰氯缩合,同时其内酯环上的氢被氯取代后所得的副产物,也可能是降解产生的头孢噻吩钠杂质D内酯环上氢原子被氯取代所得的降解产物。杂质2(即头孢噻吩钠杂质B)可能是7-ACA中的杂质去乙酰7-ACA^[4,15]与2-噻吩乙酰氯缩合产生的副产物,也可能是头孢噻吩钠在水溶液中缓慢水解产生的降解产物^[15,18]。杂质3(即头孢噻吩钠杂质D)可能是7-ACA中的杂质去乙酰7-ACA内酯^[4,15]与2-噻吩乙酰氯缩合产生的副产物,也可能是头孢噻吩钠在弱酸性条件下降解后再环合生成^[15,18]。杂质4可能是7-ACA中的氧取代杂质与2-噻吩乙酰氯反应生成的副产物。杂质5(即头孢噻吩钠杂质A)可能是7-ACA中的杂质7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸与2-噻吩乙酰氯缩合产生的副产物^[15]。杂质6可能是7-ACA中的氧取代杂质与2-噻吩乙酰氯反应生成的副产物。

本研究采用在线二维液相色谱-质谱联用技术对头孢噻吩钠杂质谱进行分析,方法简便、灵敏,有效地解决了流动相中含不挥发性磷酸盐的色谱系统不适合用LC-MS快速鉴定杂质结构的难题。本研究鉴定了头孢噻吩钠中6个杂质(3个已知杂质和3个新发现的杂质)的结构,并结合生产工艺对杂质来源进行了分析,为后续实现对头孢噻吩钠进行“杂质谱控制”奠定了很好的基础,为其他类似的研究提供了较好的研究思路。通过本研究还进一步确证了《中国药典》2010年版对头孢噻吩钠杂质A认定有误。由于杂质结构仅采用LC-QTOF MS手段进行鉴定,信息量仍较少,因此需要进一步对所推断的新杂质进行制备,并采用核磁共振等手段来确证杂质结构。