色谱  2016, Vol. 34 Issue (2): 189-193   PDF (830 KB)    
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宗艳平
李婧华
孙伟
刘桂霞
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山广志
高效离子抑制色谱法和高效离子交换色谱法检测琥珀酸去甲文拉法辛中琥珀酸的含量
宗艳平1,2, 李婧华2, 孙伟2, 刘桂霞2, 卢静华1 , 山广志2     
1. 辽宁医学院药学院, 辽宁 锦州 121000;
2. 中国医学科学院医药生物技术研究所, 北京 100050
收稿日期: 2015-08-17
基金项目: 科技部新药创制重大专项平台项目(2012ZX09301002-001-019);辽宁医学院横向课题(LYHX2013001).
通讯联系人: 卢静华,E-mail:jinghual888@163.com,Tel:(010)63021345; 山广志, E-mail:Shanguangzhi@imb.pumc.edu.cn
摘要: 建立了用于琥珀酸去甲文拉法辛中琥珀酸含量测定的高效离子抑制色谱和高效离子交换色谱方法。离子抑制色谱法采用Rezex ROA-organic Acid H+(8%)色谱柱,以2.50×10-3mol/L硫酸溶液为流动相等度洗脱,流速为0.5 mL/min,进样10 μ L,检测波长为210 nm,琥珀酸的含量按峰面积外标法计算;离子交换色谱法采用IonPac® AS11-HC色谱柱,以氢氧化钾为淋洗液等度洗脱,流速为1.0 mL/min,进样10 μ L,带DIONEX AERS® 500 4-mm抑制器的电导检测器检测,琥珀酸含量按峰面积外标法计算。两种方法对3批琥珀酸去甲文拉法辛中琥珀酸质量分数的测定结果分别为:28.8%、28.9%、28.9%和28.2%、28.6%、28.6%。离子抑制色谱法和离子交换色谱法在琥珀酸去甲文拉法辛中琥珀酸的含量测定结果上没有明显不同,可根据实际情况选择。
关键词: 高效离子抑制色谱法     高效离子交换色谱法     琥珀酸     琥珀酸去甲文拉法辛    
Determination of succinic acid in desvenlafaxine succinate by high performance ion-exclusion chromatography and high performance ion-exchange chromatography
ZONG Yanping1,2, LI Jinghua2, SUN Wei2, LIU Guixia2, LU Jinghua1 , SHAN Guangzhi2     
1. College of Medicine, Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, China;
2. Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China
Received: 2015-08-17
Foundation item: National Major Scientific and Technological Special Project for "Significant New Drugs Development" (2012ZX09301002-001-019); Horizontal Topic of Liaoning Medical University (LYHX2013001).
Abstract: New methods were developed for the determination of succinic acid in desvenlafaxine succinate (DVS) by high performance ion-exclusion chromatography (HPIEC) and high performance ion-exchange chromatography (HPIC). HPIEC and HPIC methods were used separately to determinate the succinic acid in DVS. With HPIEC, the sample was diluted with 2.50×10-3mol/L sulfuric acid solution and filtrated by 0.22 μ m polyether sulfone filter membrane, and then analyzed by HPIEC directly without any further pretreatment. The analytical column was Phenomenex Rezex ROA-organic Acid H+(8%)(300 mm×7.8 mm). The mobile phase was 2.50×10-3mol/L sulfuric acid solution at the flow rate of 0.5 mL/min. The column temperature was set at 40 ℃, and the detection wavelength was 210 nm. The injection volume was 10 μ L. The assay was quantified by external standard method. With HPIC, the sample was diluted with ultrapure water and filtrated by 0.22 μ m polyether sulfone filter membrane, and then analyzed by HPIC directly without any further pretreatment. The analytical column was Dionex IonPac AS11-HC (250 mm×4 mm) with a guard column IonPacAG11-HC (50 mm×4 mm). Isocratic KOH elute generator was used at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection was performed by a Dionex suppressed (DIONEX AERS 500 4-mm) conductivity detector. The injection volume was 10 μ L. The content computation was performed with peak area external reference method. The results of HPIEC method for succinic acid were 28.8%, 28.9% and 28.9%, while the results of HPIEC method were 28.2%, 28.6% and 28.6%. The results of HPIEC and HPIC methods were not significantly different. The two methods can both be used to determine the contents of succinic acid in DVS. The surveillance analytical method should be chosen according to the situation.
Key words: high performance ion-exclusion chromatography (HPIEC)     high performance ion-exchange chromatography     succinic acid     desvenlafaxine succinate (DVS)    

琥珀酸去甲文拉法辛(desvenlafaxine succinate,DVS)是一种高效、强选择性的5-羟色胺(5-HT)-去甲肾上腺素(NA)再摄取抑制剂,是文拉法辛的主要代谢物。DVS是美国食品和药物管理局(FDA)批准的首个治疗抑郁症的去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI),是目前全球应用最广泛的抗抑郁处方药。DVS能有效抑制5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NA)的重摄取作用,对5-HT的选择吸收抑制效果比传统抗抑郁药好。DVS无需通过细胞色素P450(CYD)2D6代谢,是一个双通道抑摄取剂,其抗抑郁效果与文拉法辛相似,具有耐受性强、安全性好、生物口服利用度高等特点[1],用于治疗成人的严重抑郁障碍[2, 3]。琥珀酸作为DVS中的反离子配基,提高了药物的溶解性、稳定性和生物利用度,检测和控制DVS制剂中琥珀酸的含量对保证其质量具有积极的意义。

目前用于琥珀酸分析的方法很多,主要有气相色谱(GC)[4]、毛细管电泳(CE)[5]、离子色谱(IC)[6, 7, 8, 9]、高效液相色谱(HPLC)[10, 11, 12, 13, 14]等。离子色谱法和高效液相色谱法是近年来快速发展的有机酸检测方法,二者的方法准确度较高,较多用于有机酸的分析。传统的高效液相色谱多采用有机相与一定浓度的缓冲盐溶液洗脱,结合紫外检测器,准确度、精密度较高,但流动相的配制较为复杂。

离子色谱对有机酸的检测主要以高效离子交换色谱法(high performance ion-exchange chromatography,HPIC)为主,主要检测方式为电导和紫外检测,在选择性和灵敏度方面具有优势;近年发展起来的高效离子抑制色谱法(high performance ion-exclusion chromatography,HPIEC)常用于弱离子化有机酸的定量分析[11],该方法可以在传统HPLC基础上实现有机酸的检测。以上两种方法都具有绿色、环保、简便的特点。

本文利用离子抑制色谱法和离子交换色谱法分别进行了DVS中琥珀酸含量的检测,对两种方法的检测结果进行了比较。经方法学验证,本文建立的离子抑制色谱和离子交换色谱方法重复性好、准确度高、专属性和耐用性强,都适用于琥珀酸去甲文拉法辛中琥珀酸的含量测定。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Thermo Dionex UltiMate 3000型高效液相色谱仪(DIONEX UltiMate 3000 RS紫外检测器,DIONEX UltiMate 3000自动进样器,DIONEX UltiMate 3000柱温箱,Chromeleon 7.2色谱工作站)(ThermoFisher,美国); Thermo Dionex ICS-5000+型离子色谱仪(电导检测器,DIONEX AERS 500 4-mm抑制器,淋洗液自动发生器(EGC-500),Chromeleon 7.2色谱工作站)(ThermoFisher,美国);天平(XP205,METTLER TOLEDO公司,瑞士); Milli-Q超纯水器(Integral 10,Merck Millipore公司,德国);水相针式过滤器(聚醚砜,批号9G020320,上海安普科学仪器有限公司)。

琥珀酸对照品:J＆K,批号106413,HPLC级(纯度99% );硫酸:北京化工厂,批号20130928,含量98.0% ;盐酸:北京化工厂,批号20140910,含量38.0% ;氢氧化钠溶液:Fisher Scientific,批号127493,质量分数50% ;过氧化氢:北京化工厂,批号20131011,质量分数30% 。水为超纯水(电阻率大于18.2 M Ω \5cm)。

琥珀酸去甲文拉法辛,批号1411001、1411002、1412001,均为市售原料药。

1.2 溶液制备
1.2.1 HPIEC方法中溶液的制备

对照品溶液:精密称取琥珀酸对照品适量,用流动相制成每1.0 mL中约含150 μ g的对照品溶液,摇匀,即得。供试品溶液:取供试品适量,加流动相稀释成每1 mL中约含DVS 0.5 mg的溶液,摇匀,即得。

1.2.2 HPIC方法中溶液的制备

对照品溶液:精密称取琥珀酸对照品适量,用超纯水制成每1.0 mL中约含30 μ g的对照品溶液,摇匀,即得。供试品溶液:取供试品适量,加超纯水制成每1 mL中约含DVS 0.1 mg的溶液,摇匀,即得。

1.3 色谱条件
1.3.1 HPIEC条件

色谱柱:Phenomenex Rezex ROA-organic Acid H+(8% )(300 mm×7.8 mm);流动相:2.50×10-3 mol/L 硫酸溶液,等度洗脱;流速:0.5 mL/min;柱温:40 ℃;进样量:10 μ L;检测波长:210 nm。

1.3.2 HPIC条件

色谱柱:分析柱Thermo Dionex IonPacTMAS11-HC(250 mm×4 mm);保护柱Thermo Dionex IonPacTMAG11-HC(50 mm×4 mm);淋洗条件:带连续再生阴离子捕获柱(CR-TC)装置的淋洗液自动发生器(EGC-500)产生KOH,15 mmol/L 等度洗脱;流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:10 μ L;检测方式:抑制性电导检测,采用自循环模式的阴离子电解再生抑制器,抑制电流38 mA。

2 结果与讨论
2.1 分离机理的比较

HPIEC法采用Phenomenex Rezex ROA-organic Acid H+型离子抑制色谱柱,其填充物为磺化的强阳离子交换树脂。在阳离子交换树脂柱中,强离子化阴离子受排斥作用先被洗脱,而较弱的酸,如有机酸则主要为分子形式，不被树脂排斥,按照溶质与树脂官能团之间不同极性吸引力,以及溶质与树脂的羟基之间的范德华力的差异而分离。HPIC检测有机酸利用了有机酸在水溶液中的可离解性。有机酸在水溶液中部分离解成羧酸根阴离子和氢离子,羧酸根阴离子在阴离子交换柱中与固定相阴离子交换基团相交换而保留,不同有机酸因离解度、荷电性、亲水性等差异而得到分离[15],其中有机酸的电荷数是影响保留的主要因素,对离子交换剂的亲和力是:三元酸﹥二元酸﹥一元酸。DVS中甲酸和琥珀酸的出峰顺序证实了二者分离机理的差异(见图 1)。

图1 琥珀酸的HPIEC和HPIC色谱图 Fig.1 HPIEC and HPIC chromatograms of succinic acid HPIEC: a. blank solution; b. succinic acid reference substance solution; c. sample solution. HPIC: d. blank solution; e. succinic acid reference substance solution; f. sample solution.
1. succinic acid; 2. formic acid.
2.2 方法学考察
2.2.1 系统适用性试验

取HPIEC方法和HPIC方法的样品稀释溶剂、对照品溶液(0.150 g/L、0.035 g/L)、供试品溶液(批号1412001)分别按1.3.1、1.3.2节色谱条件进样分析。测定结果表明,在两种色谱条件下,理论塔板数按琥珀酸计不低于 10 000,琥珀酸与其相邻色谱峰之间的分离度均大于2.0。

2.2.2 专属性试验

取供试品(批号1411001)适量(约相当于琥珀酸3.75 mg),分别加入质量分数为30%的过氧化氢溶液1.0 mL、2 mol/L 盐酸溶液1.0 mL、2 mol/L 氢氧化钠溶液1.0 mL,室温放置1 h后中和;另取样品分别置于100 ℃烘箱中加热1 h、紫外灯(254 nm)下照射24 h。上述样品分别加流动相溶解、稀释至25 mL,过滤;取供试品(批号1412001)适量(约相当于琥珀酸3.00 mg),参照上述方法处理样品。上述样品分别加水溶解稀释至100 mL,过滤。分别按1.3.1、1.3.2节色谱条件进样检测。结果表明,在两种色谱条件下,本品经强酸、强碱、高温和光照破坏后,未产生明显杂质,表明方法专属性良好。

2.2.3 线性关系

精密称取琥珀酸对照品36.04 mg,逐级稀释至1.442、0.360、0.180、9.00×10-2、4.50×10-2、2.30×10-2、1.10×10-2、5.60×10-3 g/L。在1.3.1节色谱条件下进样,记录色谱图;精密称取琥珀酸对照品37.54 mg,逐级稀释至质量浓度分别为0.751、0.15、3.00×10-2、6.01×10-3、4.80×10-4、1.90×10-4 g/L。在1.3.2节色谱条件下进样,记录色谱图。以样品质量浓度(C,g/L)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标,拟合回归方程并计算相关系数。结果见表 1,在HPIEC和HPIC条件下,琥珀酸的线性良好。

表1 HPIEC和HPIC的方法学验证结果 Table 1 Methodology validation results of HPIEC and HPIC
2.2.4 定量限及检出限

在HPIEC方法中,定义S/N=4.2时的质量浓度为检出限(LOD),S/N=9.9时的质量浓度为定量限(LOQ);在HPIC方法中定义S/N=4.6时的质量浓度为LOD,S/N=10.0时的质量浓度为LOQ;结果见表 1。

2.2.5 精密度、重复性和稳定性试验

分别取0.180、0.035 g/L琥珀酸对照品溶液,在1.3.1、1.3.2节色谱条件下连续进样6次,峰面积的RSD结果见表 1,表明HPIEC和HPIC方法的精密度良好。

取批号为1411001、1412001的样品,分别配制成含琥珀酸0.150、0.030 g/L的6份溶液,分别在1.3.1、1.3.2节色谱条件下检测,琥珀酸平均含量分别为28.8% 、28.6% ,RSD结果见表 1,表明两种方法的重复性良好。

取批号为1411002、1411001的样品,配制成含琥珀酸约0.150、0.030 g/L 的溶液,在室温下放置0、3、6、9、12、24 h后,分别在1.3.1、1.3.2节色谱条件下检测,琥珀酸平均含量分别为29.0% 、28.0% ,RSD见表 1,表明样品溶液在室温下24 h内稳定。

2.2.6 回收率试验

精密量取1.0 mL供试品(2 906.5 μ g/mL)(批号1412001)9份,分别置于25 mL的容量瓶中,加入精密量取的琥珀酸对照品(3 023.2 μ g/mL)约1.0、1.5、2.0 mL各3份,用流动相稀释至刻度,制成质量浓度约为0.24、0.30、0.36 g/L 的溶液,在1.3.1节色谱条件下分别进样,结果见表 2。精密量取1.0 mL的供试品(537.8 mg/L)(批号1412001)9份,分别置于25 mL的容量瓶中,加入精密量取的琥珀酸对照品(603.6 mg/L)约1.0、1.5、2.0 mL各3份,用水稀释至刻度,制成质量浓度约为0.024、0.030、0.036 g/L 的溶液,在1.3.2节色谱条件下分别进样，结果见表 2。

表2 HPIEC和HPIC测定DSV中琥珀酸的回收率和相对标准偏差 Table 2 Recoveries and RSDs of succinic acid in DSV by HPIEC and HPIC
2.2.7 方法的耐用性

取供试品(批号1412001)，在不同流速(±0.1 mL/min)、柱温(±5 ℃)、波长(±2 nm)等色谱条件下测定,主峰的理论塔板数均大于 10 000,主峰与相邻杂质峰的分离度均大于2,主成分平均含量为28.9% ,RSD为1.96%(n=6),表明HPIEC方法耐用性良好。取供试品(批号1412001)在不同流速(±0.2 mL/min)、柱温(±5 ℃)、CKOH(±2 mmol/L)等色谱条件下测定,各条件下主峰的理论塔板数均大于 10 000,主峰与相邻杂质峰的分离度均大于2,主成分平均含量为29.0% ,RSD为0.83%(n=6),表明HPIC方法耐用性良好

2.2.8 样品测定

取3批样品,按1.2节方法制备对照品溶液、供试品溶液。按1.3.1、1.3.2节条件进样测定,外标法计算含量,结果见表 3。

表3 DVS中琥珀酸的质量分数测定结果 Table 3 Mass percentage results of determination of succinic acid in DVS
3 结论

本文建立了分别采用离子抑制色谱和离子交换色谱检测DVS原料药中琥珀酸含量的方法。为盐型药物中弱酸型反离子的控制提供了两种可供选择的方法和手段。研究结果显示,两种不同原理的方法均能很好地进行琥珀酸定量分析,测定值没有显著差异。

两种方法环保、简便、准确度和精密度好、灵敏度能够满足去甲文法拉辛中反离子的检测要求。相比之下,离子抑制色谱法较低的柱压和简单的检测器使得普通的高效液相色谱仪即能满足该方法的需求,保证了方法的通用性;而离子交换色谱法采用的抑制性电导检测器显示了更高的灵敏度,在微量检测方面显示出优越性。

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