涕灭威是常用的氨基甲酸酯类农药,由于杀虫效果好,被广泛应用于蔬菜、棉花、花生、玉米等作物上^[1]。涕灭威的长期大量生产和使用,特别是其代谢物涕灭威亚砜和涕灭威砜的存在,造成了生态环境中土壤和水体的污染,对人类健康具有不容忽视的危害,因此引起了各国的广泛重视,并对蔬菜中该类药物的残留量做出小于0.01 mg/kg 的严格规定^[2]。2013年中央电视台“焦点访谈”节目报道的“毒生姜”事件、2015年的“毒西瓜”事件都是涕灭威用药不当引起的食品安全事件,所以氨基甲酸酯类农药残留的检测依旧是当前研究的热点。

近年来逐渐发展起来的氨基甲酸酯类农药残留检测的前处理方法有QuEChERS方法^[3]、凝胶渗透色谱法^[4]等;测定方法有液相色谱-柱后衍生法(LC)^[5]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)^[6]、液相色谱-飞行时间质谱法(LC-TOF-MS)^[7]。LC-MS/MS灵敏度和定量准确度更高^[8],所以本文采用LC-MS/MS测定白菜中涕灭威的残留。近年来,关于农药在土壤和蔬菜中残留的动力学模型和影响因素的研究越来越多^{[9, 10, 11, 12]},涕灭威在苹果、烟草和土壤中的降解研究也有报道^{[13, 14, 15]},但未见涕灭威在白菜中吸收和降解动力学行为的报道。白菜是北方人民冬天食用的主要蔬菜之一,所以白菜的食用安全非常重要。研究涕灭威在白菜中的残留动态对政府监管和指导农民合理用药具有重要意义,同时对于控制环境污染和人类食品安全也具有重要作用。

本文采用大田实验结合LC-MS/MS研究了涕灭威及其代谢产物涕灭威砜、涕灭威亚砜在白菜中的残留动态行为,总结了表征涕灭威及其降解产物在白菜中残留动态的数学模型、相关系数和半衰期等,为农药的安全使用和残留动态行为研究提供了理论依据。

农药:质量分数为5%的涕灭威颗粒剂(山东农药化工基团有限公司);涕灭威、涕灭威砜和涕灭威亚砜标准品均购于美国Sigma-Aldrich Laborchemikalien公司,纯度≥95% 。

乙腈(色谱纯,美国Fisher公司);乙酸乙酯(色谱纯,德国Merck公司);甲酸(色谱纯,美国Tedia公司);无水硫酸镁(分析纯,天津市光复精细化工研究所),用前在500 ℃马弗炉内烘5 h,马弗炉内自然降温至200 ℃时取出,置于干燥器中冷却备用;石墨炭黑粉、C18和氨丙基粉均购于Agela Technologies inc公司。

Agilent 6430液相色谱-串联质谱仪(美国Agilent公司),配有电喷雾离子(ESI)源;GM 200碾磨仪(德国RETSCH公司); AE 163电子天平(瑞士Mettler公司); T25均质器(德国IKA公司); Eppendorf 5810R离心机(德国Eppendorf公司); N-EVAP 111氮吹仪(美国Organomation公司); MS₃ basic涡流混匀器(德国IKA公司)。

液相色谱条件:色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C₁₈柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μ m);柱温40 ℃;进样量5 μ L;流动相A为0.15%(v/v)甲酸水溶液,B为乙腈。梯度洗脱程序:0～3.0 min,流动相B由20%线性变化到95% ,保持4 min;然后在0.1 min内由95%B线性下降到20%B,保持3.0 min,以平衡色谱柱。流速0.25 mL/min,运行时间10 min。

质谱条件:ESI+模式;检测方式为多反应监测(MRM);毛细管电压4 000 V;电喷雾电压 4 500 V;干燥气(N₂)流速10 L/min,温度300 ℃。其他参数见表 1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 3种农药的质谱分析参数 Table 1 MS parameters for the three pesticides Pesticide Transitions ( m/z) Dwell time/ms Fragmentor/V Collision energy/eV Aldicarb-sulfone(涕灭威砜) 223.2/148.2, 223.2/86.2 * 180 120 14, 10 Aldicarb(涕灭威) 213.1/116.1, 213.1/89.1 * 180 120 11, 16 Aldicarb-sulfoxide(涕灭威亚砜) 207.0/132.0, 207.0/89.0 * 180 120 14, 10 * Quantitative ion.

表1 3种农药的质谱分析参数 Table 1 MS parameters for the three pesticides

试验地点设在山东省潍坊市昌乐县,供试作物为秋季白菜。将实验基地划分为3个小区,每小区40 m²,区与区之间留有空地,用于平行实验。白菜开始卷心时(栽种后33天),取24 g 5%(质量分数)涕灭威颗粒剂(有效成分 3 000 g/hm²)与土混合,挖沟并均匀施入每个小区的土壤中,覆土盖沟,在用药后1、4、9、12、15、18、24、30、40、54、61、70、87天定期取白菜样品于冰箱中4 ℃冷藏保存,24 h内完成检测,验余样品继续于冰箱中4 ℃保存(本研究小组做过4 ℃下不同添加水平的样品的稳定性试验,证明该保存条件下涕灭威及其代谢产物均可稳定存在5天以上)。

把白菜样品切碎,再取出部分有代表性的样品,四分法缩分至不少于500 g试样,装入清洁容器内,加封后标明标记备用;准确称取30.00 g上述样品于100 mL离心管中,依次加入6 g无水硫酸镁、15 mL正己烷饱和的乙腈提取试剂,于高速均质器上充分均质,离心10 min(10 000 r/min);取上清液3 mL于预先装有50 mg石墨炭黑粉、200 mg C18和150 mg氨丙基粉的10 mL玻璃试管中,涡旋2 min后静置分层;取2 mL上清液于另一干净玻璃试管中,氮气吹干,用1 mL初始流动相(乙腈-水,1 ∶ 9,v/v)溶解,用一次性注射器吸取上述溶液,过0.2 μ m滤膜,上机检测。每个样品做平行检测样3个,取平均值。

准确称取10 mg(精确至0.01 mg)涕灭威砜、涕灭威亚砜、涕灭威标准品,分别置于100 mL的容量瓶中,用乙腈溶解,准确定容至100 mL,得100 mg/L 标准储备液,用乙腈稀释至1 mg/L 混合标准溶液。再用空白白菜样品提取液逐级稀释,配制0.005、0.02、0.04、0.08、0.14、0.2 mg/L 的基质匹配标准溶液,用于绘制标准工作曲线。

为了消除基质效应,按1.3.3节方法分别配制0.005、0.02、0.04、0.08、0.14、0.2 mg/L 基质匹配混合标准工作溶液,按1.2.2节色谱条件进行测定,以各定量离子的峰面积对质量浓度做标准曲线,得到线性方程及相关系数(r²),见表 2。结果显示:3种化合物在0.005～0.2 mg/L 范围内线性关系良好,r²均大于0.990。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 3种分析物的线性方程和相关系数 Table 2 Linear equations and correlation coefficients (r2) of the three analytes Pesticide Linear equation r 2 Aldicarb-sulfone(涕灭威砜) y=67419.84 x+291.21 0.995 Aldicarb(涕灭威) y=767312.10 x+3190.12 0.997 Aldicarb-sulfoxide(涕灭威亚砜) y=331692.64 x+1908.45 0.998 y: peak area. x: content, mg/kg.

表2 3种分析物的线性方程和相关系数 Table 2 Linear equations and correlation coefficients (r2) of the three analytes

在阴性白菜中分别添加3种化合物混合标准溶液,添加水平为0.005、0.01、0.05 mg/kg。按上述提取、净化和检测步骤,每个添加水平做8次平行试验,计算平均回收率和相对标准偏差,考察方法的准确度和精密度。结果表明,添加水平为0.005 mg/kg 时,S/N均大于或远大于10,故3种目标农药的定量限均低于0.005 mg/kg;在上述3个添加水平下,涕灭威、涕灭威砜和涕灭威亚砜的平均回收率为78.9% ～108.5% ,相对标准偏差为2.03% ～8.91% ,满足国际上对农药残留检测的要求。

施用于土壤中的涕灭威通过在土壤颗粒/土壤溶液间的吸附、分配而达到平衡,一部分农药吸附在土壤颗粒物上而使其可移动性、可降解性和生物可利用性大大降低,一部分农药进入土壤溶液可被植物吸收利用,同时也保持较高的可淋溶性和可降解性,所以白菜一方面从土壤中吸收涕灭威及其代谢产物,通过根系使其自身浓度不断增高,但同时在白菜植株体内通过自身代谢等多种途径使农药继续降解。参考土壤中涕灭威的降解途径^[16],推测白菜中涕灭威可能的降解途径如图 1所示。涕灭威在白菜植株内可能发生两种途径的降解,主要降解产物为涕灭威亚砜和涕灭威亚砜肟,次要降解产物为涕灭威砜和涕灭威砜肟,但涕灭威亚砜肟和涕灭威砜肟无毒,因此考虑白菜中涕灭威的危害时,主要考察涕灭威砜和涕灭威亚砜的残留。

图1

Fig. 1

图1 涕灭威的降解途径 Fig.1 Degradation pathway of aldicarb

白菜生长过程中,同时存在从土壤中吸收涕灭威及其代谢产物,以及吸收的涕灭威及其代谢物继续降解的过程,两种过程综合表现在白菜中,最终呈现3种农药残留的变化趋势。本文旨在研究食品安全领域的白菜合理施药和安全食用,因此直接研究3种农药在白菜体内的残留变化情况最具实际意义。

以施药至采样间隔期(简称“采样时间”,天)为横坐标,涕灭威在白菜中的残留量(mg/kg)为纵坐标作图,见图 2。白菜中涕灭威含量呈先增后减的趋势,采样后第18天时白菜中涕灭威残留量达到最大浓度;18天以后白菜中的涕灭威含量迅速降低,50天以后缓慢降低,在87天时涕灭威基本降解完全。

图2

Fig. 2

图2 白菜中涕灭威含量随采样时间的变化 Fig.2 Contents of aldicarb in cabbage at different sampling times

研究涕灭威在植物体中的残留动态学,对分析和预测不同时期蔬菜和土壤中的农药残留量,以及预测蔬菜水果的安全和土壤环境残留期具有重要的意义。农药在植物体中的残留动态受多种因素的影响,包括温度、光照、水分和初始浓度等^[17],各因素对残留动态的综合影响可用某种数学模型进行模拟。目前,可用于预测农药吸收和降解过程的数学模型很多^{[18, 19]},以c代表农药浓度,t为采样时间,如一级动力学方程(c=c₀e^-kt,k为农药含量变化速度常数,c₀为农药在t=0时的浓度,即初始浓度)、多项式回归(c=a₀+a₁t+a₂t²+……+a_mt^m,其中a₀……a_m为待定系数)、Rayleigh动态模型(c=at^de^bt2,其中a、d、b为待定系数)等^[19]。为更好地研究白菜中涕灭威的残留动态,本文选用以上3类数学模型来分别模拟其增长和减少的过程,以期找到最符合本实验中涕灭威残留动态特征的数学模型。

以采样时间为横坐标,涕灭威残留量为纵坐标,利用origin软件数据处理功能,分别用一级动力学模型、多项式回归分析和Rayleigh动态模型拟合18天之前的涕灭威增长动态行为和18天之后的残留量降低过程,寻找符合涕灭威残留动态的合理模型。拟合结果如表 3所示。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 白菜中涕灭威残留动态方程及相关系数 Table 3 Dynamic equations and correlation coefficients of aldicarb residue in cabbage Equation type Increase process Decrease process Equation r 2 Equation r 2 First-order kinetics c=0.020e 0.136 t 0.888 c=0.65e 0.059 t 0.979 Polynomial regression c=-0.015+0.008 t+2.702×10 -4 t 2+2.303×10 -6 t 3 0.876 c=0.493-0.202 t-1.281×10 -6 t 3 0.958 Rayleigh dynamic model c=0.005 t 1.484e 0.002 t 2 0.860 c=150.95 t -2.13e-8.62 t 2 0.948

表3 白菜中涕灭威残留动态方程及相关系数 Table 3 Dynamic equations and correlation coefficients of aldicarb residue in cabbage

由表 3可知,本实验条件下涕灭威在白菜中的残留变化过程更符合一级动力学模型,增长和降低过程的相关系数分别为0.888和0.979。按照该模型计算的涕灭威半衰期(浓度降低到最高浓度的一半所用时间)为施药后的第29.1天,若下降到国内外限量要求的0.01 mg/kg^[2]则需要70.7天。

涕灭威在白菜中的残留动态行为受到多种因素的影响,所以数学模型只能粗略估计涕灭威在白菜中的动态行为,但该模型对于预测不同时期白菜植株中的农药残留量具有重要意义。

涕灭威极不稳定,极易转化为涕灭威砜和涕灭威亚砜及其氧化物,但只有涕灭威砜和涕灭威亚砜具有较大毒性。为更好地保障白菜食用安全,考察白菜中涕灭威砜和涕灭威亚砜的残留非常必要。本实验研究了白菜中涕灭威砜和涕灭威亚砜的残留量随时间的变化,以施药后采样时间为横坐标,白菜中涕灭威砜和涕灭威亚砜残留量为纵坐标作图。如图 3所示,白菜中涕灭威砜和涕灭威亚砜的残留量呈现先增长后降低的趋势,在涕灭威含量最高的18天时其降解产物涕灭威砜和涕灭威亚砜的含量并未达到最高,而在30天时二者残留量达到了最高值,这主要是因为涕灭威代谢物不仅来源于涕灭威在白菜植株中的降解产物,白菜植株也吸收土壤中的涕灭威代谢产物。

图3

Fig. 3

图3 白菜中涕灭威砜、涕灭威亚砜含量随采样时间的变化 Fig.3 Contents of aldicarb-sulfone and aldicarb- sulfoxide in cabbage at different sampling times

通过origin软件对白菜施药30天后涕灭威砜和涕灭威亚砜残留量降低的过程进行3种数学模型拟合,结果显示两种化合物的减少趋势更符合一级动力学方程,其方程式和相关系数及半衰期如表 4所示。按表 4中方程计算,若涕灭威砜和涕灭威亚砜降到国内外限量要求0.01 mg/kg^[2],分别需要226.6和176.3天。白菜收获时(即距施药时间87天),虽然涕灭威的含量已符合限量要求,但毒性较大的涕灭威砜和涕灭威亚砜的含量仍较高,所以在农民常用施药量(3 000 g/hm²)下,不宜在生长周期短于120天的白菜中使用涕灭威。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 涕灭威砜和涕灭威亚砜降低过程中的拟合方程、相关系数和半衰期 Table 4 Fitting equations, correlation coefficients and half-lives for the decrease of aldicarb-sulfone and aldicarb-sulfoxide Compound Fitting equation r 2 half-life/d Aldicarb-sulfone(涕灭威亚砜) c=23.4e -0.044 t 0.972 44.9 Aldicarb-sulfoxide(涕灭威砜) c=4.54e -0.027 t 0.916 53.6

表4 涕灭威砜和涕灭威亚砜降低过程中的拟合方程、相关系数和半衰期 Table 4 Fitting equations, correlation coefficients and half-lives for the decrease of aldicarb-sulfone and aldicarb-sulfoxide

本研究建立了白菜中涕灭威、涕灭威砜和涕灭威亚砜残留检测的高效液相色谱-串联质谱法,方法的准确度和精密度均能满足农药残留分析要求。采用该方法研究了涕灭威、涕灭威砜和涕灭威亚砜在白菜体内的残留动态行为,并模拟了其动力学方程,该方程能很好地推测出不同时间3种农药在白菜中的残留,为农民合理施药和白菜安全食用提供了理论依据。