自Giddings在1966年提出场流分离系统(field-flow fractionation,FFF)这一类似色谱分离的分析方法后^[1],FFF即应用于生物大分子的分离,可分离几纳米到几百微米的多种高分子及颗粒^[2]。目前常用的大分子分离手段(如高效液相色谱及电泳技术等)存在样品前处理复杂、分离时间长、无法分离高分子颗粒等缺点^{[3, 4]}。FFF虽然不及色谱和电泳应用广泛,但有其独特优势。在FFF中,施加在分离通道的外场作用于样品,根据样品的物理特性(如密度、粒径大小、质量等)差异实现分离,同时也可完成对物理特性参数的测定^[5]。根据外加场类型的不同,FFF可以分为流场流分离、沉降场流分离、电场流分离、热场流分离等,其中沉降场流分离又可以分为重力场流分离(gravitational field-flow fractionation,GrFFF)和离心力场流分离^[6]。

本文研究的GrFFF利用重力场作为外加场,是最简单的FFF技术^[7]。GrFFF可用于分离粒径在几微米到几百微米的颗粒,目前已应用于微米级颗粒(包括煤炭颗粒、硅胶颗粒、黏土颗粒、淀粉颗粒、酵母以及花粉等)的分离^[5],因其温和性还用于分离细胞及细菌等。但GrFFF的理论还不完善,而且由于重力场难以控制与改变,所以GrFFF仍然处于实验阶段。

GrFFF仪器目前并未大规模商品化,国外大部分研究人员多采用自行组装的仪器进行研究。本课题组自行设计、加工、组装了一套GrFFF系统。研究初期,先对仪器各项性能指标进行了验证。根据文献[5, 8, 9, 10, 11]得知,聚苯乙烯(PS)颗粒的分离较为简单,经常作为标准物质进行基础实验,故本文选用PS颗粒作为初期实验的样品以研究对GrFFF的影响因素。影响GrFFF系统分离效果的因素包括载液黏度^{[5, 9]}、通道角度^{[5, 8]}、流速^{[8, 9]}、离子强度^[9]、密度^[10]、载液中十二烷基硫酸钠(SDS)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的比例^[11]、通道形状^[12]、重力场强度^[13]等。另外，文献[5, 8, 9, 10, 11]载液中使用的表面活性剂为FL-70,但国内无法买到,仅知道FL-70为阴离子表面活性剂与非离子表面活性剂的混合物。本文首次对表面活性剂的组成进行了探讨,通过实验寻找可以替代FL-70的表面活性剂以助于国内的相关研究。本研究选择改变载液组成、流速等实验条件,每个因素都设定6个变化值,探讨其对分离效果的影响,为GrFFF仪器的应用及实验参数的选取提供了重要的参考价值。

实验仪器为本课题组自行设计和加工组装的重力场流分离系统(见图 1)。重力场流分离仪器主要有4个组成部分:进样阀,注射泵A、B,分离通道及紫外检测器。注射泵及进样阀通过聚醚醚酮(PEEK)管与分离通道上的进样口与进液口连接,载液及样品同样通过PEEK管进入检测器。分离通道为聚四氟乙烯材料中切削出的“剑形”槽,厚度为0.3 mm,夹在有机玻璃中间固定,其长为282.9 mm,宽为21.5 mm。具体操作为用进样针将样品从进样阀注射进通道,启动洗脱程序,注射泵将载液泵入分离通道,样品在分离通道中分离,随后依次进入检测器,检测得到信号。分离原理为:样品进入扁平的带状通道后,关闭泵,样品在通道中停留一段时间并在重力的作用下逐渐分离;恢复泵流速,载液进入分离通道,其速度剖面呈抛物线或近似抛物线形状,通道中心的流速较快,两侧的流速较慢;不同粒径的颗粒在分离通道内的所处位置不同,对应的流速也不同,从而达到分离。分离原理见图 2。

图1

Fig. 1

图1 重力场流分离(GrFFF)仪器示意图 Fig.1 Schematic view of the gravitational field-flow fractionation (GrFFF) instrument

图2

Fig. 2

图2 GrFFF分离不同粒径颗粒(A和B)的原理图 Fig.2 Schematic view of GrFFF separation principle for particles with different sizes (A and B)

L600-DP单塞泵、L600-UV紫外检测器、LC Win-2.0工作站(北京普析通用有限公司); 7725i进样阀(美国Rheodyne公司); HANGPING FA2104天平(上海恒平电子公司)。

聚苯乙烯乳胶微球水分散液(2.5%(质量分数),粒径分别为20、6 μ m,Alfa Aesar(中国)公司);吐温-80、SDS均为化学纯(天津市永大化学试剂有限公司);叠氮化钠(NaN₃,分析纯,北京化工厂);实验用水为超纯水(18.2 M Ω \5cm)。

分别精密量取50 μ L 20 μ m和6 μ m的聚苯乙烯乳胶微球水分散液加入到1 mL离心管中,用超纯水稀释到1 mL,得到混合溶液。

在GrFFF理论^[9]中,

根据文献[15],颗粒在通道中的平衡位置可以表示为:

塔板高度可以用来衡量谱带增宽,影响因素包括:非平衡效应(H_n);仪器影响(H_i);样品多分散性(H_p)以及颗粒的分散度(H_D)^[9]。因此:

在GrFFF中,不同粒径颗粒的H_n和H_i是相似的。如果所有H_p保持一致,那么H主要由H_D决定^[16]。分散度随着粒径的减小而增加,因此H也应该随着粒径的减小而增加。

根据文献[5]提供的实验条件,将初始停留时间设置为3 min,流速设置为0.5 mL/min;再根据自制仪器的具体参数将注射时间设置为1.6 min,注射流速设置为0.05 mL/min;在上述条件下对样品进行洗脱。

在载液中NaN₃为0.2 g/L、SDS为1 g/L的条件下,分别进样20 μ L粒径为6 μ m、20 μ m的聚苯乙烯乳胶微球水分散液及其混合溶液,GrFFF谱图如图 3所示。

图3

Fig. 3

图3 两种粒径的PS颗粒及其混合液的GrFFF谱图 Fig.3 GrFFF chromatograms of the two PS particles with different sizes and their mixed liquid

根据场流分离原理并与单独进样的谱图比较可得,峰1和峰2分别为20 μ m和6 μ m PS颗粒的色谱峰。图 3c表明通过重力场流分离可以基本实现不同粒径颗粒的分离。由于标准样品是聚苯乙烯颗粒的悬浮液,不能保证颗粒的均匀分散,且紫外检测器并不适合对聚苯乙烯颗粒的定量检测,所以色谱图中的峰面积并不能代表每种聚苯乙烯颗粒的浓度,初期可以先进行定性研究。

在样品停留时间为3 min、载液流速为0.5 mL/min 条件下,改变载液中NaN₃的质量浓度对样品进行分离。载液由1 g/L SDS及质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L 的NaN₃水溶液组成。色谱图如图 4所示。

图4

Fig. 4

图4 载液中NaN3的浓度对GrFFF的影响 Fig.4 Effect of NaN3 concentration in the carrier liquids on the GrFFF

由图 4可以看出,在NaN₃浓度低时,随着NaN₃浓度的增加,分离效果逐渐变好,并在NaN₃为0.4 g/L 时接近基线分离。但当NaN₃的质量浓度增加到0.6 g/L 时,谱图中出现了第3个峰,并且第3个峰的峰面积随着NaN₃浓度的增加而增加,出峰时间晚于PS颗粒。出现这种现象的可能原因为当NaN₃浓度较大时,NaN₃本身或NaN₃与表面活性剂发生反应，其反应产物产生了一定的紫外吸收峰。由于NaN₃浓度较大时会产生3个峰,干扰PS颗粒的分离结果,故本实验采用的载液中NaN₃的质量浓度不高于0.4 g/L。NaN₃为0.1、0.2、0.4 g/L 时色谱图的相关数据如表 1所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 载液中不同浓度的NaN3对PS颗粒的保留比(R) 及塔板高度(H)的影响 Table 1 Effect of NaN3 concentration in carrier liquids on the retention ratios (R) and plate heights (H) of the PS particles Carrier liquid Diameter of PS particles/μm R H/mm Water+1 g/L SDS+0.1 g/L NaN 3 20 0.8941 0.218 6 0.6924 1.730 Water+1 g/L SDS+0.2 g/L NaN 3 20 0.9556 0.951 6 0.8818 3.442 Water+1 g/L SDS+0.4 g/L NaN 3 20 0.9883 1.016 6 0.9146 5.986

表1 载液中不同浓度的NaN3对PS颗粒的保留比(R) 及塔板高度(H)的影响 Table 1 Effect of NaN3 concentration in carrier liquids on the retention ratios (R) and plate heights (H) of the PS particles

从表 1可看出,同一载液条件下,6 μ m PS颗粒的R值小于20 μ m PS颗粒的R值,H值大于20 μ m颗粒的H值,均符合GrFFF理论;且不论PS颗粒粒径大小，其R值与H值均随着NaN₃浓度的增加而增加。这是因为NaN₃浓度的增加导致静电排斥力增加,影响了PS颗粒的保留行为。

文献[5]使用的载液为含有1 g/L FL-70及0.2 g/L NaN₃的水溶液。本实验尝试使用常用的阴离子表面活性剂SDS与非离子表面活性剂吐温-80代替FL-70。改变混合表面活性剂中两种表面活性剂的比例,考察其对分离效果的影响。

在停留时间为3 min、流速为0.5 mL/min、载液中NaN₃的质量浓度为0.1 g/L、表面活性剂总质量浓度为1 g/L条件下,考察混合表面活性剂中SDS的比例分别为0、20% 、40% 、60% 、80% 、100%对分离的影响。色谱图如图 5所示。

图5

Fig. 5

图5 混合表面活性剂中SDS的比例对GrFFF的影响 Fig.5 Effect of SDS proportion in the mixed surfactant on the GrFFF GrFFF conditions: retention time, 3 min; flow rate, 0.5 mL/min; mass concentration of NaN3 in the carrier liquid, 0.1 g/L; total mass concentration of the mixed surfactant of TWEEN-80 and SDS, 1 g/L.

从图 5可看出,在SDS比例为20% 、40% 、60%时有较为明显的负峰,且随着SDS比例的增加负峰峰面积也随之增加,但在SDS比例为60%时能看到微弱的6 μ m PS颗粒的色谱峰。而SDS比例为80%和0时的分离效果均优于比例为100%的分离效果。由于SDS比例为20% ～60%时会有负峰产生,干扰聚苯乙烯颗粒的分离效果,故在实验中不使用SDS的比例为20% ～60%的混合表面活性剂进行分离。采用SDS比例为0、80% 、100%的混合表面活性剂进行分离的色谱图的相关数据如表 2所示。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 混合表面活性剂中SDS的比例对PS颗粒保留比及塔板高度的影响 Table 2 Effect of SDS proportion in the mixed surfactant on R and H of PS particles Carrier liquid Diameter of PS particles/μm R H/mm Water+0.2 g/L NaN 3+1 g/L SDS 20 0.9556 0.951 6 0.8818 3.442 Water+0.2 g/L NaN 3+0.8 g/L SDS 20 0.9912 1.262 +0.2 g/L TWEEN-80 6 0.8226 7.672 NaN 3+1 g/L TWEEN-80 20 0.9852 6.595 6 0.9146 9.816 The mixed surfactant: SDS+TWEEN-80; the total mass concentration, 1 g/L.

表2 混合表面活性剂中SDS的比例对PS颗粒保留比及塔板高度的影响 Table 2 Effect of SDS proportion in the mixed surfactant on R and H of PS particles

从表 2可以看出,6 μ m颗粒的R值小于20 μ m颗粒的R值,H值大于20 μ m颗粒的H值,均符合GrFFF理论。但R值与H值随SDS比例的变化而变化的趋势无法解释,还需继续探究。

配制含有1 g/L SDS及0.2 g/L NaN₃的载液,在停留时间为3 min、流速分别为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min 下对样品进行分离。色谱图如图 6所示。

图6

Fig. 6

图6 载液流速对GrFFF的影响 Fig.6 Effect of flow rates of the carrier liquid on the GrFFF

由图 6可看出,流速较快时,两种粒径的颗粒峰并不能分开,随着流速的减慢,两种粒径的颗粒峰渐渐分离,在流速为0.5 mL/min 时,两种颗粒基本能达到基线分离。不同流速得到的R值与H值如图 7所示。

图7

Fig. 7

图7 载液流速对PS颗粒的(a)保留比及(b)塔板高度的影响 Fig.7 Effect of flow rate on (a) retention ratios and (b) plate heights of the PS particles

从图 7可看出,相同流速下,6 μ m颗粒的R值小于20 μ m颗粒的R值,H值大于20 μ m颗粒的H值;随着流速的增加R值上升,符合GrFFF理论。H值随着流速的增加而降低,可能是由于流速的增加使得颗粒的分散度降低,从而使H值降低。

利用自行设计、加工、组装的重力场流分离仪器成功分离了两种粒径不同的聚苯乙烯颗粒。考察了载液中NaN₃的浓度和流速对分离效果的影响,并 首次探讨了不同组成的表面活性剂对分离效果的影 响,得到的结果均符合GrFFF理论。通过对实验条件的调整可以基本实现对两种不同粒径PS颗粒的基线分离。但仍需要对其他多种因素进行考察,并尝试寻找最优实验条件,同时对其他样品进行分离,以便将该方法应用到更多的领域。