随着化学工业的发展,化学品的产量大幅度增加,新化学品在生活中不断涌现。人们在充分利用化学品的同时,也产生了大量的废物,其中大部分都是有毒有害物质,给人体健康和环境带来了严重危害和潜在威胁。目前对于环境污染物的分析,较为成熟的研究工作主要集中在针对某种或某一类污染物进行靶标分析方法的建立[1,2,3],这就意味着还有大量的污染物没有得到有效的监测和监管,所以建立一套非靶标筛查方法对污染情况进行全面分析研究是十分必要的。非靶标筛查是指不使用标准品,在对分析物不进行预选择的前提下对样品所含污染物进行总筛查的一种方法[4]。Hernandez等[5]研究表明其具有节约成本、筛查快速的特点，是污染物全分析中必不可少的一种方法[6,7]。环境样品通常组成复杂、基质干扰严重,以沉积物、污泥等复杂样品基质为对象,建立有效的非靶标筛查方法,对全面客观地呈现环境污染综合信息方法学的建立具有重要意义。
由于沉积物和污泥样品基质非常复杂,故将有机污染物从样品中分离富集出来成为决定分析结果可靠性的重要前提。目前,国内外对于沉积物和污泥样品的提取方法主要有液固萃取法(LSE)、索氏提取法(SOX)[8]、加速溶剂萃取法(ASE)[9]和超声波辅助提取法(USE)[10]等。液固萃取法设备简单,但溶剂消耗量非常大且自动化程度低。索氏提取法易于操作,但是提取时间长,溶剂消耗大。加速溶剂萃取法所需溶剂量小,萃取效率高[11],但是仪器和技术成本较高。超声波辅助提取是利用超声波具有空化效应、机械效应和热效应,通过增大介质分子的运动速度和穿透力,使溶剂分子快速进入固体中,将其所含的有机成分尽可能完全地溶于溶剂之中,得到多成分混合提取液[12,13];它具有提取效率高、提取时间短和节约溶剂等优点,且成本较低,适合应用于复杂基质样品分析[10]。气相色谱-质谱法(GC-MS)具有选择性和灵敏度高、精密度好的优点,广泛用于环境样品中有机污染物的鉴别和定量分析[14]。
在非靶标筛查中,最常使用的质谱扫描方式为全扫描模式,理论上对于单次进样中可检测的污染物数量不受限制,但长期以来,全扫描模式因为灵敏度低及基质效应和共流出杂质导致待测物谱图匹配度差的问题,阻碍其推广和使用[15]。因此获得每一种污染物“纯净”的质谱图成为非靶标筛查的关键[16]。美国国家标准技术研究院(NIST)开发的自动质谱解卷积鉴定系统(automated mass spectral deconvolution & identification system,AMDIS)能够采集每个离子的质量色谱图,并将所有保留值和形状相同的质量色谱峰的离子组合成一张质谱图。运用每一个成分的“纯净”质谱图和相关色谱信息来确定该成分是否能被认定为标准谱库中的一个有机物。AMDIS在提高全扫描模式的选择性及定性结果的准确性上表现出强大功能[17,18],因此被广泛用于环境污染物、中毒毒物和药物及其代谢产物等分析研究领域。
本文建立了一种超声波辅助提取结合GC-MS检测,利用AMDIS解卷积软件和标准谱库对非极性和弱极性有机污染物进行非靶标筛查的方法。实验优化了前处理条件,利用解卷积软件“提纯”目标物质谱图,解决了全扫描模式灵敏度低和谱图匹配干扰大的问题,并结合AMDIS自带的9个谱库和NIST谱库,成功应用于7个沉积物样品和5个污泥样品的非靶标筛查。该方法的建立使得在复杂基质样品中污染物广谱非靶标筛查成为可能。
Trace Ultra DSQ II气相色谱-质谱联用仪(美国Thermo Scientific公司); B5200S超声仪(美国BRANSON公司);凝胶渗透色谱仪(GPC)(美国VARIAN公司),配P230高压恒流泵、BT3030紫外检测器(大连依利特分析仪器有限公司); DH12H氮吹仪(12位,上海ANPEL公司); B-491旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司); Genesis Pilot Lyophilizers中试型冻干机(美国VIRTIS公司);水平振荡器(德国IKA公司)。标准质谱数据库:The NIST Mass Spectral Search Program for the NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library (Version 2.0d,build Apr 26,2005),AMDIS软件自带Grobx、NISTCW、NISTDRUG、NISTEPA、NISTFDA、NISTFF、NISTTOX、PESTPLUS及ALKANES谱库。
二氯甲烷(美国J. T. Baker公司);正己烷(美国Honeywell公司);硅胶(粒径为63～100 μ m,国药集团);无水硫酸钠、铜粉(天津市大茂试剂有限公司);Milli-Q超纯水(Millipore公司纯水系统制备)。
对大连西山水库的沉积物和某污水处理厂的污泥进行了采集。沉积物样品的采集和保存按照国家标准方法GB 17378.3-2007《海洋监测规范 第3部分:样品采集、贮存与运输》进行,大连西山水库选取7个采样点(S1～S7),污水处理厂选取5个采样点(1200～1204)。每个采样点采集双样后置于双层聚乙烯袋中,一份用作检测,一份作备份样品。所有样品采集后均用铝箔纸包覆,立即避光保存运回实验室,放入冷冻干燥机中冻干48 h后待用。
称取2.0 g冻干样品于50 mL玻璃管中,加入15 mL二氯甲烷,玻璃管置于冰浴装置恒温超声20 min,静置取上清萃取液;重复3次萃取,合并所有萃取液。萃取样品的同时以不加样品的溶剂做空白实验,所有样品和空白均进行平行双样实验。将萃取液在30 ℃下旋转蒸发至3 mL,随后过滤膜并通过GPC净化,收集21～50 min的流出组分;将收集的流出组分在30 ℃下旋转蒸发至1 mL左右,再上样于无水硫酸钠和硅胶填装的层析柱(由下而上依次装填3 g无水硫酸钠、10 g硅胶、5 g无水硫酸钠),用60 mL正己烷-二氯甲烷(1 ∶ 1,v/v)混合溶液淋洗,收集流出液,经旋转蒸发浓缩至10 mL左右;加入3 g铜粉并超声10 min,取上清液,氮吹浓缩至近干,用1.0 mL正己烷溶解并定容,经0.22 μ m有机滤膜过滤,待分析。
色谱柱:J&K DB-5 ms柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m);载气:氦气;柱流速:1.1 mL/min;不分流进样,进样量:1 μ L;进样口温度:260 ℃;色谱柱升温程序:起始温度45 ℃,保持2 min,以10 ℃/min 升温至120 ℃,然后以3 ℃/min 升温至186 ℃,再以5 ℃/min 升温至250 ℃,保持10 min。质谱电离源:电子轰击离子(EI)源,温度:230 ℃;传输线温度:280 ℃;采用全扫描分析模式;扫描开始时间:5 min;扫描范围:m/z 35～600。
最小匹配因子设为70(最高为100);检出信号阈值选为Low;质荷比范围选为Auto;组分峰宽设为12;相邻峰减除选为Tow;解卷积分辨率选为High;解卷积灵敏度选为Very High;峰形要求选为Medium。
本实验选取液固萃取、索氏提取和超声波辅助提取3种分离提取方法进行对比,选取两种样品中各10个较有代表性的保留时间下的峰面积作为参考标准,如图1所示。索氏提取和超声波辅助提取的提取效果要好于液固萃取。超声波辅助提取在多数保留时间处的峰面积要高于索氏提取,这主要是由于超声波辐射增加了溶剂的穿透力,促进提取的进行,效果最佳。索氏提取的提取效果虽然与超声波辅助提取基本相当,但是每个样品要提取24 h以上,而且消耗溶剂量很大,因此选择的提取方式为超声波辅助提取。
每次以15 mL二氯甲烷作为溶剂提取2 g沉积物样品,分别超声提取2、3、4次,每次15 min,然后进行相同的除杂质处理,GC-MS分析结果如图2所示。通过对比可知,超声提取3次和4次的提取效果远高于超声提取2次;而超声提取3次和4次相 比,同一保留时间内峰面积相差不大。为了节省提取时间和溶剂消耗,故选择超声提取次数为3次。
以15 mL二氯甲烷作为溶剂分别超声提取2 g沉积物样品10、15和20 min,每个样品提取3次,GC-MS分析结果如图3所示。通过对比可知,同一保留时间下超声提取20 min的峰面积最大,即提取效果最佳。再增加超声提取时间会产生大量的热,冰浴装置也起不到良好的降温效果,同时也可能促进部分化合物转化成其他物质,故选择每次的提取时间为20 min。
沉积物和污泥中含有大量无机硫和有机硫化合物,这些物质常常与目标化合物成为共提物,严重影响GC-MS的分析。美国环境保护署(EPA)的方法中推荐了3种除去硫干扰的除硫剂,分别为铜粉、汞和四丁基铵-亚硫酸盐。汞有剧毒,对操作人员身体有危害。四丁基铵-亚硫酸盐需要使用正己烷萃取除杂后才能使用,且需严格控制实验条件,方法比较繁琐。而铜粉简单易得,除硫操作简单,故本实验选择用铜粉除硫。
实验对比了两种情况下加入铜粉对除硫效果的影响。一种情况：将2支玻璃管中分别加入3 g和5 g铜粉,再加入2 g沉积物样品,超声波辅助提取并经GPC和硅胶柱净化后经GC-MS测定,发现除硫效果并不显著。另一种情况：分别在4支试管中加入2 g沉积物样品,经超声波辅助提取及GPC和硅胶柱净化后,浓缩溶液至10 mL左右；将4支试管分为两组,每组试管的铜粉加入量分别为3 g和5 g,两组试管分别采用水平振荡器振荡1 h和超声10 min来辅助除硫,通过正交分析以确定最佳的除硫方法。GC-MS测定结果表明,振荡除硫效果很差,而加入铜粉3 g超声10 min则可以达到很好的除硫效果,同时该方法也最节省试剂和时间,不影响空白实验结果,故选此方法除硫。
取等质量的5份污泥样品做5次平行试验,选取谱图中24个较有代表性的保留时间下的峰面积计算相对标准偏差(RSD)。沉积物样品也做相同处理和计算。结果表明,前处理方法的相对标准偏差(n=5)为5.8% ～14.9% ,说明前处理方法具有良好的重复性。
由于污泥和沉积物样品中所含有机物非常复杂,会出现基质和共流出杂质干扰甚至掩盖待测物导致匹配变差的问题。AMDIS解卷积软件可以帮助鉴别一些因色谱峰相互交叠甚至被掩盖而无法被指认的有机物,特别是对于一些复杂基质样品解卷积效果尤为显著。
本实验将解卷积技术应用于沉积物和污泥样品中。图4a为7号沉积物样品的总离子流图,以保留时间为25.273 min的有机物为例,由图4a可以看出共流出物干扰和基质干扰非常严重。即便是采用提取质谱图(见图4b),所含的干扰离子仍然很多,难以进行谱库检索和准确筛查。但经解卷积后,获得了此保留时间下“纯净”的质谱图(见图4c),再与标准谱库的质谱图(见图4d)对比,匹配度达89,与未经解卷积的质谱图相比，匹配度显著提高,据此鉴定该有机物为肉豆蔻酸甲酯。
实验得到的色谱图经过AMDIS解卷积,结合NISTDRUG、NISTEPA、NISTFDA和Mass Spectral Library等标准谱库检索,对样品中所含的有机污染物进行识别。沉积物和污泥中分别检出190种和153种有机污染物,其中沉积物中主要污染物类型为烷烃(43.16% )、多环芳烃及其取代物(10.53% )和苯系物(10.00% ),污泥中主要污染物类型为烷烃(50.33% )、脂类(12.42% )和烯烃(10.46% )。两种基质中有机污染物分布情况如表1所示,经对比可知,沉积物中多环芳烃和苯系物的种类要远高于污泥。检出的化合物中,值得重点关注的有机污染物包括优先控制污染物、新型有机污染物以及化工产品等,其相关信息列于表2。
在EPA颁布的水环境中129种优先控制污染物中有10种被检测出来,包括作为溶剂使用的甲苯、乙苯和1,1,2,2-四氯乙烷,染料和医药领域中常用的三氯甲烷,用于汽油添加剂的N-二甲基亚硝胺,以及萘等5种多环芳烃。
药物及个人护理品(PPCPs)作为一大类新型污染物共有10种被检测出来。其中,巴比妥是常用的镇静药物,对中枢神经、循环和呼吸系统有抑制作用,长期使用易产生药物积累;异丙安替比林是常用的止痛类药物,主要用于头痛、神经痛和牙痛等疾病的治疗。二者均为安痛定注射液的主要成分,其滥用会导致医疗事故的发生[19]。马来酰肼,又名青鲜素或抑芽丹,是一种暂时性植物生长调节剂和选择性除草剂[20],在农作物中残留后通过食物链对人体造成一定程度的危害,国际食品法典委员会(CAC)、欧盟及美国等都对其残留量加以限定[21]。
另外,本研究还检出包括抗氧化剂、中间体、溶剂和化工原料等多种污染物，这些物质在水环境中残留现象普遍存在,也会对环境和人类健康造成潜在的危害。如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)在所有污泥样品和一个沉积物样品中检出,是一种通用型酚类抗氧剂和稳定剂,广泛用于动植物油、肥皂和食品加工工业中,其代谢产物对人体有致癌威胁[16]。Hernandez等[16]和Gomez等[22]在其污染物非靶标筛查研究中均检出此物质。苯、甲苯、乙苯和二甲苯(简称BTEX)是石油的重要组分,也是环境中需要重点监测的致癌污染物[23],本实验检测出甲苯、乙苯和对二甲苯3种物质。
本文解决了环境样品基质复杂、非靶标筛查难以进行的难题,构建了一种超声波辅助提取结合GC-MS检测,利用AMDIS解卷积软件和标准谱库对非极性和弱极性的有机污染物进行非靶标筛查的方法。本方法具有筛查快速、重现性好的优势,节约了检测成本,可应用于复杂基质样品的非靶标筛查。
然而,从污染物非靶标筛查的全面性来讲,本方法依然存在一些局限性:首先,本研究工作虽然提出了环境中有机污染物非靶标筛查的方法,但是对于筛查出的污染物的进一步确认仍需要更多的工作加以支持。其次,从非靶标筛查的全面性来讲,对于极性污染物需要使用液相色谱-质谱进行检测;而部分强挥发性污染物在冷冻干燥环节有损失,需要使用顶空-气相色谱-质谱进行分析。因此,接下来的工作我们将围绕这两个方面展开,以建立更加全面的环境中有机污染物综合非靶标筛查方法。
2015, Vol. 33 Issue (12): 1294-1300
PDF (1424 KB)
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