银杏叶提取物为银杏科植物银杏的干燥叶经加工制成的提取物,其主要成分包括黄酮类、萜类内酯和有机酸等。其制剂银杏叶片、银杏叶胶囊临床广泛用于冠状动脉性心脏病、心绞痛、高脂血症等疾病的治疗^[1]。

银杏酸是银杏叶提取物中主要的毒性物质,具有致敏性、胚胎毒性、细胞毒性及免疫毒性^[2],应当在提取生产工艺中有效去除。银杏酸是6-烷基或6-烯基水杨酸的衍生物,主要包括银杏酸C13 :0(白果新酸)、C15 :0、C15 :1、C17 :1、C17 :2,化学结构见图 1,其中C13 :0、C15 :1、C17 :1占总银杏酸的94%以上^[3]。《中国药典》2010年版^[4]规定银杏叶提取物中总银杏酸含量不得过百万分之十,《欧洲药典》8.0版^[5]及《美国药典》38版^[6]均规定银杏叶提取物中总银杏酸含量不得超过百万分之五,故应严格控制。《美国药典》以C13 :0、C15 :1、C17 :1 3种银杏酸含量之和作为总银杏酸含量。因此,本研究测定银杏酸C13 :0、C15 :1、C17 :1的含量,以表征银杏酸总量。

图1

Fig.1

图1 银杏酸的化学结构 Fig.1 Chemical structures of ginkgolic acids

现有方法^{[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]}多采用高效液相色谱法(HPLC)测定银杏叶提取物中银杏酸的含量。《中国药典》2010年版及文献^{[3, 7]}根据银杏酸的弱极性,采用石油醚提取,浓缩后再定容。该方法操作繁琐,且提取时样品极易被包裹结块,导致提取不完全,使测定结果严重偏低^[8]。《中国药典》2015年版^[9]、《欧洲药典》8.0版^[5]和《美国药典》38版^[6]均采用甲醇提取,取样量为2 g(检测波长310 nm，中国药典)或0.5 g(检测波长210 nm，欧美药典),提取溶剂体积均为10 mL,进样体积为50 μ L或100 μ L。

以上HPLC由于灵敏度的局限性,仅适用于提取物的测定。若应用于制剂中,需进一步增大取样量或采取大量溶剂提取后再浓缩富集的方法进行前处理,可操作性不强。文献报道的制剂中HPLC测定方法均存在一定不足。李兰崇等^[10]采用正己烷提取、薄层色谱纯化、HPLC检测的方法检测银杏叶制剂中银杏酸的含量,同样存在上述操作繁琐,提取不完全的问题。张志勇等^[11]取相当于提取物2 g的制剂,以大量溶剂提取后,浓缩复溶,HPLC测定,但其定量限以银杏酸C13 :0计为0.938 mg/L,以提取物计约相当于百万分之二,折算至总银杏酸则不能满足百万分之五的限量检查要求。

除HPLC外,Yao等^[12]曾建立LC-MS/MS法测定银杏叶中24种成分的含量(常量测定),但其中仅包括银杏酸C13 :0和C15 :1,且未考察银杏叶提取物及其制剂(痕量测定)。甲基衍生化-GC法^[13]也曾被报道用于测定银杏叶中银杏酸的含量,但同样不适用于提取物及制剂中银杏酸的痕量测定。

因此,必须采用灵敏度较高的检测手段建立测定银杏叶提取物及其制剂中银杏酸含量的方法。本研究曾根据银杏酸的荧光特征^[14],尝试荧光检测器,但灵敏度仍然不能满足制剂检查的需要。故以三重四极杆质谱为检测手段,建立银杏叶提取物及其制剂中银杏酸含量的测定方法,方可满足百万分之五的限量检查要求。

Agilent 1290超高效液相色谱仪;Agilent 6495三重四极杆质谱;Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(50 mm×3.0 mm,2.7 μ m);银杏酸C13 :0对照品、银杏酸C15 :1对照品(中国食品药品检定研究院),银杏酸C17 :1对照品(同田生化公司,纯度98.0% );甲醇、醋酸均为色谱纯。

Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(50 mm×3.0 mm,2.7 μ m);柱温为30 ℃,流速为0.4 mL/min,进样量1 μ L。流动相为甲醇-1%冰醋酸溶液(90 :10,v/v),待测成分全部出峰后以甲醇-1%冰醋酸溶液(99 :1,v/v)充分清洗。

电喷雾离子化(ESI)负离子模式;干燥气(N₂)流速15 L/min,温度225 ℃;雾化气(N₂)0.21 MPa;鞘气(N₂)流速11 L/min,温度300 ℃;毛细管电压3000 V。采用多反应监测(MRM)方式检测,监测离子、碰撞能量等参数见表 1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 银杏酸的监测离子对及碰撞能量(CE) Table 1 Monitoring ion pairs and collison energies (CEs) of ginkgo acids Ginkgolic acid Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) CE/ V C13:0 319.2 275.2* 25 106.1 49 C15:1 345.2 301.2* 21 119.0 49 C17:1 373.3 329.3* 29 106.0 49 *Quantitative ion.

表1 银杏酸的监测离子对及碰撞能量(CE) Table 1 Monitoring ion pairs and collison energies (CEs) of ginkgo acids

分别取银杏酸C13 :0对照品、银杏酸C15 :1对照品、银杏酸C17 :1对照品适量,精密称定,用甲醇配制成200、100、50、20、10、2 μ g/L的系列混合溶液,作为对照品溶液。

取银杏叶提取物约0.4 g,或取相当于提取物0.4 g的制剂细粉(片剂除去包衣),精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇10 mL,密塞,称定重量,超声处理20分钟,取出,放冷,再称定重量,用甲醇溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,稀释至合适浓度,即得。

本研究比较了1%(v/v)冰醋酸溶液、0.1%(v/v)冰醋酸溶液、5 mmol/L乙酸铵溶液和含0.1%(v/v)氨水的5 mmol/L乙酸铵溶液4种流动相水相对于银杏酸质谱响应的影响,发现含0.1%(v/v)氨水的5 mmol/L乙酸铵溶液为水相时,响应最高,但色谱保留和峰形均较差;1%冰醋酸溶液为水相时,色谱分离度、峰形均较好,且响应能够满足灵敏度需要。最终确定以甲醇-1%冰醋酸溶液(90 :10,v/v)为流动相,色谱图见图 2。

图2

Fig.2

图2 银杏酸的MRM色谱图 Fig.2 MRM chromatograms of ginkgolic acids

采用Agilent MassHunter Optimizer软件自动筛选定量及定性离子对,优化CE,结果见表 1。3种银杏酸碎片裂解途径基本相同,见图 3(以银杏酸C13 :0为例)。

图3

Fig.3

图3 银杏酸C13 :0的碎片裂解机制 Fig.3 Fragmentation mechanism of ginkgolic acid C13 :0

色谱中共流出组分未对待测银杏酸产生基质效应;但个别企业样品中存在部分保留极强易残留于色谱柱中的成分,尤其是片剂包衣中成分,与后续样品共馏出产生基质增强效应,可使银杏酸C17 :1增强3倍以上。因此,片剂应除去包衣,并待银杏酸全部出峰后以甲醇-1%冰醋酸溶液(99 :1,v/v)充分清洗色谱柱,避免基质效应。

取对照品溶液(50 μ g/L),以上述色谱-质谱条件连续进样6次,记录峰面积,计算精密度。结果表明,银杏酸C13 :0、C15 :1、C17 :1峰面积的RSD分别为2.3% 、4.4% 、4.9% 。

取系列对照品溶液进样测定,以各组分峰面积对质量浓度绘制标准曲线,结果表明各组分在2～200 μ g/L范围内均成良好线性关系,相关系数均在0.999以上,结果见表 2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 3种银杏酸的线性关系及检出限、定量限 Table 2 Linear relationships, LODs and LOQs of the three ginkgolic acids Ginkgolic acid Linear equation r Extract Tablet Capsule LOD/(μg/g) LOQ/(μg/g) LOD/(μg/g) LOQ/(μg/g) LOD/(μg/g) LOQ/(μg/g) C13∶0 Y=3269.4X+1499.4 0.99968 0.01 0.02 0.004 0.01 0.003 0.01 C15∶1 Y=1880.0X+666.4 0.99906 0.06 0.06 0.02 0.02 0.02 0.02 C17∶1 Y=1568.2X+1364.0 0.99983 0.08 0.19 0.02 0.02 0.02 0.02 Y: peak area; X: mass concentration, μ g/L.

表2 3种银杏酸的线性关系及检出限、定量限 Table 2 Linear relationships, LODs and LOQs of the three ginkgolic acids

取银杏叶提取物、银杏叶片和银杏叶胶囊,经检测3种银杏酸含量均在2 μ g/g以下,分别添加低(5 μ g/L)、中(20 μ g/L)、高(100 μ g/L)3个水平的对照品溶液,每个水平做3个平行样,共9份,按上述供试品溶液制备方法和色谱-质谱条件进行分析,计算回收率和精密度,结果见表 3。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 3种银杏酸在提取物和制剂中的加样回收率及精密度 Table 3 Recoveries and precisions of the three ginkgolic acids spiked in the extract and preparations (n=3) Ginkgolic acid Spiked/(μg/L) Recoveries/% RSDs/% Extract Tablet Capsule Extract Tablet Capsule C13∶0 5 105.5 111.3 114.3 3.5 2.5 4.9 20 100.9 114.2 107.4 5.9 4.6 5.6 100 102.8 106.8 104.4 6.9 0.5 3.1 C15∶1 5 94.6 112.0 104.9 13.6 5.6 3.3 20 86.3 102.9 100.4 2.6 5.6 8.8 100 93.1 102.7 104.4 2.0 3.6 4.0 C17∶1 5 98.4 95.0 103.6 5.1 4.0 4.9 20 95.0 95.2 104.0 3.3 4.4 6.4 100 101.2 97.7 106.0 1.7 4.7 2.4

表3 3种银杏酸在提取物和制剂中的加样回收率及精密度 Table 3 Recoveries and precisions of the three ginkgolic acids spiked in the extract and preparations

取加样溶液(100 μ g/L)，分别放置0、24、36 h后进样测定，比较峰面积。结果表明，银杏酸C13 :0、C15 :1、C17 :1峰面积的RSD分别为1.4%、1.3%、3.9%。加样溶液在36 h内基本稳定。

分析低水平添加溶液的信噪比,以定性离子对计算检出限(S/N=3),定量离子对计算定量限(S/N=10),结果见表 2。

本次研究对市场中银杏叶提取物及其制剂情况进行了摸底检测,共测定银杏叶提取物76批,制剂228批,将制剂测定结果按处方量折算至所含银杏叶提取物中银杏酸含量,结果见表 4。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 76批提取物和228批制剂中银杏酸的测定结果 Table 4 Detection results of ginkgolic acids in the 76 extracts and 228 preparations Content/ (μg/g) Extract Preparation Lot number Percent/% Lot number Percent/% ≤5 12 15.8 51 22.4 5-10 5 6.6 33 14.5 10-100 34 44.7 119 52.2 ≥100 25 32.9 25 11.0 Total 76 100.0 228 100.0

表4 76批提取物和228批制剂中银杏酸的测定结果 Table 4 Detection results of ginkgolic acids in the 76 extracts and 228 preparations

由表 4可见,提取物及其制剂中的银杏酸含量普遍较高,部分样品高达百万分之一百以上。仅15.8%的提取物低于百万分之五,表明现行药典方法前处理提取效率低,无法反映提取物中银杏酸的真实含量,且百万分之十限度稍宽松。而制剂中仅22.4%低于百万分之五。

研究中,从相关厂家获得以同批次提取物为原料的片剂和胶囊剂各一批进行检测,原料和两种制剂测定结果均为1 μ g/g,可见银杏酸含量与制剂工艺基本无关,与原料中的含量密切相关。

本研究建立了超高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定银杏叶提取物及其制剂中总银杏酸方法,操作简便、灵敏度高、准确性好。前处理以甲醇超声提取,解决了提取效率问题;以三重四极杆质谱检测,提高灵敏度,解决了既有方法不能有效控制制剂中银杏酸含量的问题。