高效液相色谱被广泛用于富 π 电子化合物、有机物、污染物、致癌物等的分离与检测。为了获取更高效的色谱分离效果,新型色谱固定相被不断研发出来,这类新型的固定相一般通过氢键作用、 π-π 作用、偶极-偶极作用及电子转移等作用实现对目标化合物的分离^{[1, 2]},其中 π-π 作用^{[3, 4, 5]}对含有芳环类富 π 电子化合物的分离起到最有效的作用^{[6, 7, 8]}。

二茂铁配体由于其易于功能化修饰在金属有机催化领域被广泛研究,但二茂铁键合硅胶固定相作为一类新的色谱分离介质报道较少。Delville课题组^{[9, 10]}首次制备了系列二茂铁离子型色谱固定相,考察了此类固定相对多环芳烃(PAHs)的分离性能,并与3,5-二硝基苯胺键合硅胶固定相的分离结果进行了对比。结果表明,二茂铁固定相有正相色谱性能,对PAHs有着良好的分离选择性,表明二茂铁固定相在分离中存在 π-π 作用以及 π -电子转移。南开大学左育民教授课题组^{[11, 12]}运用相似的合成方法,制备了类似的二茂铁配体键合硅胶固定相,在反相色谱条件下对烷基苯、氯苯、PAHs及苯胺等几类同系物有较高的色谱选择性。通过考察相对保留因子和多环芳烃化合物中 π 电子数的线性相关性,揭示了二茂铁固定相与芳烃化合物之间存在较强的疏水和 π-π 作用。

本课题组在之前的研究工作中制备了二茂铁固定相1^[13]。实验结果表明固定相1兼具正相和反相色谱性能,通过选择色谱模式,实现了多种物质的分离和分析。为进一步揭示二茂铁配体结构和色谱性能之间的关系,将二茂铁配体中的一个茂环替换为苯环,改变二茂铁配体的性质,制备了新型(4-环戊二烯基苯甲酸-铁-甲苯)六氟磷酸盐键合硅胶固定相(固定相2),合成路线见图 1。利用核磁共振、红外光谱、元素分析、热重分析等手段对其进行了表征,选取多环芳烃、硝基苯胺位置异构体、萘胺位置异构体、硝基咪唑类物质、有机磷等作为溶质探针,系统地考察了其色谱性能。由于固定相分子里含有羧基、六氟磷酸离子等强极性基团,使得该色谱固定相具有明显的正相色谱性能,在正相色谱模式下能提供 π -电子转移、 π-π 作用、偶极-偶极作用及与底物的静电相互作用等多种作用力,并探讨了可能的分离机理。

图1

Fig. 1

图1 固定相2的合成路线 Fig.1 Synthesis strategy of stationary phase 2

多孔硅胶(中科院兰州化物所制备,粒径5 μ m,孔径9 nm,孔容0.62 cm³/g,比表面积300 m²/g); 3-氨丙基三乙氧基硅烷(分析纯,上海晶纯试剂有限公司);六氟磷酸水溶液(HPF₆,含量为60% (质量分数),北京百灵威科技有限公司),4-氨基苯甲酸(分析纯,东京化成工业株式会社);二茂铁(分析纯,用新蒸甲苯重结晶后使用);四丁基溴化铵(分析纯,吉尔生化有限公司);二环己基碳二亚胺(DCC,分析纯,北京百灵威科技有限公司); 1-羟基苯并三氮唑(色谱纯,成都贝斯特试剂有限公司);氨丙基硅胶(色谱纯,北京博德恒悦科贸有限公司);甲苯(分析纯,钠回流重蒸);三乙胺(分析纯,钠回流重蒸);二氯甲烷(分析纯,沸程为60～90 ℃,用前重蒸); N,N-二甲基甲酰胺(DMF,分析纯,氢化钙回流,加压蒸馏);甲醇(色谱纯)、氨水(含量为28% (质量分数))、盐酸(含量为37% (质量分数))、三氯化铝、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、乙醇、四氢呋喃、正己烷、四氯化碳、异丙醇、氯化钠以及其他试剂若无特别说明均为分析纯,购自郑州博世化玻试剂有限公司。

装柱机(CGY-100B型高压气动泵、50 mL匀浆罐,北京福思源机械加工部); Agilent Eclipse XDBC18柱(ODS,150 mm×4.6 mm,5 μ m,美国Agilent公司); APS不锈钢柱(150 mm×4.6 mm,郑州英诺生物科技有限公司); PE 1710红外吸收光谱仪(德国PE公司); STA 409 PC热分析仪(德国耐驰公司); Flash EA 1112元素分析仪(美国Thermo Electron SPA公司); Agilent 1100 Series LC/MSD Trap XCT液相色谱-质谱联用仪和Agilent 1200液相色谱仪(美国Agilent公司); Bruker dpx-400超导核磁共振仪(德国Bruker公司);纯水机(美国Millipore公司); G5砂芯漏斗(如东县砂芯玻璃仪器有限公司)。

4-二茂铁基苯甲酸根据文献[14]合成。在三口烧瓶中,加入2.823 g 4-二茂铁基苯甲酸和3 g无水三氯化铝,在真空条件下干燥除氧,在氮气保护下逐滴加入40 mL新蒸无水甲苯,加入0.16 mL H₂O,混合物搅拌回流反应12 h,冷却至40 ℃左右,真空条件下用20 mL除氧的冰水缓慢水解反应液,过滤,滤饼用少量水洗3次,合并滤液并用60 mL乙醚萃取3次,直至水层变为无色。水相中加入28%氨水,调节pH至8～9,过滤除去生成的氢氧化铝沉淀。再加入20%的NaOH溶液,使pH升至12～13,后加入1 mL 60%的HPF₆水溶液,过滤,滤液中逐滴加入浓盐酸至pH降至5～6,再加入1 mL 60%的HPF₆水溶液,使pH降至0～1,大量析出的沉淀即为甲苯(4-环戊二烯基苯甲酸)亚铁离子化六氟磷酸,用丙酮和乙醇重结晶。干燥后于干燥器中备用。

分别称取 1.338 4 g甲苯(4-环戊二烯基苯甲酸)亚铁离子化六氟磷酸和 0.338 0 g 1-羟基苯并三氮唑,置于三口瓶中,用新蒸的DMF溶解,在N₂的保护下于氯化钠冰盐浴中冷却至0 ℃。将 0.697 5 g DCC溶于10 mL无水二氯甲烷,在N₂的保护下滴加至上述混合物中,搅拌1 h,后依次加入2.5 g氨丙基硅胶和776.3 μ L新蒸三乙胺,室温反应24 h。反应结束后用G5砂芯漏斗过滤,依次用DMF、乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、正己烷、三乙胺和丙酮洗涤,然后于50 ℃真空干燥20 h,置于干燥器中备用。

用匀浆法将固定相2装入APS不锈钢色谱柱管中,匀浆液为四氯化碳和异丙醇(98: 2,v/v)混合液,顶替液为甲醇,装柱压力为40 MPa。把新装的色谱柱用0.2 mL/min 的甲醇流动相冲洗过夜,次日逐渐升高流速至1.0 mL/min,平衡稳定后待用。

对合成的新化合物(4-环戊二烯基苯甲酸-铁-甲苯)六氟磷酸盐进行核磁共振和高分辨质谱表征。数据如下:¹H-NMR(400 MHz)(d⁶-DMSO): 13.18(s,1H),8.02(d,J=7.5 Hz,2H),7.93(d,J=7.6 Hz,2H),6.09(d,J=23.2 Hz,5H),5.86(s,2H),5.31(s,2H),2.08(s,3H)。¹³C-NMR(100 MHz)(d⁶-DMSO): 167.4,136.5,131.7,130.5,128.0,104.1,92.7,89.8,89.0,87.5,77.9,74.2,19.5。高分辨质谱数据显示C₁₉H₁₇O₂Fe⁺[M]⁺的m/z计算值为 333.057 8,实际值为 333.057 2。由此可知,成功地合成了(4-环戊二烯基苯甲酸-铁-甲苯)六氟磷酸盐。该化合物熔点为267.9～268.8 ℃。

对合成的(4-环戊二烯基苯甲酸-铁-甲苯)六氟磷酸盐键合硅胶固定相(固定相2)进行了红外光谱表征、元素分析和热重分析。

相对氨丙基硅胶,固定相2的红外光谱图中在 1 661.35 cm^-1处有酰胺键的伸缩振动特征吸收峰,表明(4-环戊二烯基苯甲酸-铁-甲苯)六氟磷酸已经成功键合到氨丙基硅胶上。

由元素分析结果(表 1)可知,(4-环戊二烯基苯甲酸-铁-甲苯)六氟磷酸盐成功地键合到硅胶上,其键合量为0.178 mmol/g(以C元素的含量计算)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 固定相2的元素分析结果 Table 1 Elementary analysis results of stationary phase 2 Substance C/% H/% N/% Bonded amount/(mmol/g) Aminopropyl silica gel 4.18 0.98 1.08 1.16 Stationary phase 2 8.23 1.10 0.50 0.178

表1 固定相2的元素分析结果 Table 1 Elementary analysis results of stationary phase 2

由热重分析数据可知,固定相2的失重温度为100 ℃左右,在100～400 ℃之间失重6.29% ,表明固定相2具有较好的热稳定性和化学稳定性。

在正、反相色谱模式下,选取苯、联苯、菲、苯并菲和苯并荧蒽为溶质探针,考察了固定相2对多环芳烃的分离。由图 2可知,在正相色谱条件下,5种多环芳烃在固定相2上的保留时间长短依次为苯＜联苯＜菲＜苯并菲＜苯并荧蒽,即随着 π -电子数和芳香环数目的递增,在固定相2上的保留依次增强。由表 2可知,多环芳烃在固定相2上的保留强于在固定相1上的保留,这可能是由于二茂铁配体具有较好的对称性和较高的轨道能量,当二茂铁配体中的一个茂环被甲苯取代变为(4-环戊二烯基苯甲酸-铁-甲苯)六氟磷酸盐后,新的二茂铁配体带有1个正电荷,使固定相接受电子的能力增强,更易与富 π 电子的溶质分子之间形成较强的 π-π 作用和静电作用,这些作用增加了分析物在固定相2上的保留。

图2

Fig. 2

图2 多环芳烃在固定相2上的正相色谱图 Fig.2 Normal phase chromatogram of PAHs on stationary phase 2 Mobile phase: 100% hexane; flow rate: 0.8 mL/min; detection wavelength: 254 nm; column temperature: 30 ℃. Peaks: 1. benzene; 2. biphenyl; 3. phenanthrene; 4. triphenylene; 5. benzofluoranthene.

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 5种多环芳烃在固定相1和固定相2上的k, α 和R值 Table 2 k, α and R values of five PAHs on stationary phase 1 and stationary phase 2 Compound Stationary phase 1 Stationary phase 2 k α R k α R Benzene 0.10 - - 0.19 - - Biphenyl 0.42 4.2 2.03 0.47 2.47 3.06 Phenanthrene 0.76 1.81 2.50 1.27 2.70 6.53 Triphenylene 1.40 1.84 2.63 3.57 2.81 9.67 Benzofluoranthene 1.68 1.20 1.10 4.29 1.20 2.11 k: capacity factor; α : selectivity factor; R: resolution; -: not exist.

表2 5种多环芳烃在固定相1和固定相2上的k, α 和R值 Table 2 k, α and R values of five PAHs on stationary phase 1 and stationary phase 2

在以正己烷-异丙醇(85: 15,v/v)为流动相、流速为0.8 mL/min 的色谱条件下,考察了 α -萘胺和 β -萘胺位置异构体的分离。由图 3和表 3可知,在正相色谱条件下,α -萘胺在固定相1和固定相2上均早于 β -萘胺被洗脱,萘胺位置异构体在固定相2上的保留较强。这可能是因为萘胺类物质中共轭环和大的电子云能与固定相2中二茂铁配体的正电荷、苯环和酰胺键等形成强的静电作用、 π-π 作用、氢键及偶极-偶极等相互作用,增加了分析物在固定相2上的保留,这些多重作用力使萘胺位置异构体的保留较为相近。

图3

Fig. 3

图3 萘胺位置异构体在固定相2上的正相色谱分离图 Fig.3 Normal phase chromatogram of naphthylamine positional isomers on stationary phase 2 Mobile phase: hexane-isopropanol (85: 15, v/v); flow rate: 0.8 mL/min; detection wavelength: 254 nm; column temperature: 30 ℃. Peaks: 1. α -naphthylamine; 2. β -naphthylamine.

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 萘胺位置异构体在固定相1和固定相2上的k, α 和R值 Table 3 k, α and R values of naphthylamine positional isomers on stationary phase 1 and stationary phase 2 Compound Stationary phase 1 Stationary phase 2 k α R k α R α-Naphthylamine 4.56 - - 1.33 - - β-Naphthylamine 5.59 1.23 0.54 1.99 1.50 1.10 k: capacity factor; α : selectivity factor; R: resolution; -: not exist.

表3 萘胺位置异构体在固定相1和固定相2上的k, α 和R值 Table 3 k, α and R values of naphthylamine positional isomers on stationary phase 1 and stationary phase 2

在以己烷-异丙醇(70: 30,v/v)为流动相、流速为0.8 mL/min 的色谱条件下,考察了硝基苯胺位置异构体的分离。由图 4和表 4可知,硝基苯胺异构体在固定相2上的保留强于固定相1,这可能是硝基苯胺类物质含有的芳环和硝基基团与固定相2形成的静电作用、 π-π 作用、 π -电子转移及氢键等多重作用的结果。与固定相1上的分离效果相比,固定相2对硝基苯胺异构体分离效果良好,且间硝基苯胺的峰形得到明显改善。这可能是因为在正相色谱模式下,流动相的极性较小,固定相1与间硝基苯胺之间有强的氢键作用,导致峰形拖尾。

图4

Fig. 4

图4 硝基苯胺异构体在(a)固定相1和(b)固定相2上的 正相色谱分离图 Fig.4 Normal phase chromatograms of nitroaniline isomers on (a) stationary phase 1 and (b) stationary phase 2 Mobile phases: hexane-isopropanol (70: 30, v/v) for (a), hexane-isopropanol (30: 70, v/v) for (b); flow rate: 0.8 mL/min; detection wavelength: 254 nm; column temperature: 30 ℃. Peaks: 1. o-nitroaniline; 2. m-nitroaniline; 3. p-nitroaniline.

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 硝基苯胺位置异构体在固定相1和固定相2上的k, α 和R值 Table 4 k, α and R values of nitroaniline isomers on stationary phase 1 and stationary phase 2 Compound Stationary phase 1 Stationary phase 2 k α R k α R o-Nitroaniline 1.36 - - 2.53 - - m-Nitroaniline 2.25 1.65 2.34 4.43 1.75 3.47 p-Nitroaniline 5.51 2.45 0.93 10.11 2.28 7.61 k: capacity factor; α : selectivity factor; R: resolution; -: not exist.

表4 硝基苯胺位置异构体在固定相1和固定相2上的k, α 和R值 Table 4 k, α and R values of nitroaniline isomers on stationary phase 1 and stationary phase 2

此外,异构体在两种固定相上的保留顺序也不相同,在固定相2上的保留时间依次为邻硝基苯胺＜间硝基苯胺＜对硝基苯胺。邻硝基苯胺、间硝基苯胺和对硝基苯胺偶极矩的实验值依次为4.38、4.91和6.33 C\5m,这与它们在固定相2上的出峰顺序一致。而在固定相1上,出峰顺序变为邻硝基苯胺＜对硝基苯胺＜间硝基苯胺,间硝基苯胺最后被洗脱下来。固定相1上的羰基与间硝基苯胺上的氢原子之间强的氢键作用增强了其在固定相1上的保留,这与它的峰形拖尾相互印证。

在以正己烷-异丙醇(70: 30,v/v)为流动相、流速为0.8 mL/min 的色谱条件下,考察了硝基咪唑类物质的分离效果。由图 5可知,在正相色谱条件下,5种硝基咪唑类物质在固定相2上能实现部分分离,保留能力随溶质极性的增大而增强。但替硝唑和异丙硝唑、甲硝唑和奥硝唑没有实现完全的基线分离,这可能与彼此极性较相近有关。由于甲硝唑和奥硝唑分子中存在羟基活性基团,能与固定相形成强的氢键作用,因此在色谱柱上的保留较强,但由于二者分子结构和极性较为相似,不能达到基线分离。而替硝唑和异丙硝唑极性比较小,保留能力较弱,出峰时间都比较靠前,不能达到基线分离。在反相色谱条件下,固定相2能提供的相关作用力比较弱,5种硝基咪唑类物质同时被洗脱。

图5

Fig. 5

图5 5种硝基咪唑类物质在固定相2上的(a)正相及(b)反相色谱分离图 Fig.5 (a) Normal phase and (b) reversed phase chromatograms of five nitroimidazoles on stationary phase 2 Mobile phases: hexane-isopropanol (70: 30, v/v) for (a), acetonitrile-water (75: 25, v/v) for (b); flow rate: 0.8 mL/min; detection wavelength: 254 nm; column temperature: 30 ℃. Peaks: 1. isopropyl metronidazole; 2. tinidazole; 3. ronidazole; 4. metronidazole; 5. ornidazole.

有机磷农药是在我国使用量最大、品种最多的杀虫剂和除草剂^[15],它是一类含有 C-P 、 C-O-P 、 C-S-P 或 C-N-P 键的有机化合物,如果在蔬菜中过多残留,可通过食物链进入动植物体内,引起正常机体功能的紊乱和各种病变,因此对有机磷农药的分离分析意义重大。本文考察了固定相2对特丁硫磷、丙溴磷、定菌磷和甲基对硫磷4种有机磷农药的分离效果。

在以正己烷-异丙醇(95: 5,v/v)为流动相、流速为0.8 mL/min 的色谱条件下,考察了有机磷类化合物的分离效果,并与其在反相色谱条件下的分离进行了对比。由图 6可知,在正相色谱条件下,特丁硫磷、丙溴磷、定菌磷和甲基对硫磷在8 min之内基本实现了基线分离,分离选择性较好,出峰顺序依次为特丁硫磷、丙溴磷、定菌磷和甲基对硫磷。这可能是由于固定相能与分析物之间形成强的 π-π 作用和偶极-偶极作用,这些作用使得被分析物在该色谱柱上得以保留,使4种有机磷化合物能在正相色谱条件下得以分离。同时考察了在反相色谱条件下4种有机磷化合物的分离效果,由于在反相色谱条件下的疏水作用等极弱,分析物和溶剂共洗脱,在色谱柱上几乎没有保留。

图6

Fig. 6

图6 4种有机磷化合物在固定相2上的(a)正相及(b)反相色谱分离图 Fig.6 (a) Normal phase and (b) reversed phase chromatograms of four organic phosphorus compounds on stationary phase 2 Mobile phases: hexane-isopropanol (95: 5, v/v) for (a), acetonitrile-water (80: 20, v/v) for (b); flow rate: 0.8 mL/min; detection wavelength: 254 nm; column temperature: 30 ℃. Peaks: 1. terbufos; 2. profenophos; 3. gnotobiotic phosphorus; 4. methyl parathion.

本文制备并表征了(4-环戊二烯基苯甲酸-铁-甲苯)六氟磷酸盐键合硅胶固定相,选取多环芳烃、萘胺位置异构体、硝基苯胺位置异构体、硝基咪唑类物质和有机磷化合物作为溶质探针,对色谱性能进行了系统评价。结果表明,该固定相具有明显的正相色谱性能,在正相色谱模式下能提供 π -电子转移、 π-π 作用、偶极-偶极作用及与底物间的静电相互作用等多种作用力。