近年来出现的“瘦肉精”事件引起了人们对肉品中β₂-受体激动剂类药物残留的广泛关注^{[1, 2]}。常用于畜牧业生产中的β₂-受体激动剂主要有克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、西马特罗、苯乙醇胺、非诺特罗、氯丙那林、妥布特罗和喷布特罗等10余种,主要作用是抑制动物脂肪生成、提高胴体瘦肉率,常作为牛、羊、鸡等畜禽的促生长剂和饲料添加剂。残留在动物组织中的“瘦肉精”可以通过膳食摄入进入人体,并对人体的心血管和神经系统产生影响,中毒反应主要表现为肌肉震颤、四肢麻木、剧烈腹痛、心跳和呼吸加快,严重时甚至会导致死亡^[3]。为了保护人类的健康,多个国家的监管部门均颁布了相关法令禁止将β₂-受体激动剂用于畜牧业生产中。我国农业部、卫生部和国家药品监督管理局于2002年联合出台了《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药品目录》,将克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等列为禁用药品,并将这些禁用药品列入年度监测计划^[4]。

目前用于检测β₂-受体激动剂类药物的主要方法有GC-MS^{[5, 6]}、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)^{[7, 8]}和酶联免疫吸附法(ELISA)等^[9]。HPLC-MS/MS因具有灵敏度高、选择性好、检出限低等特点而广泛应用于食品质量安全检测中。关于动物性食品样品中β₂-受体激动剂的提取,大多数采用β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解的方法。然而酶解提取法存在耗时长,提取效果欠佳及样品回收率偏低等不足^{[9, 10]}。另外,在使用HPLC-MS/MS检测动物性食品样品过程中常常会因较强的基质干扰而影响定量的准确性^{[10, 11, 12]}。可见,在样品检测过程中应该加强样品前处理方法及质谱检测条件的优化,以提高β₂-受体激动剂的定量准确度。

克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林是4种常见的β₂-受体激动剂,也是近年来国家食品污染和有害因素风险监测工作之动物性食品中主要监测的β₂-受体激动剂。本研究针对目前已报道的检测方法中存在的提取方法耗时长,基质抑制效应强等问题,采用质量分数为5%的三氯乙酸振荡提取、SPE萃取柱串联净化及HPLC-MS/MS检测等手段,对肉类中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林的分析方法进行了优化改进,从而建立了一套能够同时快速检测肉类中4种常见β₂-受体激动剂的分析方法,为动物性食品中4种常见的β₂-受体激动剂的监测提供了技术支持。

API 4500 QTrap型三重四极杆串联质谱仪(美国AB公司); LC-30A型高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司); 2-16KL型冷冻离心机(美国Sigma公司); GL Sciences固相萃取装置(北京Dikma公司);氮吹仪(美国Organomation公司);涡旋振荡仪(海门市麒麟医用仪器厂)。

甲醇、甲酸为色谱纯(北京Dikma公司);氨水为色谱纯(美国Sigma公司);三氯乙酸为分析纯(上海国药集团化学试剂有限公司)。

盐酸克仑特罗(clenbuterol)、莱克多巴胺(ractopamine)、沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)均购于美国Sigma公司，纯度均高于96.0% 。D9-克仑特罗(D9-clenbuterol)、D6-莱克多巴胺(D6-ractopamine)、D3-沙丁胺醇(D3-salbutamol)、D9-特布他林(D9-terbutaline)均购于TRC化学品公司(Toronto Research Chemicals Inc.)，纯度均高于98.0% 。

HLB固相萃取柱(6 mL,150 mg)购自美国Waters公司;ProElut PXC固相萃取柱(6 mL,150 mg)购自北京Dikma公司。

色谱柱:Shim-pack XR-ODS III C18 (50 mm×2.0 mm,1.6 μ m);流动相:A为0.1%(v/v)甲酸水溶液,B为0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液。梯度洗脱:0～1.0 min,5%B; 1.0～3.0 min,5%B～20%B; 3.0～7.0 min,20%B～30%B; 7.0～9.0 min,30%B～60%B; 9.1～15.0 min,5%B。恒定流速:0.3 mL/min;柱温:40 ℃;进样量:5 μ L。

电喷雾离子源正离子模式(ESI⁺);多反应监测(MRM)扫描模式;离子化电压:5 500 V;离子源温度:550 ℃;气帘气压力:172 kPa;喷雾气压力:379 kPa;辅助加热气压力:379 kPa;去簇电压:70 V。4种β₂-受体激动剂及其氘代同位素内标的其他质谱参数见表 1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 4种β2-受体激动剂及其氘代同位素内标的质谱参数 Table 1 MS parameters of the four β2-agonists and deuterium isotopes Compound Retention time/min Precursor ion ( m/z) Product ion ( m/z) Collision energy (CE)/V Clenbuterol 3.92 277.2 203 * 23 132 38 Ractopamine 3.83 302.3 164 * 22 107 50 Salbutamol 1.04 240.3 148 * 25 166 19 Terbutaline 0.92 226.2 152 * 22 107 40 D9-Clenbuterol 4.05 286.2 212 * 23 D6-Ractopamine 3.87 308.3 170 * 28 D3-Salbutamol 1.02 243.3 151 * 25 D9-Terbutaline 0.89 235.3 161 * 23 * Quantitative ion.

表1 4种β2-受体激动剂及其氘代同位素内标的质谱参数 Table 1 MS parameters of the four β2-agonists and deuterium isotopes

分别称取1.0 mg 4种β₂-受体激动剂,用甲醇配制成100.0 mg/L 的标准储备液;分别移取4种β₂-受体激动剂标准储备液各100 μ L,用甲醇定容至10 mL,得到1 mg/L 的混合标准工作液。氘代标准储备液和混合氘代标准工作液的配制方法同上。

称取与试样相当的空白样品,与试样同时进行提取、净化和复溶,得到基质溶液。在基质溶液中加入1.4节配制的混合标准工作液,再用0.1%(v/v)甲酸水分别稀释成0.25、0.5、1、2.5、5、10、20和50 μ g/L 的系列空白基质混合标准工作溶液。

将动物性食品样品用搅拌机搅成泥状,准确称取2 g,置于15 mL聚丙烯离心管内,分别加入50 μ L质量浓度为0.1 mg/L的4种混合氘代标准工作液(用甲醇将1.4节配制的混合氘代标准工作液稀释10倍)和8 mL质量分数为5%的三氯乙酸,涡旋30 s,于80 ℃下超声30 min，然后于0 ℃、10 000 r/min 下离心10 min,取上清液置于另一个15 mL离心管中;将沉淀物依次用4、2 mL质量分数为5%的三氯乙酸提取,合并上清液,待净化。

预先依次用6 mL甲醇和纯净水活化HLB柱和ProElut PXC柱。将提取液过HLB柱,用2 mL 5%(v/v)甲醇水溶液淋洗,弃去淋洗液;用6 mL甲醇洗脱,收集洗脱液,用氮气吹干;用6 mL质量分数为5%的三氯乙酸溶解残渣,过ProElut PXC柱,分别用3 mL水、5 mL正己烷和1 mL甲醇淋洗ProElut PXC柱,弃去淋洗液;用6 mL含有5%(v/v)氨水的甲醇洗脱柱,收集洗脱液,用氮气吹至近干,用1 mL甲醇溶解,于4 ℃、14 000 r/min 下离心10 min,收集上清液置于另一个干净离心管中;沉淀物用1 mL甲醇再溶解,离心(14 000 r/min,10 min),合并上清液;小气流氮气吹干,用1 mL甲醇-0.1%甲酸(1 ∶ 9,v/v)溶液溶解,取上清液,待测定。

采用HPLC-MS/MS检测动物样品中β₂-受体激动剂的方法中多数以0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相A,以纯甲醇或乙腈作为流动相B。本实验以0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相A,分别比较了以0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液和纯甲醇作为流动相B时目标化合物的分离效果。结果表明,以纯甲醇作为流动相B时,克伦特罗和沙丁胺醇的色谱图出现双峰,而以0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液作为流动相B时,该现象消除。这是因为加入一定量的甲酸后增加了溶液中H⁺浓度,进而加速目标分子的电离,可有效消除双峰现象。故本实验选择以0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液作为流动相B。图 1为4种β₂-受体激动剂及其同位素内标空白基质溶液(20 μ g/kg)的MRM色谱图。

图1

Fig. 1

图1 4种β2-受体激动剂及其同位素内标空白基质溶液(20 μ g/kg)的MRM色谱图 Fig.1 MRM chromatograms of the four β2-agonists and deuterium isotopes as the internal standards spiked in a blank matrix solution (20 μ g/kg)

4种β₂-受体激动剂类药物中,沙丁胺醇、莱克多巴胺、特步他林在动物体内代谢过程中其苯环上的极性基团容易与体内的葡糖糖醛苷酸、硫酸脂蛋白等成分发生轭合反应,生成轭合物,使上述3种药物有一部分以结合态形式存在;由于苯环取代基的差异,盐酸克伦特罗与动物体内其他成分的轭合反应率和蛋白结合率均较低,故其在动物体内主要以游离态形式存在^{[13, 14]}。因此β₂-受体激动剂常用酶解法(加入β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶,一般需在37 ℃下酶解16 h)进行提取,再加入乙酸钠、乙酸铵等缓冲溶液,使结合态的待测物释放出来,然后再测定,耗时较长,过程繁琐。已有研究使用三氯乙酸、甲酸等酸解法提取动物性食品样品中的β₂-受体激动剂,并得到了良好的提取效果^{[10, 15]}。Fan等^[10]研究证明,与酶解法相比,采用三氯乙酸酸解法提取动物性样品中的β₂-受体激动剂可以获得更好的提取效果。比起酶解法,酸解法具有操作简便,节约时间,提取效果好等优点,故本文采用质量分数为5%的三氯乙酸酸解提取动物性食品中4种β₂-受体激动剂。

文献[10, 15]采用酸解法提取动物性食品样品中的β₂-受体激动剂时,均采用单一固相萃取柱对样品进行净化,鉴于肉类样品基质复杂,使用单一SPE柱净化或许达不到最优的净化效果。因此本实验比较了采用HLB+ProElut PXC固相萃取柱串联净化和采用单一ProElut PXC柱净化两种不同的净化方法。两种方法净化后的空白基质样品的加标回收率如表 2所示。相对于单一ProElut PXC柱净化,采用HLB+ProElut PXC柱串联净化处理可获得较好的回收率,这一点在低浓度(2.5 μ g/kg)加标样品中表现更为明显。本实验首先使用HLB柱净化，因为HLB固相萃取小柱填充的是亲水、亲脂平衡的可浸润性反相吸附剂,是一种通用型萃取柱,可吸附包括目标检测物在内的酸性、中性和碱性化合物。ProElut PXC柱填充的是混合型强阳离子交换反相吸附剂,在HLB柱净化的基础上再用ProElut PXC柱进一步净化,既有利于基质干扰的去除,又能够选择性地锁定4种β₂-受体激动剂。将串联过柱后的提取液高速离心,取其上清液即可直接上机检测,在一定程度上避免了滤膜过滤造成目标检测物的损失(采用单一ProElut PXC柱净化样品,需用0.22 μ m尼龙膜过滤提取液,而滤膜对目标检测物或其同位素内标物质均有一定吸附)。综合以上实验结果,本实验选用HLB+ProElut PXC固相萃取柱串联法净化提取液。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 3个加标水平下两种SPE净化方法对空白基质样品中4种β2-受体激动剂类药物加标回收率的影响 Table 2 Effect of two SPE purification methods on the recoveries of β2-agonists spiked in a blank matrix sample at three levels Compound SPE purification method Spiked recoveries/% 2.5 μg/kg 5 μg/kg 10 μg/kg Clenbuterol HLB+ProElut PXC 101.8 99.8 96.5 ProElut PXC 91.4 95.5 87.2 Ractopamine HLB+ProElut PXC 111.3 119.7 112.2 ProElut PXC 123.3 154.3 133.9 Salbutamol HLB+ProElut PXC 109.1 105.7 94.4 ProElut PXC 74.3 101.6 91.5 Terbutaline HLB+ProElut PXC 105.1 105.4 103.3 ProElut PXC 67.0 90.7 90.4

表2 3个加标水平下两种SPE净化方法对空白基质样品中4种β2-受体激动剂类药物加标回收率的影响 Table 2 Effect of two SPE purification methods on the recoveries of β2-agonists spiked in a blank matrix sample at three levels

采用HPLC-MS/MS定量分析复杂基质中化合物的含量,应该将基质效应作为方法学验证指标进行评估^[16]。基质效应(ME)=[(基质匹配校准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率)-1]×100% 。｜ME｜＜20%为弱基质效应,可忽略,无需采取补偿措施;20%≤｜ME｜≤50%为中等程度基质效应,｜ME｜＞50%为强基质效应,均须采取措施补偿基质效应^{[17, 18]}。在HPLC-MS/MS的方法确证中,采用空白基质配制系列标准溶液可以有效降低基质效应对方法的精确度和结果的准确度产生的影响。本实验按照1.5节方法配制空白基质混合标准工作溶液,以甲醇-0.1%甲酸水(9 ∶ 1,v/v)为溶剂配制同浓度的标准溶液,按照基质效应公式计算ME(见表 3)。由表 3可知本实验的基质效应基本可以忽略,净化效果和质谱条件较为合理,有利于准确定量分析。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 4种β2-受体激动剂的回归方程、相关系数、检出限、定量限及基质效应 Table 3 Regression equations, correlation coefficients (r), LODs, LOQs and matrix effects (ME) of the four β2-agonists Compound Regression equation r LOD/(μg/kg) LOQ/(μg/kg) ME/% Clenbuterol y=0.0865 x+0.0124 0.995 0.05 0.25 -17 Ractopamine y=0.0802 x+0.0042 0.994 0.05 0.25 -3 Salbutamol y=0.158 x+0.0141 0.997 0.05 0.10 -19 Terbutaline y=0.136 x+0.0213 0.997 0.20 0.50 -12 y: peak area ratio of quantitative ions between compound and internal standard; x: mass concentrations, μ g/L; weighting: 1/x2; ME: matrix effect=[(slope of matrix solution/slope of solvent solution)-1]×100% .

表3 4种β2-受体激动剂的回归方程、相关系数、检出限、定量限及基质效应 Table 3 Regression equations, correlation coefficients (r), LODs, LOQs and matrix effects (ME) of the four β2-agonists

将仪器各参数调至最佳工作状态,在MRM模式下,以定性离子通道中信噪比(S/N)为3时空白基质标准溶液中4种β₂-受体激动剂的浓度为检出限;S/N为10时的浓度为定量限。克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林的检出限分别为0.05、0.05、0.05及0.2 μ g/kg,定量限分别为0.25、0.25、0.10和0.50 μ g/kg(见表 3)。国家标准(GB/T 21313-2007)中这4种β₂-受体激动剂的检出限和定量限分别为0.10和0.30 μ g/kg。可见本实验条件下除了特布他林,其他3种β₂-受体激动剂的检出限和定量限均低于国家标准方法的检出限和定量限。李莹莹等^[15]用0.1%(v/v)甲酸-乙腈振荡提取肉中β₂-受体激动剂所得的检出限和定量限分别为0.2和0.5 μ g/kg。可见本实验所得的检出限和定量限均有一定的优势。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 空白基质样品中4种β2-受体激动剂的回收率范围和相对标准偏差(RSD)范围(n=6) Table 4 Recovery ranges and RSD ranges of the four β2-agonists in a blank spiked matrix sample (n=6) Compound Recovery range/% RSD range/% Clenbuterol 90.3-101.8 2.52-7.31 Ractopamine 112.3-120.5 1.60-8.33 Salbutamol 91.7-109.1 3.28-5.96 Terbutaline 105.4-107.7 4.70-9.33 Spiked levels: 0.25, 5, 10 μ g/kg.

表4 空白基质样品中4种β2-受体激动剂的回收率范围和相对标准偏差(RSD)范围(n=6) Table 4 Recovery ranges and RSD ranges of the four β2-agonists in a blank spiked matrix sample (n=6)

以目标组分定量离子与内标物定量离子的峰面积比值(y)与对应的质量浓度(x,μ g/L)绘制标准曲线,4种β₂-受体激动剂的线性关系良好,回归方程见表 3。在建立定量方法时，本实验比较了回归方程加权重和不加权重两种模式下相关系数(r)的变化。结果显示,不使用加权重时,r的范围为 0.999 3～0.999 9,以克伦特罗为例,标准曲线中各浓度点(0.25、0.50、1.00、2.50、5.0、10.00、20.00、50.00 μ g/L)的测定值分别为0.11、0.35、1.10、2.60、5.60、10.20、19.40、48.20,最低浓度点的相对误差为-56% ;采用加权重法(权重模式:1/x²)时,r的范围为0.994～0.997(见表 3),其标准曲线中各浓度点的测定值分别为0.23、0.47、1.10、2.60、5.40、9.70、18.40、45.50,各浓度点的相对误差范围为-9% ～10% 。回归方程采用加权重后,低浓度的检测结果会更准确,故本实验在建立定量方法时将权重考虑入回归方程中。

在空白基质样品中添加低、中、高3个水平(0.25、5、10 μ g/kg)的4种β₂-受体激动剂标准溶液,每个加标水平进行6次测定,内标法定量,结果如表 4所示。4种β₂-受体激动剂的平均回收率为90.3% ～120.5% ,相对标准偏差为1.60% ～9.33% 。

利用本文建立的分析方法完成了由北京市疾病预防控制中心2014年4月开展的“北京市疾控机构禽肉中β₂-受体激动剂专项监测”任务,对北京市市场销售的26份猪肉、羊肉、牛肉及猪肝、羊肝等样品中4种常见的β₂-受体激动剂进行测定。检出阳性样品两份,即1份羊肉样品中克伦特罗的含量为32.14 μ g/kg,1份猪肝样品中沙丁胺醇的含量为467.96 μ g/kg。阳性样品经北京市各疾控机构检测比对,结果达标。

本文建立了高效液相色谱-串联质谱同时检测动物性食品中4种β₂-受体激动剂的方法。采用酸解提取法代替传统的酶解提取法,并验证了酸解法在提取动物性食品中β₂-受体激动剂的高效性与可靠性。此外,本文在净化样品时采用了HLB+ProElut PXC固相萃取柱串联法,有效去除了杂质对目标检测物的干扰,减少了基质效应,提高了检测的灵敏度,通过将权重考虑入回归方程,提高了定量计算的准确度。该方法灵敏度高,选择性好,线性关系、回收率和重现性等方法学指标较好,能够同时快速检测肉类中4种常见β₂-受体激动剂,为动物性食品中4种常见的β₂-受体激动剂的监测提供了技术支持。