4-甲基咪唑(4-methyl imidazole, 4-MI)是一种含氮杂环化合物,是合成咪唑类离子液体的重要成分,由于其价格低廉,被广泛用于食品添加剂、环境、药物等行业。4-MI具有强烈的致惊阙作用,能使动物产生超兴奋状态,对反刍动物有后天性的损害,可使人发生痉挛。目前测定4-MI的方法主要有层析法[1]、色谱法[2, 3]、分光光度法[4]等,但这些方法的应用都受到客观因素的限制。4-MI是小分子化合物,在色谱中不容易与杂质分离,需经过衍生化,引入荧光和紫外的发色基团,才能提高它的灵敏度。因此研制类似于酶和抗体的选择性高、造价低和稳定性好的吸附材料用于食品中痕量4-MI的选择性富集分离及检测尤为重要。
分子印迹技术是指以某一特定的目标分子为模板,制备对该分子具有特异选择性的聚合物[5]。该技术已成功应用于测定及分离复杂底物中某一特定痕量待测物。分子印迹聚合物(MIPs)常被作为固相萃取填料、固相微萃取涂层或制备成传感器用来分离富集复杂样品中的痕量分析物[6],在农兽药残留、生物毒素、重金属污染、违规添加剂以及食品内源性成分的分析中均有应用,极大地提高了检测效率和灵敏度。杨卫海等[7]采用沉淀聚合法,以4-MI为模板分子,甲基丙烯酸(MAA)为功能单体,制备了4-MI印迹聚合物,但其识别位点在聚合物内部,而聚合物内部存在的扩散阻力会导致印迹分子与识别位点结合效率低和存在印迹分子洗脱困难的问题[8, 9]。表面印迹聚合通过修饰的方法使基质表面带有活性基团,制得的聚合物的活性结合位点基本都是裸露在外面的,印迹过程发生在基质表面,减少了“包埋”现象,加快了模板分子的去除和洗脱。这样可以解决其他方法所制备的分子印迹聚合物印迹分子与识别位点结合困难和结合效率低的问题,可极大提高印迹分子的洗脱率及印迹聚合物的结合容量,缩短结合达到平衡的时间,是一种应用前景广阔的印迹技术[10, 11]。
Fe3O4磁性纳米材料具有特殊磁导向性、超顺磁性及表面可连接生化活性功能基团等特性,使其在核酸分析、临床诊断、靶向药物、酶和细胞固定化等领域应用广泛[12, 13]。在Fe3O4磁性纳米粒子表面进行分子印迹,合成磁性分子印迹聚合物核壳材料,使MIPs能识别特定目标分子,且不需要抽滤或离心分离,拓展了分子印迹与磁性纳米材料的应用领域[14]。黄镭等[15]以磺胺为模板分子,MAA为功能单体,用Fe3O4磁性纳米微球制备了具有特异性识别磺胺的磁性分子印迹聚合物,该聚合物具有良好的超顺磁性和高选择吸附性两大优点,但未用于实际样品的检测。王茹娟等[16]采用表面分子印迹技术,以谷胱甘肽为模板分子,N-乙烯基吡咯烷酮和丙烯酰胺为功能单体,以改性的Fe3O4纳米颗粒为磁性载体,制备了对谷胱甘肽有特异识别性的磁性分子印迹聚合物,但没有实际应用。目前以改性的Fe3O4磁性纳米颗粒为磁性载体制备4-MI表面磁性分子印迹聚合物的研究尚未见文献报道。
本文以油酸改性的Fe3O4磁性纳米颗粒为磁性载体,以4-MI为模板分子,MAA为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂,在乙腈介质中制得了4-MI磁性印迹聚合物。考察了该印迹聚合物材料对4-MI的特异性结合性能,并将该印迹聚合物材料用于环境水样中4-MI的测定,取得了很好的效果。
FeCl3\56H2O、浓氨水(浓度为30% )、FeCl2\54H2O、苯(C6H6)为分析纯,购于天津市福晨化学试剂厂;油酸、正硅酸乙酯(TEOS)(纯度为99.99% )、4-MI、MAA、2,2-偶氮二异丁腈(AIBN)、EDMA、1-甲基咪唑(1-MI)、咪唑(IM)均购买于上海晶纯试剂有限公司。
SHZ-C型水浴恒温振荡器(上海浦东物理光学仪器厂), TU-1810紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司), Dmax2200pc型X射线衍射仪(XRD,日本理学公司), Spectrum Two红外光谱(FT-IR,美国PerkinElmer公司), JEM-2100透射电子显微镜(TEM,日本JEM公司), VSM 7404振动样品磁强计(VSM,美国Lakeshore公司)。
将60 mL 0.05 mol/L FeCl3\56H2O乙醇溶液置于三颈瓶中,搅拌并加热至50 ℃。加入 0.051 1 g盐酸羟胺5 min后,滴加氨水调整pH值至9～10。再逐滴缓慢滴加1 mL油酸,静置10 min,升温至70 ℃,持续搅拌30 min,降至室温。在外加磁场的作用下分离黑色沉淀,用50 ℃的无水乙醇洗涤沉淀3～5次,于30 ℃真空干燥。
100 mL圆底烧瓶中加入1 mmol 4-MI、0.36 mL MAA和20 mL乙腈,室温下超声分散,振荡30 min后静置过夜。三颈瓶中加入10 mL乙腈溶液,60 ℃恒温下加入3.8 mL EDMA、40 mg AIBN、10 mL油酸改性的Fe3O4,转入圆底烧瓶中的混合液,机械搅拌并通N2 30 min,密封后于60 ℃进行聚合反应24 h。聚合反应完成后,利用外加磁场使固液两相分离。用甲醇/乙酸(9 ∶ 1, v/v)作为洗脱剂洗脱48 h,以除去模板分子,再用甲醇洗脱5 h除去乙酸,于60 ℃真空干燥。
分别称取0.020 g Fe3O4@(4-MI-MIP)于25 mL锥形瓶中,加入10 mL 4-MI的乙腈溶液,在水浴恒温振荡器中振荡吸附24 h,取上清液测定剩余的4-MI的浓度,吸附量按公式(1)计算:
其中,Q为吸附量(mmol/g), C0和Ce分别为4-MI的初始浓度(mmol/L)和达到吸附平衡时原上清液中的浓度(mmol/L), V为溶液体积(L), m为Fe3O4@(4-MI-MIP)的质量(g)。
利用紫外分光光度法研究4-MI磁性印迹聚合物中主客体在乙腈中的相互作用。在乙腈中保持4-MI的浓度为0.2 mmol/L 不变,逐渐增大MAA的浓度,使模板分子与功能单体的摩尔比为1 ∶ 0、1 ∶ 0.5、1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5、1 ∶ 6、1 ∶ 7和1 ∶ 8,在紫外分光光度计上测得上述10种混合溶液的吸收曲线。
选取与4-MI结构类似的1-MI、IM和C6H6作为目标分子,配制以上4种物质浓度均为2 mmol/L 的乙腈溶液。称取0.02 g Fe3O4@(4-MI-MIP),在水浴恒温振荡器中振荡,静态吸附24 h,取上清液,测吸光度,根据公式(1)计算它们各自的吸附量。
取一定体积的地下水,过0.22 μ m的微孔滤膜,收集滤液备用。将滤液加入到含有磁性印迹聚合物的25 mL锥形瓶中进行振荡富集,之后在外加磁场的作用下实现固液分离,弃上清液,加入30 mL体积比为9 ∶ 1的甲醇/冰乙酸进行洗脱,再次利用磁场进行固液分离。将分离的洗脱液用N2吹干,并用1 mL流动相重新溶解,经0.22 μ m有机滤膜过滤,用HPLC检测分析。
加标样品的制备:取50、100和200 μ g/L 的4-MI标准溶液,加入到水样中。检测过程与上述水样相同。
色谱条件:Diamonsil C18 色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μ m);流动相为甲醇/水(80 ∶ 20, v/v);进样量为20 μ L;检测波长为210 nm。
采用共沉淀法制备油酸包覆磁性Fe3O4纳米材料,然后以4-MI为模板分子,MAA为功能单体,EDMA为交联剂,AIBN为引发剂,在乙腈介质中制备4-MI磁性印迹聚合物材料。油酸与Fe3O4纳米粒子表面以化学键结合,包覆于Fe3O4纳米粒子表面的油酸保留了可弯曲的 -CH = CH - 双键,增强了其在纳米粒子之间的空间位阻效应,可有效阻止Fe3O4纳米粒子间的团聚。4-MI与MAA通过氢键、静电作用结合形成主客体复合物。在引发剂的作用下,交联剂与主客体复合物、载体分子结合形成印迹聚合物。洗去模板分子4-MI之后,在Fe3O4纳米粒子表面的聚合物薄层中留下了大量4-MI的空穴,形成了4-MI表面分子印迹聚合物,其制备过程如图1所示。
功能单体与模板分子的相互作用直接影响MIPs对模板分子的识别和吸附性能,因为MIPs对模板分子的选择和识别主要是靠两者之间相互作用的方式和强度来实现的。模板分子与功能单体相互作用力越强,MIPs对模板分子的亲和能力就越强。因此在制备MIPs前有必要对模板分子与功能单体间的相互作用进行研究。本文采用了紫外吸收光谱法对模板分子4-MI与功能单体MAA的相互作用进行了考察。图2a和2b分别为在紫外分光光度计上测得的10种不同比例4-MI和MAA混合溶液的紫外吸收曲线和紫外吸收差光谱,4-MI与MAA的摩尔比分别为1 ∶ 0、1 ∶ 0.5、1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5、1 ∶ 6、1 ∶ 7和1 ∶ 8。从图2中可以看出,随着功能单体MAA量的增加,吸光度值升高,吸收光谱中最大吸收波长发生红移[15]。
理论上,模板分子与功能单体形成聚合物可以用公式(2)[17]来表示:
式中K是结合常数, Δ ξ c是在乙腈溶液中作用前后的模板分子与功能单体复合物的吸光度复合系数差， Δ A是功能单体与模板分子在乙腈溶液中作用前后的吸光度差,b0为功能单体的浓度,a0为模板分子的浓度,l为吸收池厚度。
以 Δ A/bn0对 Δ A作图可以推导出n的值,从而得知在乙腈溶液中模板分子与功能单体的作用模式,即在1个模板分子周围有几个功能单体与其作用,从而揭示分子印迹机理。
当n=1时, Δ A/b对 Δ A作图是一条直线,这表明在一定浓度范围内,模板分子与功能单体主要存在形式为1个4-MI与1个MAA相互作用形成主客体复合物。推测在乙腈中制备的分子印迹聚合物是通过氢键对模板分子进行识别的,但单独通过1个氢键来识别是不稳定的,因此空间效应也可能对识别有较大作用。
图3a为磁性Fe3O4纳米粒子的XRD图,2 θ 衍射峰分别出现在30.0°、35.5°、43.2°、53.8°、57.1°和62.9°处,对应XRD数据库中Fe3O4晶体反尖晶石结构(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)衍射面,可确定制备的Fe3O4纳米粒子晶体为反尖晶石结构。图3b为磁性Fe3O4@(4-MI-MIP)的图谱,由此可知磁性小球包覆后的印迹小球依然存在各特征峰,只是峰的强度相对减弱了,说明Fe3O4@(4-MI-MIP)也是反尖晶石结构,包覆并不会改变磁性微球的晶型,只会影响其X-射线衍射峰的强度。
Fe3O4纳米颗粒的红外图谱吸收峰应该在580和400 cm-1处,但由于纳米粒子的尺寸效应,基团频率发生位移[15]。图4a中的592.4和448.1 cm-1为Fe3O4中的 Fe - O 的伸缩及弯曲振动而引起的特征峰,1 384.4 cm-1为油酸中 -CH = CH - 特征吸收峰,2 480.3 cm-1为油酸中 - CH3 特征吸收峰。从图4b中可知4-MI磁性印迹聚合物具有Fe3O4的特征吸收峰。3 417.3 cm-1附近对应的宽吸收带是氢键的吸收峰,主要是4-MI与MAA相互作用引起的,1 186.2 cm-1附近处有较强的 - C - O - C - 的伸缩振动吸收峰,1 722.2 cm-1处为 - COOH 的吸收峰,这说明4-MI成功印迹到Fe3O4纳米颗粒的表面。
使用透射电子显微镜对磁性Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@(4-MI-MIP)的形貌特征进行分析。图5a为油酸改性后的Fe3O4纳米粒子的TEM照片,可见油酸改性后的Fe3O4分散性较好,其粒径在20 nm左右。图5b为Fe3O4@(4-MI-MIP)的TEM照片,该聚合物纳米粒子尺寸有所增大,约为24 nm。说明在Fe3O4纳米颗粒的表面包覆了一层薄的印迹层,这进一步证实制备的磁性印迹聚合物具有核(Fe3O4纳米颗粒)-壳(表面印迹层)结构,印迹层的厚度约为2 nm。
图6a和6b分别为油酸改性Fe3O4纳米颗粒和Fe3O4@(4-MI-MIP)的磁滞回线,可看出两种样品均没有磁滞现象,剩磁和矫顽力都为零,这表明样品具有超顺磁性。室温下,两种样品的比饱和磁化强度分别为60.67 emu/g和27.57 emu/g, Fe3O4@(4-MI-MIP)纳米颗粒比Fe3O4纳米颗粒的比饱和磁化强度低,原因可能是其表面包覆有非磁性层,对其磁响应性有一定的影响。图6c为Fe3O4@(4-MI-MIP)在外界磁场作用下的磁分离现象图。在没有外加磁场存在时,Fe3O4@(4-MI-MIP)均匀地分散在乙腈溶液中,呈黑色悬浮液(右);当有外部磁场存在时,黑色颗粒被快速吸引到有外加磁场的瓶壁一侧,溶液变得透明(左)。这说明Fe3O4@(4-MI-MIP)具有良好的磁响应性,作为磁性分离载体是可行的。
初始浓度是影响吸附过程的一个重要因素。在20 ℃下,分别称取0.020 g Fe3O4@(4-MI-MIP)和0.020 g 4-MI磁性非印迹聚合物Fe3O4@(4-MI-NIP),置于10 mL不同系列浓度4-MI的乙腈溶液中,在水浴恒温振荡器中振荡吸附24 h,测定上清液中剩余4-MI的浓度,计算吸附量。如图7所示,随着4-MI初始浓度的增大,Fe3O4@(4-MI-MIP)和Fe3O4@(4-MI-NIP)的吸附量都随之增加。但Fe3O4@(4-MI-NIP)对4-MI的吸附量增加的趋势相对于Fe3O4@(4-MI-MIP)要缓慢。当初始浓度大于2 mmol/L 后,Fe3O4@(4-MI-MIP)对4-MI的饱和吸附量随4-MI初始浓度的增大变化比较小,基本保持不变,吸附量达到26.28 mg/g,高于文献报道值[7]。Fe3O4@(4-MI-MIP)和Fe3O4@(4-MI-NIP)的吸附效果有明显的差异,这是因为印迹聚合物可通过氢键、静电和空间匹配识别作用对4-MI产生一定的吸附能力,存在较多记忆型的识别位点,这些识别位点对4-MI具有特异识别能力。因此,与Fe3O4@(4-MI-NIP)相比,Fe3O4@(4-MI-MIP)对4-MI的亲和能力更强,具有更高的吸附容量。
为进一步研究印迹聚合物的吸附特性,通过Scatchard模型对Fe3O4@(4-MI-MIP)的等温吸附数据进行分析。Scatchard模型方程[18]为:
其中Ct是4-MI的平衡浓度(mg/L), Q是每一个浓度下的平衡吸附量(mg/g), Qmax是印迹聚合物的最大表观吸附量(mg/g), KD为平衡解离常数(mg/L)。
图8为Fe3O4@(4-MI-MIP)的Scatchard曲线,可以看出Q/Ct对Q的线性关系均不太好,说明制备的磁性印迹聚合物对模板分子的结合位点的亲和力不是等价的,且从Scatchard曲线上数据点的分布来看,印迹聚合物与底物分子之间的识别和吸附主要由一种相互作用方式引起。对4-MI磁性印迹聚合物Scatchard曲线中近似直线的点进行线性拟合,低亲和力和高亲和力线性方程的相关系数分别为R=0.992 4 和R=0.987 2。计算拟合曲线的斜率和截距,可以得出低亲和力和高亲和力下最大表观吸附量Qmax分别为40.31和23.07 mg/g,平衡解离常数KD分别为64.85和30.41 mg/L。
如图9所示,4-MI的印迹和非印迹聚合物对4-MI的吸附量都比较大,而对其他几种结构类似物的吸附量却较低。从化学结构上分析,由于4-MI、1-MI和IM均具有咪唑阳离子结构,Fe3O4@(4-MI-MIP)在遇到这种结构时,就表现出优先吸附的性能,使得聚合物对这几种物质的吸附量较大。但Fe3O4@(4-MI-MIP)对4-MI的结合量明显大于Fe3O4@(4-MI-NIP)对4-MI的结合量,而二者对4-MI结构类似物IM的结合量有明显的差别,这说明在Fe3O4@(4-MI-MIP)上存在能够特异识别4-MI的印迹空穴,印迹和非印迹聚合物对4-MI的吸附差别较大,表明所合成的4-MI印迹聚合物材料对模板分子具有良好的吸附选择性。
在4-MI浓度为1 mmol/L 和2 mmol/L 时,Fe3O4@(4-MI-MIP)的吸附量随时间的变化如图10所示。磁性印迹聚合物在前40 min对4-MI的吸附速率很快,40 min后吸附速率逐渐减慢并基本达到吸附平衡。这是因为在最初吸附的40 min内,Fe3O4@(4-MI-MIP)聚合物表面存在大量的吸附活性位点,与4-MI结合的速率较快。随着时间的延长,聚合物表面的吸附活性位点逐渐被4-MI占据,吸附速率随之减慢,直至达到吸附平衡。
常用来描述吸附动力学的模型为准一级和准二级速率模型,准一级速率方程也称为Lagergren一级动力学方程。两个模型通常可分别线性化[19]为:
其中Qt为时间t时的吸附量(mg/g), Qe为磁性材料的平衡吸附量(mg/g), k1(min-1)和k2(g/(mg\5min))分别为准一级、准二级速率参数。
用准一级和准二级反应动力学方程对图10中的实验数据进行拟合,结果见表1和表2。根据回归方程的相关系数及实验测定与公式计算的Qe值的差别确定反应级数。结果表明,Fe3O4@(4-MI-MIP)对4-MI的吸附过程与二级动力学模型相吻合。采用二级动力学模型计算的吸附量值(Qe-cal)与实验测得的吸附量值(Qe-exp)非常接近,相关性较好。大多数情况下,Lagergren一级动力学方程只能应用于吸附过程的初始阶段而不是整个阶段,而二级反应动力学模型假定限速步骤可能为化学吸附,适用于很多吸附研究[20]。
为了检验所制备的Fe3O4@(4-MI-MIP)的实际应用性能。用RPLC法绘制了4-MI标准样品的线性回归方程。采用加标回收法,在处理后的地下水样品中添加不同量的4-MI,每个浓度水平测3次,实验结果见表3。回收率达91.2% ～97.6% ,相对标准偏差为0.7% ～3.9% ,优于文献[21],本文中以3倍信噪比(S/N)计算的检出限可以达到10 μ g/L 。经过6次重复吸附、解吸实验,其回收率仍达85%以上,说明该印迹聚合物可以用于水样中的痕量4-MI的富集和分离测定。
利用表面印迹聚合法制备了4-MI磁性分子印迹聚合物,以MAA为功能单体,通过紫外光谱分析发现,在研究的浓度范围内,主客体主要存在形式为1个4-MI与1个MAA相互作用。对该磁性分子印迹聚合物对4-MI的吸附动力学进行了研究,利用准一级动力学方程与准二级动力学方程对数据进行拟合,结果表明,磁性分子印迹聚合物材料对4-MI的吸附过程遵循准二级动力学方程。将所合成的磁性分子印迹材料作为磁性固相萃取吸附剂,结合高效液相色谱用于地下水样中4-MI的检测,取得了较满意的结果。
2015, Vol. 33 Issue (12): 1234-1241
PDF (1724KB)
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