手性农药(chiral pesticides)具有靶点明确,药效快,杀虫效率高等特点,在农业生产中得到越来越广泛的应用,成为高效农药的重点发展方向之一[1]。手性农药的杀虫活性通常源自其中的一个对映体,其他对映体不仅活性低、难降解,甚至可能产生人体毒性。例如:除草剂异丙甲草胺,它的S-型对映体有很好的除草活性,而R-型对映体无除草活性,有致癌作用[2]。三唑类手性杀菌剂对映体活性也不同,已被美国环境保护署(EPA)列为潜在人类手性致癌物[3,4]。目前,大多数手性农药仍以外消旋形式施用,这给食品安全带来了新问题。因此,不断研发新型的手性分离材料,建立快速测定农药对映体含量的新方法,对深入了解对映体的杀虫活性和人体毒性,乃至保障食品安全都具有重要的研究意义。
三唑类杀菌剂是一类典型的手性农药,广泛用于农业生产、果蔬保鲜和食品工业中。粉唑醇(flutriafol)是一种具有铲除、保护、触杀和内吸活性的高效手性杀菌剂,对担子菌和子囊菌引起的许多病害具有治疗和防护作用[5],其结构见图 1。有关粉唑醇等三唑类农药对映体的拆分方法主要包括毛细管电泳法[6,7]、超临界流体色谱法[8,9]和高效液相色谱法[10,11,12,13,14,15,16,17,18]。液相色谱法无需样品气化,柱容量高,分离条件温和,仪器技术日趋成熟,已成为三唑类农药手性拆分的主流方法。Zhou等[10]采用日本Daicel公司Chrialcel OD手性柱(250 mm×4.6 mm),以正己烷-乙醇(90:10,v/v)为流动相,在流速0.6 mL/min和15 ℃条件下拆分粉唑醇对映体的分离度为1.37。武彤等[11]采用正相高效液相色谱研究了6种三唑类手性农药在Chiralcel OD-H和Chiralcel OJ-H手性柱(250 mm×4.6 mm)上的手性分离,在OD-H柱上成功地拆分了粉唑醇,流动相为含20%(v/v)异丙醇的正己烷,而OJ-H柱没有发现拆分能力。Wang等[12,13]涂覆自制的纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相,在正相模式下拆分了烯唑醇等5种三唑类农药,拆分粉唑醇对映体的流动相为正己烷-异丙醇(98:2,v/v),流速1 mL/min,需要在低温(0 ℃)下拆分,两对映体的保留时间为29.519和41.173 min。Liu等[14]采用氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑离子液溶解纤维素,然后涂覆到硅胶上,制备了纤维素-三(3,5-二甲基氨基甲酸酯)柱,在正相模式下手性分离7种三唑类农药,拆分粉唑醇适用的流动相为含5%(v/v)异丙醇的正己烷,流速1 mL/min,柱温5 ℃,分离度为1.26,但分析时间较长(约65 min)。
目前涂敷型纤维素手性固定相比较通用,一般在正相色谱条件下使用。在反相模式下纤维素易从硅胶上脱落,温度也不宜高,溶剂范围窄,且达到基线分离时间较长(30～60 min)。近年来出现了制备键合纤维素柱在反相色谱条件下拆分三唑类农药的研究探讨。Qiu等[15]采用菲罗门公司的键合型Lux Cellulose-1柱和纤维素-三(3,5-二甲基氨基甲酸酯)柱,在反相模式下研究了9种三唑类农药的拆分,采用甲醇-水(70:30,v/v)为流动相,粉唑醇分离度为1.39。田芹等[16]也采用类似方法键合纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相(CDMPC)和直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相(ADMPC),在反相色谱条件下拆分了6种三唑类农药对映异构体,粉唑醇在CDMPC上没有拆分,在ADMPC上得到部分拆分,分离度为1.05。键合过程常常会影响微晶纤维素的沟槽结构,降低手性识别性能,另外纤维素高分子聚合物的键合过程也不易重现。除上述报道的三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)衍生化纤维素固定相外,也有采用(S,S)-Whelk O1 Pirkle型手性柱和柱前衍生法拆分三唑类农药的报道[17]。而衍生化β-环糊精一般用作毛细管电泳手性添加剂拆分三唑类农药,用作固定相的直接拆分甚少。
最近,我们实验室程彪平等[18]制备单键合臂的β-环糊精固定相,并在反相色谱条件下用于三唑类手性农药的拆分,拆分时间较短(＜30 min),粉唑醇的分离度可达1.14。在上述基础上,本文将对甲苯脲芳香基团引入β-环糊精端口,制备了一种新的对甲苯脲衍生化β-环糊精键合有序介孔SBA-15固定相(UCDP)。在室温下实现了粉唑醇对映体的快速基线分离,分离度为1.99,分析时间在20 min内。以香蕉作为果蔬样品,建立了快速测定粉唑醇对映体的新方法,自制的环糊精手性固定相可直接降低测试成本,温和的测试条件增强分析方法的实用性,期望将来可更广泛地用于果蔬中该手性农药的评价及安全分析。
Waters ZQ-4000/2695高效液相色谱-质谱联用仪,配有2996型二极管阵列检测器,Masslynx 4.1色谱工作站(美国Waters公司); 5700型傅里叶红外光谱仪(美国Nicolet公司); Vario EL Ⅲ型元素分析仪(德国Elementar公司); Diamond TG/DTA型同步热分析仪(美国Perkin Elmer公司); AW-60色谱装柱机(美国Haskel公司); Milli-Q超纯水(美国Millipore公司); DS-1高速组织捣碎机(上海标本模型厂); HSC-12A氮吹仪(南京科捷分析仪器有限公司); DF-2型集热式磁力搅拌器(金坛市鑫鑫实验仪器厂); KQ-100E型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); BSA-224S赛多利斯天平(精度0.0 001 g,德国Sartorious公司); TGL-16C高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。
三嵌段聚合物P123(Mr 5 800)、正硅酸乙酯(TEOS)和3-异氰酸丙基三乙氧基硅烷购于Sigma公司;6-单氨基β-环糊精(分析纯,山东滨州智源生物科技有限公司); 1,3,5-三甲苯(TMB)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(分析纯,购自阿拉丁试剂上海公司); R-粉唑醇和粉唑醇外消旋标准品(纯度≥99%)(Sigma公司);甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)为色谱纯(美国Tedia公司);二氯甲烷和氯化钠(国药集团化学试剂有限公司);其他试剂均为分析纯;所用水为超纯水。Welchrom氨基柱(1 000 mg/6 mL,月旭材料科技上海有限公司)。香蕉样品从超市随机购买。
本实验使用自制的有序介孔二氧化硅SBA-15,粒径分布为2.5～4.5 μm,孔径约为25 nm,比表面积为420 m2/g,类球形颗粒,表征图谱及合成方法参照文献[19],透射电镜影像显示制备的SBA-15具有有序的孔道。
环糊精类键合相的制备路线如图 2所示,主要合成过程如下:称取3.0 g干燥的6-氨基β-环糊精(1),搅拌下溶解于30 mL无水DMF中,在氮气保护下室温磁力搅拌反应12 h。然后减压蒸除大部分溶剂,加入100 mL丙酮后析出沉淀,过滤,用热水重结晶两次,60 ℃下真空干燥10 h,得到甲基苯脲β-环糊精配体(2)。
将干燥的配体重新溶解于40 mL无水DMF中,加入0.66 mL 3-异氰酸丙基三乙氧基硅烷,氮气保护下室温搅拌30 min,然后在80 ℃下继续反应8 h,得到含环糊精的偶联剂的溶液。向溶液中加入6 g干燥的SBA-15,补加20 mL DMF,在110 ℃油浴中反应10 h。冷却后,依次用DMF、丙酮和甲醇反复洗涤,直至洗液清亮为止,并用丙酮为溶剂索氏提取12 h,得到甲基苯脲β-环糊精键合SBA-15固定相(3)。置于真空干燥箱中,干燥10 h后送检元素分析、红外光谱分析和热重分析等。
称取约2.5 g自制的环糊精键合SBA-15固定相,加入35 mL丙酮,超声使固定相均匀分散。以甲醇为顶替剂,在恒压(34.5 MPa)下将手性固定相均匀填入一根不锈钢色谱柱(150 mm×4.6 mm)中。新填装的柱用甲醇和水反复冲洗,最后用流动相平衡,直至基线稳定后进样分析。以联苯为样品,甲醇-水(40/60,v/v)为流动相,在流速1.0 mL/min和检测波长254 nm的条件下测得柱效为28 461块/米。
精密称取0.010 0 g粉唑醇外消旋标准品于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,过滤,得到1.0 mg/mL的外消旋粉唑醇储备液,即每个对映体质量浓度为500 mg/L。标准溶液于冰箱中(4 ℃)避光保存,临用前摇匀,恢复至室温,用甲醇稀释至所需浓度,得到一系列不同浓度的粉唑醇标准溶液。用前经0.22 μm滤膜过滤,超声脱气,然后进样分析。
用食品捣碎机将香蕉磨成果浆,分别称取香蕉试样10.00 g于3个(1号、2号、3号)50 mL离心管中,在1号离心管中加1 mL 50 mg/L外消旋粉唑醇标准样品(样品1);在2号离心管中加1 mL 200 mg/L外消旋粉唑醇标准样品(样品2);在3号离心管中不加外消旋粉唑醇标准样品(空白),然后分别加入20.0 mL乙腈,在离心机中高速(104 r/min)离心2 min,加入3.0 g氯化钠,振摇1 min,再离心5 min。吸取上层清液10.0 mL,在氮吹仪上吹干,加入2.0 mL甲醇-二氯甲烷(5:95,v/v)混合溶剂溶解残渣。用5.0 mL上述混合溶剂预先淋洗氨基小柱,等到液面近干时,把提取液添加到氨基小柱里,然后用10.0 mL混合溶剂洗脱,洗脱液在氮吹仪上吹干,加入5.0 mL甲醇定容,用0.22 μm滤膜过滤,待测。
选用甲苯脲β-环糊精手性色谱柱(150 mm×4.6 mm)。流动相用不同体积比的甲醇-水或乙腈临用时配制,用前经0.45 μm滤膜过滤,超声脱气10 min。流速0.5 mL/min,检测波长205 nm,柱温25 ℃,进样量10 μL。所有样品至少平行测定两次。
对合成的手性固定相进行红外光谱表征(见图 3)。由红外光谱图可以看出3 434.78 cm-1处为环糊精及硅胶残存O-H伸缩振动峰;2 934.78和2 886.96 cm-1处为C-H伸缩振动峰;1 652.17 cm-1处为脲基的C=O伸缩振动峰;1 552.17cm-1为苯环的骨架振动峰;1 200.00、1 134.78、1 069.57 cm-1附近的宽峰为环糊精C-O及基质的Si-O-Si的吸收峰。同时，所制备的固定相具有手性分离功能也说明环糊精被成功地键合到固定相表面。
干燥后的固定相进行元素分析。结果为:C,2.96%; H,0.49%; N,0.49%。然后根据碳含量计算出固定相的键合量为0.111 μmol/m2。
对合成的手性固定相进行热重分析(升温速度:10 ℃/min;记录温度:室温～800 ℃)。发现在高于250 ℃时,固定相才开始明显失重,说明所制备的环糊精键合固定相有较好的热稳定性和化学稳定性。
与涂覆型纤维素固定相相比,目前衍生化β-环糊精键合相在拆分三唑类农药方面更具潜力。最近,我们在以前报道[18]的单键合臂的β-环糊精固定相的基础上,制备了一种对甲苯脲单衍生化β-环糊精固定相,脲基固定相结构稳定[20],脲羰基和氨基同时拥有氢键接受体和给体的性质,引入的甲苯芳基可增强与溶质的π-π作用。室温下,使粉唑醇的分离度从1.14提高到1.99,分析时间进一步缩短至20 min内。
实验中分别采用了甲醇水溶液、乙腈水溶液作为流动相,都达到理想的分离效果。由于两者分离效果相差不大,但是甲醇更便宜、毒性相对较小,适用于大规模使用,因此本实验选用甲醇水溶液作为流动相。
探究甲醇用量对分离效果的影响。分别配制了5种流动相:①25%(v/v)甲醇+75%水、②30%(v/v)甲醇+60%水、③35%(v/v)甲醇+65%水、④40%(v/v)甲醇+60%水、⑤45%(v/v)甲醇+55%水。对映体分离度分别为:1.67、1.98、2.09、1.99、1.57。45%甲醇流动相中甲醇含量高,能够提高洗脱速度,但分离度较差;40%甲醇流动相可以兼顾洗脱速度和分离度(见图 4);而25%、30%、35%甲醇流动相分离度较好但洗脱速度大大降低。综上所述,选用40%甲醇+60%水为流动相进行后续定量测定。
流动相的流速分别采用0.3、0.5、0.7和1.0 mL/min。实验发现当流速过高时溶质与固定相作用力不够,分离度不理想;当流速过低时,分析时间大大延长。综合考虑分离度和分析时间,选取流速为0.5 mL/min。
温度的变化可能引起手性固定相手性空腔的构象发生改变,从而导致对映体选择性发生改变[21]。本文考察了温度对分离度和分析时间的影响,25、30、35、40、45 ℃时的分离度分别为1.99、1.73、1.45、1.19、0.95。在较低的温度下,己唑醇两种对映体分离较好。具体实验也证明了这一结论,温度升高，对映体出峰加快,但分离度变差；在25 ℃柱温下可以兼顾分离速度和分离度,对映体可以达到较好的分离。因此,选择柱温25 ℃,室温也容易控制。
用紫外检测器对粉唑醇标准品做多波长扫描(见图 5),发现在波长262 nm有紫外吸收,但吸收很弱,而205 nm波长处粉唑醇的紫外吸收很强。流动相中的甲醇为色谱级,甲醇空白实验基线较平稳,在205 nm进行检测灵敏度高,稳定性较好。
通过以上研究发现优化的手性分离色谱条件为:流动相为40%(v/v)甲醇+60%(v/v)水,流速0.5 mL/min,柱温25 ℃,检测波长205 nm,进样量10 μL。在上述条件下对粉唑醇对映体进行拆分,色谱图如图 4所示,能达到基线平稳的较好分离,同时拆分的时间也很短,分离度为1.99,分析时间在20 min以内。
从上述实验结果可知,用40%(v/v)的甲醇水溶液作流动相,粉唑醇两对映体在新制备的对甲苯脲单衍生化β-环糊精固定相上有较强的保留(13.25、15.13 min)和较大的分离度(1.99)。说明在反相色谱条件下,粉唑醇与配体间存在较强的作用力,溶质应该进入了环糊精的腔体,对甲苯脲衍生化可以改变其疏水性空腔的形状和大小,使两对映体与环糊精配体形成稳定性不同的包结配合物,分离度得以提高。
研究还发现,由于粉唑醇的手性碳上含有羟基,它的分离度通常比其他不含羟基q ````````````````的三唑类农药分离度更高。说明包结作用发生后,粉唑醇手性碳上的羟基与固定相配体上引入的脲羰基和氨基间存在氢键作用。
此外,引入甲苯芳基可增强固定相与溶质间的π-π作用,对芳香溶质有较好的定位作用和空间识别作用。所以,氢键和π-π等多种协同作用对所制备的色谱柱快速拆分粉唑醇对映体有重要的贡献。
三唑类杀菌剂属典型的手性农药,广泛用于农业生产、果蔬保鲜和食品工业中。本文以水果(如香蕉)为例,建立粉唑醇对映体含量测定的新方法。
用甲醇适当稀释已配制的外消旋粉唑醇储备液,质量浓度分别为1.0、5.0、25.0、125、250 mg/L。由于外消旋的粉唑醇含等量的R-和S-对映体,每个对映体的质量浓度为0.5、2.5、12.5、62.5、125 mg/L。按最佳色谱分离条件测定上述标准溶液,以峰面积(y)为纵坐标,粉唑醇对映体的质量浓度(x,mg/L)为横坐标绘制标准曲线,观察到良好的线性相关性。经R-粉唑醇标准品保留时间比对,证明此色谱柱上外消旋粉唑醇中R-粉唑醇先流出,S-粉唑醇后流出。回归方程如下:R-粉唑醇,y1=1 560.6x1+334.7,r1=0.999 7;S-粉唑醇,y2=1 523.9x2+223.8,r2=0.999 7。
结果表明,粉唑醇对映体在0.5～125 mg/L范围内线性关系良好。按3倍信噪比确定单个对映体的最低检出质量浓度为0.06 mg/L。
分别称取10.00 g香蕉样品3份,其中一份做空白,另两份添加不同量的粉唑醇标准品,按1.5节方法进行样品前处理后测定。通过测得量的平均浓度与加入量之比来计算平均回收率(见表 1)。香蕉空白样品和加标样品的色谱图见图 6。
由于对映体的分离测定受流动相的浓度、组成、pH值、检测波长等多种因素影响,样品测定结果的重现性是评价分析方法的重要指标之一,有必要考察方法的重现性。在香蕉基质中添加的粉唑醇,连续进样4次,粉唑醇峰面积的RSD为0.35%和0.36%(n=4)。该结果表明甲基苯脲单衍生化的β-环糊精手性柱测试结果无显著性差异,色谱柱和测定方法有较好重现性和稳定性。
自制了甲基苯脲单衍生化的β-环糊精液相色谱手性固定相,将新固定相用于手性农药粉唑醇对映体的拆分。通过优化分离条件,成功地拆分了粉唑醇对映体,在此基础上建立了快速测定香蕉中粉唑醇对映体残留量的新方法。新固定相的制备方法简便、便宜,可降低分析成本,且手性选择性较高,分析时间较短,流动相廉价易得,实用性强。在手性农药食品安全分析中存在良好的应用前景。
2016, Vol. 34 Issue (3): 314-320
PDF (1214 KB)
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