近年来,由于农药的大量使用导致农药残留超标问题频频出现,农药残留对食品安全性及人类健康产生的负面作用日益凸显出来,受到各国政府及公众的广泛关注。为此,世界许多国家和地区都制定了严格的农药残留限量标准。然而,随着科技的发展,农药新品种越来越多(高达 1 400 多种),在农作物生产过程中常采用不同种类的农药复配和混配的方式,且在检测过程中常出现主要残留超标农药不尽相同的现象,若采用单一或几个不同农药残留的检测方法很容易漏检某些农药,若对其进行逐一检测则检测成本十分昂贵,耗时很长^{[1, 2, 3, 4]}。因而,为了有效控制农药残留,世界各国开始不断探索快速、高效的农药多残留的筛查、确证分析技术,希望通过分析检测掌握农药残留状况,为农药残留的有效控制提供科学依据。蔬菜、水果中农药残留的高低是衡量食品安全的重要指标,而频频出现的农药残留超标问题基本上都出现在各类蔬菜和水果产品中。因此,各国都在不断寻求开发蔬菜和水果中农药多残留快速分析检测技术。

农药多残留检测样品前处理技术主要包括传统的液液萃取、固相萃取^[5]、基质固相分散萃取^{[6, 7]}、固相微萃取^[8]以及QuEChERS^{[9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22]}等。QuEChERS方法由Anastassiades等^[7]于2003年提出,经Lehotay验证,适用于测定水果和蔬菜中农药多残留。该方法快速、简便、价格低廉,可以实现农药的多残留分析,一经发明就立即吸引了大量农药残留研究者的注意,近年来在国际上迅速发展,成为一种用于农产品污染物检测的快速样品前处理技术。农药多残留仪器检测方法主要包括气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^{[18, 19, 20]}、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)^{[12, 15, 16, 17]}以及高分辨质谱法(Q-TOF MS)^{[21, 22]}等。GC、LC方法与色谱-质谱联用方法相比,不但存在定性能力不足的问题,且在一次性可检测的农药个数方面存在较大局限性;Q-TOF MS可采集更为全面的化合物信息,在定性方面优势突出,但由于该仪器价格过于昂贵,目前在检测领域应用率不高,尚待普及;GC-MS、LC-MS在检测机构基本普及,并被广泛应用于多农残检测中,GC-MS与LC-MS方法相比,GC-MS多适用于相对分子质量较低、易挥发的农药检测；LC-MS的适用范围较广,且液相较为稳定,因而LC-MS在农药多残留检测中应用越来越广。以QuEChERS为样品前处理方法,LC-MS/MS为检测仪器进行农药多残留检测的文献已有较多报道,但多集中在同类型或较少个数农药的分析检测研究^[16],对于几百种农药的多残留检测往往需要反复测定。本文采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)能快速稳定地分离农药,15 min内既可完成有效分离;前处理方法相同,仪器条件相同,一次进样即可测定蔬菜中250种或更多农药,并可应用于实际样品检测中。

250种农药标准品:纯度≥95%(Dr. Ehren-storfer GmbH或Sigma公司);甲醇、乙腈(色谱纯,Merck公司),甲酸(纯度为88% ,色谱纯,天津光复精细化工研究院)、乙酸、无水乙酸钠(CH₃COONa)、甲酸铵、氯化钠、无水硫酸钠(Na₂SO₄)、无水硫酸镁(MgSO₄)均为分析纯。实验用水均为超纯水(Millipore公司超纯水器制备,电阻率为18.2 M Ω ·cm)。吸附剂:乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨化碳(GCB)均购于Waters公司;C18购于Agilent公司。

标准溶液的配制:称取10 mg标准品于10 mL的棕色容量瓶中,以甲醇定容至刻度;对于部分不溶解的农药,可以选择乙腈或丙酮等试剂辅助溶解,得到1 mg/mL 的单标储备溶液。根据检出限的不同,参照GB/T 20769-2008,将目标农药分成6组配成整体约10 μ g/mL 的标准溶液,存放于-18 ℃冰箱中,可存放半年。

ACQUITY^TM超高效液相色谱仪、Quattro Premier XE质谱仪(Waters公司);超声波清洗器(宁波海曙超声仪器公司);旋转蒸发仪(R-210,BVCHI公司); TG16-WS高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司); SC-8L-150数控固相萃取仪(广州智真生物科技有限公司);氮吹仪(上海安谱仪器公司);自动漩涡混合器(天津药典标准仪器厂)。

UPLC条件 色谱柱:Waters ACQUITYTM UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m);柱温:40 ℃;样品室温度:4 ℃;进样体积:10 μ L。流动相A:含0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液;流动相B:0.1%(v/v)甲酸水溶液;梯度洗脱程序:0～0.25 min,10%A; 0.25～8.00 min,10%A线性上升至100%A; 8.00～12.25 min,100%A; 12.25～12.35 min,100%A线性降至10%A; 12.35～15.00 min,10%A。流速:0.3 mL/min。

MS/MS条件 离子源:电喷雾电离,正离子模式(ESI⁺);毛细管电压:3.08 kV;锥孔电压:40 V;射频透镜1(RF lens 1)和射频透镜2(RF lens 2)的电压均为12.0 V;离子源温度:120 ℃;脱溶剂温度:350 ℃;脱溶剂气流量:800 L/h。采用多反应监测(MRM)模式。各农药优化的质谱采集参数见附表 1(http:/ /www.chrom-china.com/UserFiles/File/sp1509026tables.pdf)。

称取15 g已研磨粉碎的样品于50 mL塑料离心管中,加入15 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液,-18 ℃冷冻约10 min,加入1.5 g CH₃COONa和6 g MgSO₄,迅速摇匀,于 10 000 r/min 转速下均质提取30 s,于 4 000 r/min 转速下离心5 min;取上清液2 mL,加入300 mg MgSO₄、200 mg PSA、10 mg GCB和100 mg C18,迅速摇匀或涡旋混匀1 min,于 3 500 r/min 转速下离心1 min;上清液过0.22 μ m有机滤膜,滤液供分析。

QuEChERS方法最早由美国Anastassiades等^[7]建立,多用于水果、蔬菜中农药残留检测的前处理。其技术核心是在水果、蔬菜的提取液中直接加入除水剂和杂质吸附剂,提取液经离心后直接进行色谱-质谱分析。本实验选用250种代表性农药作为前处理技术开发的研究对象,其中包括常用的能用LC-MS检测的有机磷类、氨基甲酸酯类等多类农药,参照AOAC官方方法2007.01^[23]和欧盟标准方法EN 15662^[24],引入C18作为净化剂,通过对韭菜中250种不同类型农药前处理条件的摸索,优化得到最佳的前处理方法。

农药的提取多用乙腈、甲醇以及酸性的甲醇或乙腈等。本研究以韭菜为研究对象,在添加水平为100 μ g/kg 下,分别比较了甲醇、乙腈、含1%(v/v)乙酸的甲醇溶液、含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液。结果表明,甲醇、含1%(v/v)乙酸的甲醇溶液的提取液较为浑浊,可能由于甲醇对很多物质的溶解力较好,在提取过程中提取出的杂质较多。本实验重点比较了乙腈、含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液对农药提取效率的影响。结果发现,采用乙腈作为提取剂,约有80%的目标农药的提取效果与含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液的提取效果相当,20%农药(如三氯杀螨醇等)的提取效果明显低于含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液的提取效果,与林涛等^[16]的结果相符。其原因在于部分农药在乙腈中不太稳定,1%(v/v)乙酸的加入相当于加入了保护剂,从而解决了该问题。同理,在配制工作液时,加入1%(v/v)乙酸来保证农药的稳定性。

已报道QuEChERS前处理方法多采用无水硫酸镁替代无水硫酸钠作为脱水剂,因为相对于无水硫酸钠,无水硫酸镁具有更强的脱水效果、更细的颗粒,从而可更有效地提取农药。在提取过程中加入的无水乙酸钠和无水硫酸镁的量参考文献[23, 24]进行,即样品、无水乙酸钠、无水硫酸镁按1: 0.1: 0.4的质量比进行提取。实验过程中发现,无水硫酸镁在吸水过程中放热剧烈,若样品处于室温状态,无水硫酸镁的加入导致产生大量的热量,在振摇过程中产生的热气会将离心管的盖冲开,不但造成提取物损失,并存在一定的安全隐患。实验尝试了将样品置于冷柜中一段时间(约10 min左右)拿出,再加入无水硫酸镁,此时放热比较温和,不会出现很大的热气,而放出的热量刚好使提取样品的温度约为40 ℃左右,这个温度既不会导致农药分解,还可以提高提取效率。

常用的净化剂有PSA、GCB、C18等固相萃取柱常用填料。PSA是实验室经常用来消除各种有机酸、色素以及一些糖和脂肪的有效吸附剂,GCB对色素有强烈的吸附效果,C18则在去除非极性杂质方面效果良好,考虑到MgSO₄的加入量会影响到除水效果,进而影响后续净化剂的吸附效果,本实验以2 mL离心后的提取上清液为研究对象,以MgSO₄、PSA、GCB、C18的用量为考察因素,在100 μ g/kg 加标水平下对净化条件进行了优化。

优化方案1:固定PSA用量为50 mg,考察加入的MgSO₄用量对净化效果的影响。在2 mL提取上清液中分别加入50、100、200、300、400、500 mg MgSO₄。实验发现,在2 mL提取液中加入50 mg PSA、300 mg MgSO₄时的效果较好,平均回收率可达到82.4%(见图 1);但从肉眼观察即可发现,此时提取液颜色较深,杂质较多,上机分析后质谱仪的一级锥孔较易污染。

图1

Fig. 1

图1 mL提取液中MgSO4的用量对250种农药平均回收率的影响 Fig.1 Effect of the amount of MgSO4 added in 2 mL extract on the average recoveries of the 250 pesticides

优化方案2:固定MgSO₄用量为300 mg,考察PSA加入量对净化效果的影响。在2 mL提取上清液中分别加入50、100、200、300、400 mg PSA。结果表明,随着PSA的加入,提取液颜色变浅,从数据分析来看,随着PSA的加入,农药平均回收率增高(达95%左右),而且回收率达到60% ～120%的农药比例明显增大(见图 2);当PSA用量达到200 mg时基本达到平衡,过量加入反而会对回收率有不利的影响。

图2

Fig. 2

图2 2 mL提取液中PSA用量对250种农药平均回收率的影响 Fig.2 Effect of the amount of PSA added in 2 mL extract on the average recoveries of the 250 pesticides

优化方案3:固定MgSO₄(300 mg)、PSA(200 mg)用量,考察GCB用量对净化效果的影响。在2 mL提取上清液中分别加入5、10、15、20、25 mg GCB。从实验过程可以明显看出,GCB对色素有强大的吸附能力,随着GCB用量的不断增大,提取液颜色迅速变浅,在加入300 mg MgSO₄、200 mg PSA和10 mg GCB净化剂条件下,提取液颜色已基本呈现无色透明。从上机分析数据来看,GCB虽然对色素有强烈的吸附能力,但同时对部分农药也有一定的吸附,特别是对一些平面结构的农药吸附力较强。综合考虑,在2 mL提取液中加入300 mg MgSO₄、200 mg PSA、10 mg GCB组合净化剂较好,在此净化条件下,农药的平均回收率可达95.5% ,所有农药回收率均在60% ～120%范围(见图 3),提取液也较干净。

图3

Fig. 3

图3 2 mL提取液中GCB用量对250种农药平均回收率的影响 Fig.3 Effect of the amount of GCB added in 2 mL extract on the average recoveries of the 250 pesticides

优化方案4: C18常用于去除样品中的非极性杂质,本文也对其用量进行了考察。固定MgSO₄(300 mg)、PSA(200 mg)、GCB(10 mg)用量,在2 mL提取上清液中分别加入10、50、100、200 mg C18。从实验数据可以看出,C18的加入对回收率的影响不大,但从上机分析时可以看出,随着C18的加入,空白样品的基线噪声明显降低,说明C18有一定的净化效果,从仪器响应直观发现,100 mg C18的加入基本已经平衡,因而,最终选择在2 mL提取液中加入300 mg MgSO₄、200 mg PSA、10 mg GCB和100 mg C18的组合净化剂进行净化。

应用LC-MS联用仪进行分析检测时,为了保持较好的峰形,通常原则是上机分析样液和初始流动相及弱洗针液组成保持一致,有文献在利用QuEChERS净化处理后,选择用水稀释以达到和初始流动相保持一致。本研究的初始流动相为乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(10: 90,v/v),提取剂为乙腈,若要做到上机液和初始流动相保持一致需进行10倍的稀释,但相应地检出限会升高,且增加了一个步骤。本文将净化后的乙腈提取液直接进行上机分析,发现出峰时间及峰形与标准样品并无明显的差异,因而本文采用提取液净化后直接进样分析。

在加入CH₃COONa和MgSO₄混合物之前,样品一定要处于较冷的状态,因为MgSO₄吸水过程放热较为剧烈,在振摇的过程中形成的热气流会将离心管盖冲开喷溅出来,不但造成目标物的损失还存在较大的危险。

在向提取液中加入CH₃COONa和MgSO₄及MgSO₄和PSA的净化基质后,应迅速振摇分散,以免形成结块;若形成少许结块后可在 10 000 r/min 下均质30 s,将结块打碎,做到分散均匀。否则,会影响提取及净化效果。

农药化合物种类较多,结构差异也较大,有的适合采用正离子模式采集,有的适合采用负离子模式采集,但采用正离子采集的农药占大多数,根据已有文献和现有国家标准,目标化合物适合采用正离子模式采集,故本实验选用正离子模式对农药进行采集。

在正离子采集模式下,适当浓度酸的加入有助于目标物质子化,从而提高目标化合物灵敏度。在流动相体系下,采用流动注射泵连续进样的模式进行质谱条件的优化,确定了各化合物的锥孔电压、碰撞电压、离子源温度、去溶剂气温度及流量、碰撞气流量及定性定量离子等质谱参数,使样品液中每种农药的离子化效率达到最佳,获得的最佳质谱条件如附表 1所示。

从文献和标准方法来看,农药检测的色谱柱大部分采用T3柱和C18色谱柱^[15]。为此,实验比较了Waters公司生产的ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m)、ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m)对250种目标农药的分离效果,两者对250种农药的分离都能达到LC-MS联用检测的要求,T3柱的出峰时间较C18早,但峰形不如C18好。综合考虑,最终选择ACQUITY UPLC BEH C18柱作为本研究的分离柱。由于该色谱柱填料粒径为1.7 μ m,因而与常规色谱柱相比可承受更大的压力,具有更高的灵敏度和分离能力,且分离时间较常规色谱柱大大缩短。在1.3节的梯度洗脱条件下,250种农药在15 min内可完成有效分离。

流动相的组成不仅会影响到目标化合物的保留时间和峰形,最重要的是还会影响到离子化效率,从而影响灵敏度。实验考察了甲醇-水、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液、甲醇-10 mmol/L 甲酸铵、乙腈-水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液、乙腈-10 mmol/L 甲酸铵6种流动相体系在不同梯度下对目标农药在分离度、峰形、灵敏度方面的影响。结果显示,甲酸铵和甲酸的引入不仅可以提高目标农药的灵敏度,还可以改善其峰形;两者相比较,引入甲酸的体系分离效果更好,因而考虑在甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液两种体系中选择。单从仪器条件考虑,目标农药在以甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液的流动相体系下的灵敏度较在乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液流动相体系下的灵敏度稍高,但考虑到前处理过程中采用的提取剂为乙腈,为保持一致,且乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液体系下柱压较低,因而选用乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液体系作为流动相。

定性需满足:(1)空白样品中不出现与阳性对照相同的离子峰;(2)特征离子色谱峰的信噪比(S/N)都在3: 1以上;(3)试样色谱峰的保留时间应与校正溶液的相对保留时间一致,容许偏差为±2.5% ; (4)检测到的离子的相对丰度与校正溶液的相对丰度一致,容许偏差满足2002/657/EC中的要求。

基质效应是残留检测中普遍存在的现象,对LC-MS检测方法来说,多表现为基质抑制效应。通过向阴性样品处理液中添加目标农药与同浓度标准溶液响应的对比,发现在基质中60%的目标物存在基质抑制效应,约10%的目标物存在基质增强效应;经过净化,抑制率和增强率均控制在8% ～15%范围。基质效应的消除方法一是在前处理时尽量将样品处理干净,二是在仪器分析时采用两种方法消除。仪器分析时采用的两种方法,一是采用基质匹配标准溶液做校准曲线,二是采用内标法进行校正。采用内标法进行校正时,最理想条件是采用该被测物的同位素,或采用化学性质相近的物质作内标进行校正,但因本方法涉及的农药品种较多,每种都采 用本身同位素作为内标不太现实,而采用性质相近

的物质作为内标会存在一定的偏差；同时因本方法前处理方法快速、简便,获得干净的提取净化液并不是很困难,因而本实验采用基质匹配标准液做校准曲线来消除基质效应。

将目标农药分成6组配成10 μ g/mL 的标准溶液,将其置于-18 ℃冰箱中,开始以1周/次的频率对其稳定性进行考察,后以1月/次的频率对其考察,结果表明,10 μ g/mL 混合标准溶液在半年的时间内没有明显的变化。

依据农药灵敏度的不同,配制1.00～250.0 μ g/L、10.00～500 μ g/L、50～1 000 μ g/L 的系列混合基质匹配标准溶液,以外标法做校准曲线,90%农药的校准曲线相关系数(R²)均大于0.99,表明各农药在设定浓度范围内具有较好的线性关系。

采用向阴性样品中逐级降低加标浓度,在较低浓度下峰形较好时,以S/N=3作为检出限。实验结果表明检出限在0.01～50.00 μ g/kg 之间(具体数据见附表 2(http:/ /www.chrom-china.com/UserFiles/File/sp1509026tables.pdf))。依据不同农药的检出限,进行3个加标水平的回收率及精密度考察。结果表明,在3个加标水平下,不同农药的平均回收率为60.1% ～120.0% ,精密度(相对标准偏差,n=5)为3.5% ～19.5% 。

应用建立的检测方法对市售果蔬进行检测,检出农药品种16种,检出批次5次。图 4为一韭菜中检出农药的MRM色谱图。

图4

Fig. 4

图4 韭菜中检出农药的MRM色谱图 Fig.4 LC-MS/MS chromatograms of detected pesticides in Chinese chives

本文采用QuEChERS方法对蔬菜样品进行前处理,以超高效液相色谱-串联质谱为检测仪器,建立了蔬菜中250种农药残留的快速筛查检测方法。方法采用含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液提取样品,经MgSO₄、PSA、GCB、C18混合净化剂净化,超高效液相色谱-串联质谱进行测定。250种农药在韭菜中3个添加水平下的回收率为60.1% ～120.0% ,相对标准偏差为3.5% ～19.5% ,检出限为0.01～50.00 μ g/kg。方法简便、快速，所用有机溶剂少,有较高的灵敏度,经方法学验证,能满足农药多残留日常检测要求。