苯甲酸和山梨酸是传统的化学防腐剂,可抑制细菌和霉菌的繁殖,山梨酸还可抑制细菌孢子的萌生和增殖^[1]。但过多地摄入这些防腐剂可导致人体酸中毒、抽搐和过度深呼吸,对人体造成伤害^[2]。因此我国原卫生部在GB 2760-2011^[3]中对这些防腐剂在不同食品中的添加量进行了严格的规定。

酱油和食醋是我国最常用的调味品。2009年酱油的产量就已达到500多万吨,食醋的产量也达到了约360万吨^[4]。宋超等^[5]对北京市西城区居民使用的调味品进行了调查,发现酱油和食醋的使用率分别为95.6%和88.3% 。苯甲酸和山梨酸是酱油和食醋中最常添加的防腐剂。通过在北京、安徽、湖南、湖北、福建、广东和海南等地的调查发现酱油中苯甲酸和山梨酸的检出率分别为60% ～97%和17% ～63%^{[6, 7]},在北京的调查显示食醋中苯甲酸和山梨酸的检出率分别为40%和20%^[7]。因此,为保护消费者的健康,建立一个快速、简便、经济和对环境损害小的较为“绿色”的酱油和食醋中苯甲酸和山梨酸的检测方法显得十分必要。

最常用的检测酱油和食醋中苯甲酸和山梨酸的方法是气相色谱法^{[8, 9, 10]}和高效液相色谱法(HPLC)^{[7, 11, 12, 13, 14]}。这两种防腐剂的化学性质决定不能将样品稀释后直接进样用于气相色谱检测,而要经过乙醚提取后进样分析^{[8, 9, 10]}。虽然HPLC法可以将样品稀释后进样,但由于酱油和食醋都是粮食发酵制得,成分较为复杂,直接稀释样品进样会产生干扰并会损害色谱柱^[11],所以HPLC法通常采用亚铁氰钾和乙酸锌沉淀样品中的蛋白质^[11]、用乙醚和正己烷提取^{[7, 12]}以及用固相萃取小柱萃取^{[13, 14]}等来净化样品。这些HPLC法中流动相均使用体积分数为5% ～12%的有机溶剂(甲醇或乙腈),流速为0.8～1.0 mL/min,色谱柱也均选用250 mm长度的C₁₈柱。与直接稀释进样相比,这些样品前处理方法较复杂。使用有机溶剂作为流动相对人体及环境有一定毒害性。另外,这些方法的流动相流速较高,分析柱较长,溶剂消耗大,分析时间长。

胶束液相色谱(MLC)是使用含有超过临界胶束浓度(CMC)的表面活性剂的水溶液作为流动相的一种反相液相色谱^[15],与传统HPLC方法相比,使用的流动相毒性小、费用低、对环境的损害少,因此更为“绿色”。MLC的特性之一是流动相中所含表面活性剂形成的胶束有很好的增容作用,不需要预先提取净化样品,直接进样就可定量测定不同复杂基质的样品^[16]。直接进样的MLC已应用于化妆品、食品和生物样品等不同类型样品的测定^{[16, 17, 18, 19]}。另外,Youngvises等^{[20, 21]}报道了用短的C₁₈保护柱(12.5 mm×4.6 mm)测定药品中的盐酸利多卡因和盐酸托哌酮以及化妆品中的对羟基苯甲酸酯。与传统的长色谱柱相比,使用短的色谱柱可以减少流动相的消耗量,缩短分析时间,使分析方法更为“绿色”。同时还可减小柱压,便于色谱柱的保护。本研究的主要目的是建立一种样品不需要提取、用短的分离柱同时测定酱油和食醋中苯甲酸和山梨酸的简单、快速、“绿色”的MLC测定方法。

装配有996二极管阵列(PDA)检测器的Alliance 2695 HPLC系统(美国Waters公司); Zorbax Extend-C₁₈柱(12.5 mm×4.6 mm,5 μ m,美国Agilent公司); 420 A+pH计(美国Thermo Orion公司); Milli-QRG超纯水系统(美国Millipore公司)。

醋酸钠(纯度≥98% )、醋酸(纯度≥99.8% )、苯甲酸钠(纯度≥99.5% )、山梨酸钾(纯度≥99.5% )和异丙醇(HPLC级)均购于国药集团;十二烷基硫酸钠(SDS,纯度≥99% )和溴化十六烷基三甲基铵(CTAB,纯度≥9% )购于美国Sigma-Aldrich公司。

分别称取0.288 g SDS和0.082 g醋酸钠,用98 mL超纯水溶解,用醋酸调节pH值至4.9,再加入2 mL异丙醇,配制成含2%(体积分数)异丙醇的0.01 mol/L SDS-0.01 mol/L 醋酸钠溶液。

分别称取 0.011 8 g苯甲酸钠和 0.013 4 g山梨酸钾,用超纯水定容至10 mL,制成相当于苯甲酸和山梨酸浓度为1 mg/mL 的混合标准贮备液,保存于4 ℃下。临用前用流动相稀释10倍,配制成100 mg/L 的混合标准工作液。

称取1.00 g酱油或食醋样品,置于10 mL的塑料管中,加入4 mL流动相,混匀,经0.45 μ m的微孔滤膜过滤后进样。

分离柱:聚醚醚酮(PEEK)接头串联起来的2根Zorbax Extend-C₁₈柱;柱温:35 ℃;流动相:含2%(体积分数)异丙醇的0.01 mol/L SDS-0.01 mol/L 醋酸钠溶液(pH 4.9);流速:0.5 mL/min;进样量:2 μ L;检测器:PDA检测器;检测波长:235 nm。

酱油和食醋均是由粮食发酵制成,其色、香、味是由粮食中的碳水化合物、蛋白质、脂肪及其他成分经细菌发酵而生成的,组成极为复杂^{[22, 23]}。如果样品不经过前处理,直接稀释进样,会导致严重的干扰并损害色谱柱^[11]。而MLC中的表面活性剂具有极强的增容能力,支持各类样品的直接进样测定^{[16, 17, 18, 19]}。García-Alvarez-Coque等^[24]阐述了MLC允许生理体液直接进样而不使柱效降低的原理,即MLC中的表面活性剂单体和胶束竞争性地与体液样品中的蛋白质结合,从而释放了与蛋白质结合的被测物,使其自由地参与固定相的分配。由于色谱柱被表面活性剂单体包裹,使得蛋白质不能沉积在色谱柱上,随溶剂前沿快速流出,更容易被清除和洗脱。本研究采用流动相直接稀释酱油和食醋样品,经0.45 μ m的滤膜过滤后进样,获得了很好的精密度与回收率。经过500次以上的注射(其中包括至少200次左右的样品注射),柱效未见下降,从一个方面验证了García-Alvarez-Coque等的理论。

最初按照Youngvises等^[21]的描述使用了1根Zorbax Extend-C₁₈柱作为分析柱,苯甲酸与山梨酸的色谱峰分辨率较低(只有1.2)。后尝试用PEEK接头将2根Zorbax Extend-C₁₈柱串联起来,分辨率大大改善(增为2.3)。因此确定将串联的2根Zorbax Extend-C₁₈保护柱作为分离柱。

最常用的胶束流动相表面活性剂是SDS阴离子表面活性剂和CTAB阳离子表面活性剂^[15],故对这两种常用的表面活性剂进行了考察。苯甲酸和山梨酸在这两种表面活性剂体系中的表现完全不同:在0.01 mol/L SDS体系(pH 4.9 )中,苯甲酸和山梨酸在3.5 min内可完全洗脱(见图 1);而在0.01 mol/L CTAB体系(pH 4.9 )中,10 min内未见洗脱峰。可能是由于苯甲酸和山梨酸的酸度系数(pK_a)分别为4.20和4.76,当pH=4.9时,溶液中苯甲酸和山梨酸以带负电荷为主的形式存在,与吸附在固定相上的阳离子表面活性剂CTAB以静电方式吸引而不被洗脱,因此在10 min内未见色谱峰。所以选择SDS作为分离体系。

图1

Fig. 1

图1 SDS浓度对被测物分离的影响 Fig.1 Effect of SDS concentration on the analyte separation Mobile phases: a. 0.01 mol/L SDS-0.01 mol/L sodium acetate containing 2% (v/v) isopropanol (pH 4.9); b. 0.02 mol/L SDS-0.01 mol/L sodium acetate containing 2% (v/v) isopropanol (pH 4.9). 1. benzoic acid; 2. sorbic acid.

由于MLC中表面活性剂的浓度一定要大于CMC,但又不能过大,浓度过大会导致黏度效应^[20],因此选择超过SDS临界胶束浓度(0.008 mol/L)以上的0.01 mol/L 和0.02 mol/L SDS进行试验。结果显示,随着SDS浓度的增加,保留时间缩短,分辨率降低(见图 1)。可能是因为随着SDS浓度的增加,体系中胶束的浓度随之增加,被测物分配到胶束的程度也增加,因此在柱上的保留随之降低。综合考虑分辨率与保留时间,选择0.01 mol/L 的SDS作为分离体系。

由于溶质的质子化反应,MLC的pH值非常重要,其决定了被测物的分辨率^[25]。在SDS体系中,随着pH值的增加,苯甲酸和山梨酸的保留时间逐渐减小。但苯甲酸和山梨酸保留时间减小的速率不一样。当pH值从2.5增加到4.0时,山梨酸的保留时间基本不变,而苯甲酸的保留时间则快速减小,直至苯甲酸的色谱峰与山梨酸的色谱峰重叠(pH=4.0,见图 2)。当pH值从4.9增加到6.0时,苯甲酸和山梨酸的保留时间均快速减小,但山梨酸减小的速度大于苯甲酸,当pH=6.0时,山梨酸的色谱峰与苯甲酸的色谱峰重叠(见图 2)。综合考虑苯甲酸和山梨酸的分辨率,最终选定pH值为4.9。

图2

Fig. 2

图2 pH对被测物分离的影响 Fig.2 Effect of pH on the analyte separation Mobile phase: 0.01 mol/L SDS containing 2% (v/v) isopropanol. 1. benzoic acid; 2. sorbic acid.

由于大部分的食醋样品为酸性,需要选择一个缓冲体系来保证溶液pH值的恒定。因为最终分离体系的pH值为4.9,故选择缓冲范围为3.76～5.76的醋酸-醋酸钠作为缓冲体系。从缓冲容量方面考虑,在SDS体系中加入0.01 mol/L 的醋酸钠获得了较好的精密度。

在不含有机改进剂的SDS体系中,苯甲酸和山梨酸虽然可以达到基线分离,但苯甲酸的峰形不对称,其对称因子(B/A,其中B和A分别是10%峰高处的后半峰宽和前半峰宽)为0.8。尝试加入有机改进剂以改善峰形、缩短保留时间^[15]。按照Youngvises等^[21]的报道,在SDS体系中加入体积分数分别为0、1% 、2%和5%的异丙醇,苯甲酸的对称因子分别为0.8、0.88、1.0和1.05,而山梨酸的对称因子分别为0.9、1.0、1.07和1.27。综合考虑苯甲酸和山梨酸的峰形,最终选定加入体积分数为2%的异丙醇。

如表 1所示,在10～100 μ g/mL 范围内,苯甲酸和山梨酸的峰面积(y)与质量浓度(x,μ g/mL)均呈良好的线性关系,其相关系数(r)均为 0.999 9。检出限(LOD)与定量限(LOQ)分别按照信噪比的3倍和10倍确定,LOD和LOQ分别为0.04 μ g/mL 和0.14 μ g/mL,满足酱油和食醋中苯甲酸和山梨酸的日常检测要求。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 苯甲酸和山梨酸的线性范围、回归方程、检出限和定量限 Table 1 Linear ranges, regression equations, LODs and LOQs of benzoic acid and sorbic acid Compound Regression equations r Linear range/(μg/mL) LOD/(μg/mL) LOQ/(μg/mL) Benzoic acid y=1.02×10 4 x-7.73×10 3 0.9999 10-100 0.04 0.14 Sorbic acid y=1.81×10 4 x-1.68×10 4 0.9999 10-100 0.04 0.14 y: peak area; x: mass concentration, μ g/mL.

表1 苯甲酸和山梨酸的线性范围、回归方程、检出限和定量限 Table 1 Linear ranges, regression equations, LODs and LOQs of benzoic acid and sorbic acid

使用不含苯甲酸和山梨酸的酱油和食醋的加标样品、FAPAS^®饮料质控样品(T03111QC,苯甲酸含量为134 μ g/mL)和能力验证的饮料样品(ACAS-PT056,苯甲酸的质量浓度为276 μ g/mL,山梨酸的质量浓度为376 μ g/mL)进行精密度与准确度的测定。酱油和食醋样品没有进行预处理,经流动相稀释、滤膜过滤后直接进样测定。用不含苯甲酸和山梨酸的酱油和食醋加标样品分别进行低(20 μ g/mL)、中(50 μ g/mL)、高(90 μ g/mL)3个水平的加标回收率试验以及批内精密度试验(平行测定6次),结果见表 2。苯甲酸和山梨酸的RSDs均不高于5.2% ,回收率为90.5% ～103.8% 。使用FAPAS^®饮料质控样品和能力验证的饮料样品在1个月内分别测定5次和3次,进行批间精密度试验。FAPAS^®饮料质控样品中山梨酸的测定结果与理论值的相对偏差小于4.5% ,能力验证的饮料样品中苯甲酸和山梨酸的测定值与理论值的相对偏差分别小于3.6%和2.7%(见表 3)。由此可见,本方法的精密度及准确度均可满足日常分析的需要。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 空白样品中苯甲酸和山梨酸的加标回收率和相对标准偏差(n=6) Table 2 Recoveries and RSDs of benzoic acid and sorbic acid spiked in blank samples (n=6) Sample Analyte 20 μg/mL 50 μg/mL 90 μg/mL Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% Soy sauce benzoic acid 98.3 4.3 103.0 4.6 102.4 5.1 sorbic acid 97.0 5.2 102.0 4.9 103.8 5.2 Vinegar benzoic acid 90.5 3.0 92.5 2.3 90.5 2.8 sorbic acid 91.9 1.1 93.6 2.0 95.1 2.8

表2 空白样品中苯甲酸和山梨酸的加标回收率和相对标准偏差(n=6) Table 2 Recoveries and RSDs of benzoic acid and sorbic acid spiked in blank samples (n=6)

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 FAPAS®饮料质控样品和能力验证的饮料样品中苯甲酸和山梨酸的测定结果(n=2) Table 3 Results for the determination of benzoic acid and sorbic acid in FAPAS® drink quality control samples and proficiency testing samples (n=2) Sample Analyte Theoretical concentration/(μg/mL) 1 2 3 4 5 Found/(μg/mL) Error/% Found/(μg/mL) Error/% Found/(μg/mL) Error/% Found/(μg/mL) Error/% Found/(μg/mL) Error/% FAPAS ® drink quality sorbic acid 134 133 -0.7 136 1.5 130 -3.0 134 0 128 -4.5 control sample Proficiency testing benzoic acid 276 272 -1.4 266 -3.6 282 2.2 / / / / sample sorbic acid 376 366 -2.7 367 -2.4 379 0.8 / / / / /: no detected.

表3 FAPAS®饮料质控样品和能力验证的饮料样品中苯甲酸和山梨酸的测定结果(n=2) Table 3 Results for the determination of benzoic acid and sorbic acid in FAPAS® drink quality control samples and proficiency testing samples (n=2)

用本方法对从北京部分超市购买的19个酱油样品和16个食醋样品进行了苯甲酸和山梨酸的测定,图 3为某酱油样品的色谱图。所有样品中苯甲酸和山梨酸的含量均未超过 1 000 μ g/g的标准^[3]。19个酱油样品中苯甲酸和山梨酸的含量分别为226～682 μ g/g和76～314 μ g/g,有2个样品既含有苯甲酸也含有山梨酸,7个样品只含有苯甲酸,5个样品只含有山梨酸,2个样品既不含有苯甲酸也不含有山梨酸。16个食醋样品中,9个样品只检出了山梨酸,含量为65～523 μ g/g；7个样品未检出苯甲酸和山梨酸。

图3

Fig. 3

图3 某酱油样品的色谱图 Fig.3 Chromatogram of a soy sauce sample 1. benzoic acid; 2. sorbic acid.

本文建立了2根串联Zorbax Extend-C₁₈保护柱测定酱油和食醋中苯甲酸和山梨酸的MLC方法。该法用时短,样品不需要提取净化,只需用流动相稀释、过滤后就可直接进样测定,简化了操作步骤,防止样品在预处理阶段的损失。短柱的使用不仅缩短了分析时间,同时减少了流动相的使用量。用表面活性剂-水体系代替传统液相色谱的有机溶剂-水体系,降低了试剂毒性,更为环保。总之,本方法降低了操作成本,且更为“绿色”环保。