茶叶在种植过程中会不可避免地使用农药来防治虫害,烟碱类杀虫剂是用来防治茶叶虫害的常用农药。烟碱类杀虫剂是20世纪70年代壳牌公司发明的一类新化合物；20世纪80年代,德国拜耳公司以第一代新烟碱类化合物为先导结构,成功开发出第二代新烟碱类杀虫剂吡虫啉^[1]。该类农药由于具有新颖独特的作用方式、较强的选择毒性、高效广谱等特点,迅速成为新农药创制领域的研究热点^{[1, 2, 3]}。但因其对人体有伤害,各个国家、组织对茶叶中这类农药有严格的限量规定:我国规定茶叶中吡虫啉和噻虫嗪限量分别为0.5和10 mg/kg^[4];欧盟规定茶叶中吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、噻虫啉和噻虫胺的最大残留限量分别为0.05、0.05、20、10和0.7 mg/kg^[5]。欧盟食品和饲料类快速预警系统(RASFF)自2013年以来针对吡虫啉、啶虫脒发布了30项通报^[6],严重影响了我国茶叶的顺利出口。

目前对于茶叶烟碱类农药残留量的测定方法主要有液相色谱法^{[7, 8]}和液相色谱-串联质谱法^{[1, 9, 10]},但这些方法只针对一种农药或前处理复杂,需要液液萃取、固相萃取等过程以降低基质效应。在线自动净化是基于色谱原理的在线样品制备和净化技术,结合了扩散、化学和体积排除的原理,在捕获目标分析物的同时,快速消除基质干扰,实现净化处理和仪器分析的全自动化^[11]。在线净化的技术核心组成是在线净化柱和流路切换两部分。该技术已被用于生物样品和食品中农兽药残留量及非法添加剂的检测^{[12, 13, 14, 15, 16]},如张璐等^[12]建立了在线净化-超高效液相色谱-串联质谱同时检测水果中吡咪唑、咪唑烟酸、咪鲜胺等5种咪唑类农药的方法。本文尝试结合在线自动净化和液相色谱-串联质谱,建立一种应用于茶叶中5种烟碱类农药残留量测定的简单、快速、准确、灵敏的分析方法。

Transcend Ⅱ在线净化-液相色谱-串联质谱仪(美国Thermo Fisher公司);在线净化柱Cyclone-P(50 mm×0.5 mm,60 μm,美国Thermo Fisher公司);色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm,美国Agilent公司);针泵、台式离心机(美国Thermo Fisher公司); AE260电子天平(瑞士Mettler公司);涡旋混合器(上海医大仪器厂);超纯水净化系统(英国ELGA公司)。

甲酸(美国Tedia公司)、乙腈(西班牙Scharlau公司)均为色谱纯;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)填料(美国Supelco公司); C18填料(北京振翔工贸有限责任公司);有机相微孔滤膜(0.22 μm);吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、噻虫啉、噻虫胺标准品(纯度≥97.5%)均购自Dr Ehrenstorfer公司。其他试剂均为国产分析纯。

样品为普通市售茶叶,常温密封保存。

标准储备液的配制:准确称取上述5种烟碱类标准品各10 mg,用甲醇溶解并定容至50 mL,配制成200 mg/L的标准储备液,贮存于4 ℃,根据需要用甲醇稀释为适当浓度的标准工作液。

准确称取茶叶样品2 g(精确至0.01 g)于50 mL聚乙烯具塞离心管中,加入10 mL水,浸泡15 min。再加入20 mL乙腈、4 g NaCl,涡旋3 min,以4 000 r/min的速度离心3 min。吸取1 mL上层有机相,转移至1.5 mL微量离心管中。加入20 mg PSA填料和20 mg C18填料,涡旋混匀,以15 000 r/min的速度离心3 min,取上清液过0.22 μm有机滤膜,供在线净化-液相色谱-串联质谱检测。

在线净化过程由上样泵驱动净化流动相于在线净化柱上完成。色谱分离由洗脱泵驱动分析流动相在分析柱上完成。通过两个六通阀切换实现流路的改变。在线净化柱为Cyclone-P柱,净化流动相为水和乙腈,进样量为10 μL。分析柱为Agilent Eclipse XDB-C18,分析流动相为乙腈和体积分数为0.1%的甲酸水溶液。在线净化梯度洗脱程序见表 1。在线净化程序中每步变化均采用瞬变模式,色谱分离程序中每步的变化除第4步和第6步采用渐变模式外,其他均采用瞬变模式。整体运行时间为14 min。程序中各步所用流路模式见图 1。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 在线净化与色谱分离梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution procedures of online clean-up and chromatographic separation Step No. Start time/min Step time/min Function Loading pump Eluting pump Flow rate/(mL/min) φ(Water)/% φ(Aceto-nitrile)/% Flow rate/(mL/min) φ(Water)/% φ(Aceto-nitrile)/% 1 0.0 1.0 loading 1.50 100 0 0.4 80 20 2 1.0 0.5 equilibration 0.10 100 0 0.4 80 20 3 1.5 2.0 transfer 0.10 100 0 0.3 80 20 4 3.5 2.0 cleaning 1.50 0 100 0.4 30 70 5 5.5 4.0 loop filling 1.50 70 30 0.4 30 70 6 9.5 1.0 conditioning 1.50 100 0 0.4 80 20 7 10.5 3.5 conditioning 1.50 100 0 0.4 80 20

表 1 在线净化与色谱分离梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution procedures of online clean-up and chromatographic separation

图 1

Fig. 1

图 1 在线净化模式流路示意图 Fig. 1 Schematic diagram of flow route in the online clean-up mode

离子源:电喷雾离子源;扫描模式:正离子模式;检测模式:多反应监测(MRM);喷雾电压:3 500 V;离子源温度:300 ℃;雾化气和气帘气:高纯氮气;碰撞气:氩气;碰撞气压力:1.5 mTorr;鞘气压力:50 unit;辅助气压力:20 unit;其他质谱参数见表 2。

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 5种烟碱类农药的质谱参数 Table 2 Mass spectrometry parameters of the five neonicotinoid pesticides Pesticide Retention time/min Ion pairs (m/z) Collision energies/V Acetamiprid 9.80 223/126*, 223/90.1 19, 31 Clothianidin 9.61 250/169*, 250/113 11, 26 Thiacloprid 10.19 253/126*, 253/90 20, 34 Imidacloprid 9.74 256/209*, 256/175 16, 16 Thiamethoxam 9.31 292/211*, 292/210 9, 5 *Quantitative ion pair.

表 2 5种烟碱类农药的质谱参数 Table 2 Mass spectrometry parameters of the five neonicotinoid pesticides

用针泵以10 μL/min的流速向质谱系统注入10 mg/L混合标准溶液,确定5种烟碱类杀虫剂的最佳质谱条件,包括定量离子对、定性离子对、喷雾电压、碰撞能量等质谱参数(见表 2)。

在线净化技术是基于色谱原理,通过改变净化流动相配比和选择不同功能的色谱柱,实现不同化学性质化合物的净化富集。在线净化柱富集分析物后,通过切换流路,用合适的流动相将分析物洗脱至分析柱进行色谱分离分析。

在优化分析条件时,首先采用将净化柱上洗脱下来的目标物不经过分析柱而直接引入质谱的方式来优化。在已有类型的在线净化柱中,Cyclone-P净化柱常被用于食品中农药残留量的测定,因此本实验使用Cyclone-P净化柱,考察了水和0.1%(体积分数,下同)甲酸-5 mmol/L乙酸铵混合溶液作上样溶液时分析物的保留情况。结果表明,在使用这两种流动相时,5种烟碱类农药都能被有效地保留,不会被直接洗脱。因此,从实验简便性方面考虑,采用水作为上样溶液。

随后对净化柱的洗脱液进行了优化,考察了不同比例的洗脱液对洗脱效果的影响。如图 2所示,洗脱液中乙腈比例达到20%(体积分数,下同)或以上时,5种烟碱类农药的峰面积变化较小,说明乙腈比例达到20%时,足以将5种烟碱类农药完全洗脱。考虑到被测农药在净化柱上的扩散因素及乙腈比例增大会导致洗脱杂质增多从而造成干扰,本实验最终采用水-乙腈(70:30,v/v)作为洗脱溶液。使用该洗脱溶液,对经PSA、C18分散固相萃取净化和经在线净化的样品溶液分别进行全扫描质谱分析(m/z 150~350),结果表明在线净化具有更好的净化效果(见图 3)。

图 2

Fig. 2

图 2 不同洗脱溶液洗脱效果的对比 Fig. 2 Comparison of elution effects with different elution solutions

图 3

Fig. 3

图 3 不同净化方式效果的比较 Fig. 3 Comparison of the effects of different clean-up methods

流动相的选择不仅对分离效果影响很大,同时对分析物的灵敏度和峰形也存在影响。在正离子模式下,流动相中加入含有质子的化合物通常可提高被测物的灵敏度。试验比较了分别以甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相对分离效果的影响。结果(见图 4)表明,采用甲醇-0.1%甲酸溶液作流动相,啶虫脒具有较高的本底；采用乙腈-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵溶液作流动相时,噻虫胺、吡虫啉的灵敏度较其他两种流动相条件有明显下降,因此本文采用乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相。

图 4

Fig. 4

图 4 不同流动相体系下标准溶液的色谱图 Fig. 4 Chromatograms of standard solution with different mobile phases

在线净化过程在净化样品的同时还能实现大体积进样和富集的功能。比较了不同进样体积的影响:当进样量为10 μL时,5种烟碱类农药直接进样和经在线净化均能获得较好的峰形;当增大进样体积时,在线净化的优势更为明显。以吡虫啉和噻虫嗪为例(见图 5),经在线净化得到的色谱峰形明显优于直接进样,有效避免了溶剂效应,可实现大体积进样。在本实验中,进样量为10 μL时,检测5种烟碱类农药已具有较高灵敏度,可以满足检测需要,而不需要通过增大进样量来达到提高灵敏度的目的。

图 5

Fig. 5

图 5 吡虫啉和噻虫嗪大体积(100 μL)进样的(a)LC-MS/MS和(b)在线净化-LC-MS/MS色谱图 Fig. 5 Chromatograms of imidacloprid and thiamethoxam using (a) LC-MS/MS and (b) online clean-up LC-MS/MS with large volume (100 μL) injection

茶叶样品虽经过在线净化,但通过比较空白样品溶液与标准溶液峰的面积发现,还是存在基质抑制效应。根据抑制率=(1-基质匹配标准溶液峰的面积/溶剂配制的标准溶液峰的面积)×100%计算得到基质对啶虫脒、噻虫胺、噻虫啉、吡虫啉、噻虫嗪的抑制率分别为29.9%、22.5%、25.8%、31.5%和27.3%。因此,本实验中采用基质匹配标准工作液制作标准曲线,5种烟碱类农药在1.0~10 μg/L线性范围内,线性良好,相关系数均大于0.998。茶叶中5种烟碱类农药的定量限均为0.01 mg/kg。

在采用加标试验考察方法回收率时,选取定量限及2倍定量限作为添加水平;另外,因为欧盟规定吡虫啉、啶虫脒在茶叶中限量为0.05 mg/kg,因此,如表 3所示,本试验选用不含5种待测烟碱类农药的空白茶叶样品,在0.01、0.02和0.05 mg/kg 3个添加水平下进行加标回收试验,考察方法的回收率和精密度。5种烟碱类农药回收率为68.0%~113.2%,相对标准偏差为3.2%~7.6%。

表 3

Table 3

表 3(Table 3)

表 3 茶叶中5种烟碱类农药的回收率和精密度 Table 3 Recoveries and precisions of the five neonicotinoid pesticides in tea (n=6) Pesticide Spiked level/(mg/kg) Range of recovery/% RSD/% Acetamiprid 0.01 78.1-91.3 6.7 0.02 85.0-99.0 6.1 0.05 78.2-91.4 5.5 Clothianidin 0.01 94.6-113.2 7.7 0.02 93.5-110.0 7.1 0.05 83.8-103.2 7.4 Thiacloprid 0.01 77.5-92.8 6.7 0.02 89.0-97.5 3.8 0.05 93.6-103.2 3.6 Imidacloprid 0.01 68.0-77.9 5.1 0.02 86.0-94.0 3.2 0.05 81.4-90.2 4.2 Thiamethoxam 0.01 84.2-101.7 6.9 0.02 74.0-89.5 6.8 0.05 77.8-95.0 7.6

表 3 茶叶中5种烟碱类农药的回收率和精密度 Table 3 Recoveries and precisions of the five neonicotinoid pesticides in tea

采用本方法和GB/T 23205-2008方法^[9]分别对含吡虫啉和啶虫脒的茶叶样品进行检测,结果见表 4。两种方法的检测结果基本一致,而本方法无需经过复杂的样品前处理过程,整个检测过程十分简便。

表 4

Table 4

表 4(Table 4)

表 4 使用不同方法对茶叶中啶虫脒和吡虫啉质量浓度的测定结果 Table 4 Mass concentrations of acetamiprid and imidacloprid in tea determined by different methods Sample Compound Contents/(mg/kg) Thismethod GB/T 23205-2008 1 acetamiprid 0.085 0.078 imidacloprid 0.076 0.070 2 acetamiprid 0.295 0.273 imidacloprid 0.096 0.082

表 4 使用不同方法对茶叶中啶虫脒和吡虫啉质量浓度的测定结果 Table 4 Mass concentrations of acetamiprid and imidacloprid in tea determined by different methods

本文建立了在线净化-液相色谱-串联质谱同时测定茶叶中5种烟碱类杀虫剂的检测方法。无需经过复杂的样品前处理过程,实现了样品净化的全自动化,达到了快速、简便、高效、高灵敏度的分析目的,满足实际茶叶样品中烟碱类杀虫剂的日常检测要求,同时也为其他农药的检测提供了参考。