秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,简称C. elegans)是一种常见的小型土壤线虫,属于小杆亚纲小杆目小杆总科,以大肠杆菌OP50为食,在土壤中自由生长。秀丽隐杆线虫作为一种经典的模式生物,是世界上首个全基因测序的多细胞生物^{[1, 2, 3]},具有以下特点和优点:(1)体积小,(2)结构简单,(3)发育模式固定,细胞定数,(4)繁殖快,生命周期短,(5)易培养和保存,(6)易观察,(7)神经结构简单,(8)高保守性的基因和分子机制。秀丽隐杆线虫具有与人类40%的同源基因,多种信号通路尤其是胰岛素信号通路与人类具有保守性^[4]。上述特点决定了线虫是研究衰老和代谢障碍的经典模式生物。

葡萄糖,作为人类机体一种重要的供能来源,是糖在血液中的运输形式,在机体糖代谢中占据主要地位。它可以诱导胰岛 β 细胞分泌胰岛素,使葡萄糖进入机体各组织细胞内进行合成和分解代谢。但是当体内葡萄糖含量持续保持在一个高水平时,会使糖代谢处于异常状态,从而抑制胰岛素的功能,引起人体内的血糖上升,引发各种代谢异常类疾病如糖尿病。一些以秀丽隐杆线虫为模型的研究发现高糖会使线虫寿命缩短^{[5, 6]}；近年来一些报道指出,高糖诱导的线虫寿命缩短的现象与氧化应激有着密切的联系^{[7, 8, 9]}。

白藜芦醇(resveratrol,Res)是近几年发现的抗衰老药物,多从葡萄和虎杖中提取,是植物体内一种天然的二苯乙烯类多酚物质,具有显著的延长线虫寿命的作用。白藜芦醇苷(polydatin,PD)是Res的糖基化衍生物,被认为是Res在自然界中广泛存在的形式^[10],研究表明,在葡萄中,PD的含量是Res的七倍,而且它也和Res一样是一种强抗氧化剂^{[11, 12]}。一些研究显示白藜芦醇苷在脑损伤中发挥保护作用,可降低小鼠体内脂肪含量,并且保护由四氯化碳引起的大鼠肝损伤^{[13, 14, 15, 16, 17]};最近的研究还证实白藜芦醇苷具有抗氧化应激和延长线虫寿命的作用^{[18, 19]}。近来有报道指出,降糖药物二甲双胍具有延长线虫寿命的作用^[20],而作为一种抗衰老药物,白藜芦醇苷是否对葡萄糖产生的糖毒性具有保护作用尚未见报道。

近年来,微流控技术的发展为线虫研究提供了一个良好的技术平台。微流控芯片具有与线虫尺寸相匹配的微米级通道,可实现精确的刺激传递,并具有显著的操作灵活性和功能集成性,可实现实时精确高通量的线虫分析。现阶段,多种基于微通道和液滴的微流控装置相继出现,包括线虫培养、固定、纤维和神经成像等在内的多种技术也趋于成熟^{[21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28]},已成功应用于线虫发育、线虫衰老以及帕金森模型等生物学研究领域^{[18, 19, 22, 26, 29]}。

本文设计制作了可以中集成化的微流控芯片,该芯片可以实现单个线虫的进样、长期培养、行为监测及固定后的荧光成像,并可平行多组进行观察。基于该芯片,我们分别研究了高糖条件下线虫寿命和氧化应激表达的变化,同时考察了白藜芦醇苷对高糖引起的线虫寿命及应激响应变化的作用。该芯片实现了高通量单线虫的长期培养,可以实现白藜芦醇苷的精确刺激并且对多个指标进行同时监测,为抗糖药物评价提供了一种新方法。

SC-1B型均胶机、BP-2B烘胶机(创威纳科技有限公司,北京),PH030A型培养/干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司),紫外光刻机(Thermo Oriel公司),等离子体清洗器(Harrick公司),FA1104型电子天平(上海精秤天平厂),100级超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),生化培养箱LRH-150型(上海一恒科学仪器有限公司),S8APO型体视显微镜(Leica公司),DH-HV2001UC型CCD摄像头(北京大恒图像视觉有限公司),倒置激光诱导荧光显微镜(Olympus IX 71,日本)。

Sylgard^® 184硅橡胶(PDMS)单体及引发剂(美国Dow Corning公司),SU-8 3035型光刻胶(美国Microchem公司),乳酸乙酯、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠(disodium EDTA)、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl₂)、硫酸镁(MgSO₄)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、氢氧化钠(NaOH)(沈阳化学试剂厂),NaClO溶液(分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司),2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇盐酸盐(Trizma^®hydrochloride,Trizma^®HCl)、2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(Trizma^® base)、胆固醇(cholesterol)(美国Sigma-Aldrich公司),胰蛋白胨(tryptone)、酵母粉(Yeast extract)(英国OXOID公司),细菌琼脂粉(Bacto^TM Agar)(美国BD公司),葡萄糖(美国Sigma公司),白藜芦醇苷(上海友思生物技术有限公司)

采用多层软光刻技术和快速成型技术^[30]进行微流控芯片的制作。芯片材料采用透气性和生物相容性均良好的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS),通过快速成型技术制作而成。制作过程如下:利用匀胶机将SU-8 3035光刻胶均匀地铺在干净的玻璃片上,通过曝光将掩膜上的图案转移到光刻胶上。玻璃模板通过硅烷化处理使PDMS剥离时变得更容易。制作液路层时,PDMS单体和交联剂按照10: 1(v/v)完全混合均匀,真空除泡后,浇铸在模板上,在80 ℃下加热成型。用混合均匀的10: 1(v/v)的PDMS均匀地甩在玻璃模板上,80 ℃加热获得40 μ m厚的膜。将液路层从模板上剥离,通过氧等键合在膜上,将整个结构从模板上剥离,打孔,切成合适的大小。最后将其封接在玻璃上。

N2野生型(C. elegans,wild-type strain N2)和CL2166(GST-4:: GFP)转基因型秀丽隐杆线虫购自美国明尼苏达大学线虫遗传中心(the Caenorhabditis Genetics Center,CGC)。转基因CL2166虫株以绿色荧光蛋白标记了GST-4蛋白,用于表征线虫体内氧化应激水平。大肠杆菌(E. coil)OP50冻存菌由中国科学院遗传与发育生物学研究所分子发育生物学重点实验室的杨崇林老师提供。所有线虫株在含有大肠杆菌OP50的线虫生长培养基(nematode growth medium,NGM)上,置于20 ℃培养箱中恒温培养。

同步化处理:收集产卵期的线虫于离心管中,并将其用NaClO混合液(5 mol/L NaOH-NaClO-H₂O(体积比为1: 2: 7))在室温下处理^[31],直到大部分的虫体裂开,将卵洗净收集转至未铺菌的NGM琼脂板上,静置吹干液体,20 ℃条件下过夜培养。第二天虫卵孵化,即得到同步化生长的L1期幼虫。

线虫的存活率检测实验在20 ℃条件下进行。本实验采用野生型线虫株N2,同步化的L1期线虫用K medium(50 mmol/L NaCl,30 mmol/L KCl,10 mmol/L NaOAc,pH 5.5)转移至孔板中,各组的葡萄糖和白藜芦醇苷浓度条件如表 1所示,葡萄糖和白藜芦醇苷均从L1期开始施加,葡萄糖的施加持续整个实验过程,而白藜芦醇苷则是从L1期处理24 h。在孔板中加入大肠杆菌OP50作为线虫的食物,孔板放在20 ℃培养箱中直至线虫长至L4期。将L4期的线虫转入微流控芯片中,将线虫固定在培养室后,通过每天换液3次,给线虫喂食和施加持续的高糖刺激。当施加刺激时线虫不运动并身体僵直时,说明线虫死亡。记录芯片中捕获的初始线虫数目及每天仍存活的线虫数目,计算每天线虫的存活率。实验过程中,将芯片置于Leica S8APO型体视显微镜下,实时录像由与显微镜相连的高分辨率CCD摄像头记录(像素为15 fps@800×600)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 实验中葡萄糖和白藜芦醇苷(PD)的浓度 Table 1 Concentrations of glucose and polydatin (PD) in experiment Strain Reagent Control Glucose only/(mmol/L) PD only/(mmol/L) PD+glucose/(mmol/L) N2 PD 0 0 1 1 glucose 0 1 0 1

表1 实验中葡萄糖和白藜芦醇苷(PD)的浓度 Table 1 Concentrations of glucose and polydatin (PD) in experiment

转基因虫株CL2166能够在整个线虫体内表达绿色荧光蛋白以显示线虫体内的氧化应激水平。CL2166虫株的绿色荧光通过倒置的荧光显微镜观察。其中,激发波长在470～495 nm之间,检测波长在510～550 nm之间。线虫的荧光成像通过图像处理和分析软件(IMAGE-PRO,Media Cybernetics,USA)来计算线虫的平均荧光强度。

本文所使用的微流控芯片设计如图 1所示。该芯片由上层液路层、中间气路控制层和底层玻璃组成。上层液路层中,线虫入口长1.5 mm,宽从250 μ m缩减至30 μ m,30个长2 mm×宽1 mm×厚70 μ m的线虫培养室用于线虫培养和成像、中心废液池通过30个20 μ m宽的通道与培养室相连。其中废液通道与培养室连接处由一系列小通道组成,第一排的通道宽度为25 μ m,共有3个;第二排的通道宽度为30 μ m,共有两个;两排分别交错居中分布,将成虫限制在培养室中,将L1～L2期的线虫分离出线虫培养室。气路控制层为一层PDMS膜,当施加正气压时,PDMS膜发生形变,从而将线虫固定。

图1

Fig. 1

图1 基于微阀的秀丽隐杆线虫研究微流控芯片原理图 Fig.1 Schematic of the microvalve based microfluidic device for C. elegans study a. three layers of the microfluidic device, consisting of liquid layer, the gas control layer (PDMS membrane) and glass layer. b. design of the multiple layer structure. c. the magnified view of the chip’s functional units.

基于以上描述的芯片设计,我们考察了野生型线虫N2在芯片中的生长状况,即将同步化的N2线虫培养在琼脂板上,直至其长到L4期,随机挑选单个线虫将其分别加到芯片入口处,并在负压驱动下将线虫引入芯片培养室,进行芯片上的长期培养,每天记录N2的生长情况。结果如图 2所示。从图 2中可以看出,在正常的培养条件下,线虫可以在芯片上生长长达16天,这与线虫的正常生长情况相近,说明了该芯片用于线虫培养的可行性和稳定性。同时该芯片可以进行高通量的单线虫分析,为后续的药物评估检测提供新的平台。

图2

Fig. 2

图2 微流控芯片培养秀丽隐杆线虫不同时间的明场图 Fig.2 Photographs of worms cultured on chip for lifelong time Wild-type N2 worms were cultured in K medium on chip. Scale bar: 200 μ m.

在以上建立的微流控芯片上,我们对不同糖浓度条件下的线虫寿命进行了分析。该实验采用野生型线虫虫株N2,在同步化处理线虫后待线虫长至L1期,转入孔板中。为构建高糖条件,我们从L1期对培养的线虫施加100 mmol/L 葡萄糖刺激,待线虫长至L4期时将单线虫在负压的驱动下引进至芯片中,记为第0天。每天进行换液培养直至芯片上线虫全部死亡,每天进行拍照录像统计,记录线虫存活状况。

结果如图 3所示。可以看出,线虫在高糖作用下,寿命明显缩短。高糖条件下线虫的平均寿命如表 2所示,可以看出,在正常情况下,线虫的平均寿命为14.2天,而在100 mmol/L 的糖作用下,线虫的寿命降到8.2天,即线虫在100 mmol/L 条件下,寿命缩短了42% 。这些结果表明高糖会使线虫的寿命缩短。

图3

Fig. 3

图3 N2野生型秀丽隐杆线虫在各种外加刺激下的存活率比较 Fig.3 Comparison of survival rate of C. elegans wild-type strain N2 under various stimuli For the PD assay, the L1 worms were exposed to PD with the concentration of 0.1 mmol/L for 24 h.

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 评价葡萄糖和白藜芦醇苷对野生型N2线虫寿命影响的实验条件 Table 2 Experimental conditions used to evaluate the effects of glucose and PD on the life-span of wild-type N2 C. elegans Genotype Treatment(20 ℃) Mean lifespan/d Max lifespan/d N2 control 14.1852 20 glucose only 8.2000 13 PD only 14.2041 25 PD+glucose 9.5385 14

表2 评价葡萄糖和白藜芦醇苷对野生型N2线虫寿命影响的实验条件 Table 2 Experimental conditions used to evaluate the effects of glucose and PD on the life-span of wild-type N2 C. elegans

线虫的寿命与氧化应激有着紧密的联系,在研究了高糖对线虫寿命的影响后,我们对高糖诱导的氧化应激水平进行了进一步的探讨。在本实验中,我们采用了转基因虫株CL2166,这个虫株的特点为可以在全身表达由氧化应激诱导的绿色荧光蛋白GST-4,而绿色蛋白表达水平可定量反应线虫体内的氧化应激水平高低,线虫表达荧光越强,线虫体内的氧化应激水平越高,即GST-4的蛋白表达量也越高。为了观察线虫在同时期不同糖浓度对线虫氧化应激表达量的影响,我们采用荧光显微镜对线虫体内的荧光强度进行了监测。经过同步化的CL2166在L1期加至孔板中,施加不同的糖浓度(0、100 mmol/L)进行培养,经过48 h,线虫引进至灭菌后的芯片,记为第0天。对芯片上的线虫每天进行换液(包括食物和葡萄糖),并在第3、5、7天对线虫进行荧光成像,观察线虫体内的氧化应激变化。

实验结果如图 4所示。从图 4a可以看出,在第5天时,加糖组的线虫体内GST-4表达量明显增强;图 4b显示高糖浓度下的线虫在第5天开始表现出较强的荧光强度,这说明在长期的高糖刺激下,线虫发生了氧化应激反应。图 4c对荧光强度的定量统计结果也证实了高糖会增强线虫氧化应激。以上实验说明高糖条件会使线虫的氧化应激反应加剧。

图4

Fig. 4

图4 不同条件刺激对转基因虫株CL2166的GST-4蛋白表达的影响 Fig.4 Effects of different conditions on GST-4 expression in transgenic CL2166 worms a. representative images of the expression of GST-4 in CL2166 worms after treatment at Day 5. Scale bar=200 μ m. b. comparison of the expression of GST-4 in CL2166 worms under different conditions. Scale bar=200 μ m. c. quantitative results of GST-4 expression in CL2166 worms. Scale bar: 200 μ m. Statistical analysis was conducted using Student’s t-test. Error bars indicate the SEM (standard error of mean)(n≥30) relative to Day 1 for the group with the same glucose condition. * * *p＜0.001.

上述结果提示高糖影响线虫的寿命可能通过激发氧化应激反应途径。为进一步验证该假设,我们首次利用白藜芦醇苷的抗氧化应激作用进行佐证。

白藜芦醇苷在一定程度上具有延长线虫寿命以及抗氧化应激的作用^{[18, 19]},但对高糖引起的相关变化是否具有拮抗作用尚未有相关报道。本实验中我们采用所设计制作的微流控芯片对白藜芦醇苷是否具有拮抗高糖诱导的氧化应激变化及延长线虫寿命的作用进行了考察。根据实验设计,在线虫引进芯片前,我们分别对同步化的L1期的N2和CL2166两种线虫施加1 mmol/L的白藜芦醇苷刺激,时间持续24 h,分别考察其对线虫寿命和氧化应激的影响。如图 3和表 2所示,正常条件下的N2线虫在白藜芦醇苷的作用下,最长寿命从20天延长至25天;而高糖组的线虫在施加白藜芦醇苷刺激后,不仅线虫的最长寿命有所延长,其平均寿命也从8.2天增长至9.5天,线虫的平均寿命延长了15.8% 。这一结果说明了白藜芦醇苷可以部分拮抗由高糖引起的线虫寿命缩短的作用。

此外,我们考察了白藜芦醇苷对线虫氧化应激的影响,即采用CL2166虫株,对线虫在白藜芦醇苷的作用下体内GST-4蛋白的表达量进行了检测，结果如图 4所示。在图 4a中,无论在正常还是加糖条件下,我们都发现线虫在经白藜芦醇苷处理后荧光强度明显减弱;而从图 4b和4c得到的结果,可以看出无论在正常条件还是在高糖条件下,白藜芦醇苷都会降低线虫体内的氧化应激水平,而这种降低情况在高糖条件下更为明显。以上这些结果说明白藜芦醇苷可以减缓由高糖引起的线虫的寿命缩短以及氧化应激增强的现象,在一定程度上说明白藜芦醇苷对高糖具有拮抗作用。根据自由基理论,即衰老在一定程度上是由于自由基持续攻击细胞导致细胞损伤,我们推测白藜芦醇苷是通过提高细胞抗氧化应激的能力,来降低由高糖引起的线虫氧化应激水平,进而缓解由高糖引起的线虫寿命缩短。

本工作采用一种功能性微流控芯片对白藜芦醇苷拮抗高糖的作用进行了评价。该芯片具有高通量、单线虫以及多指标实时监测线虫各项特征的优势,实现了线虫长期培养以及无损伤可逆固定成像。通过对线虫氧化应激变化和寿命的研究,我们发现高糖会使线虫的氧化应激增强同时使线虫的寿命缩短;而白藜芦醇苷则可以拮抗高糖引起的这些变化。该线虫模型为人类糖尿病研究提供了动物水平的直接证据及新的研究平台,同时这种采用微流控芯片对药物进行评价的方式显示了微流控芯片用于线虫水平高通量/高内涵药物评价的潜力,并在将来有可能为降糖药物评价提供一种新的平台。