多糖(主要包括直链淀粉和纤维素)是地球上来源最丰富且具有光学活性的天然生物大分子。该类大分子具有独特的结构优势,其糖单元上的羟基易于改性并活化,改性后的多糖类衍生物对多种外消旋体分子表现出良好的手性识别性能,能够通过高效液相色谱法(HPLC)实现大约90%以上的对映体过量值分析^[1,2,3]。在目前已开发的多糖类手性固定相中,以多糖苯甲酸酯与苯基氨基甲酸酯类固定相的手性拆分性能最为优秀,可对大多数手性化合物实现有效拆分,是目前拆分效能最高和应用最广泛的手性固定相材料^{[4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15]}。传统直链淀粉类衍生物通常在糖单元的2-、3-和6-位引入相同的取代基^{[16,17,18,19]},对于在上述3个位置选择性引入不同基团的研究相对较少,这在很大程度上制约了直链淀粉类衍生物的发展及其手性识别机理的深入探索。尽管目前仍然无法从分子水平对手性识别机理进行很好的诠释,但前期对单一取代多糖类衍生物的研究结果表明,芳环侧基上所具有的取代基可能改变多糖衍生物的二级结构和局部极性,从而对其手性识别性能产生较大的影响^[5,7]。因此,合成具有不同选择性取代基的直链淀粉类衍生物,并研究糖单元不同位置不同结构的取代基对直链淀粉类衍生物手性拆分性能的影响,对探索多糖类衍生物的手性识别机理具有较为重要的意义。

为了深入探索糖单元不同位置取代基的性能、结构和引入位置对直链淀粉类手性固定相手性拆分性能的影响规律,本文基于糖单元2-位的选择性酯化以及6-位保护与去保护法,采用区域选择性方法合成了5种新型直链淀粉类衍生物(其分子结构见图1),制备相应的色谱手性固定相,运用HPLC评价所制备新型的手性固定相对9种外消旋体的手性拆分的性能,并进一步考察不同位置引入不同结构取代基对该类直链淀粉衍生物立体选择性和手性拆分性能的影响。

图1

Fig. 1

图1 直链淀粉衍生物(A1～A5)的区域选择性合成路线 Fig.1 Scheme of regioselective synthesis of amylose derivatives A1-A5

直链淀粉(聚合度为300,Merck公司);三苯基氯甲烷(Acros北京分公司);乙烯基苯甲酸酯和4-氯乙烯基苯甲酸酯(日本Kasei公司);苯基异氰酸酯和4-氯苯基异氰酸酯(Sigma-Aldrich上海分公司); 3,5-二甲基苯基异氰酸酯和3,5-二氯苯基异氰酸酯(日本Daicel公司);环己基异氰酸酯(Adamas上海分公司);大孔硅胶(粒径为7 μm,孔径为100 nm,日本Daiso公司);无水N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜(DMSO)、磷酸氢二钠、氯化锂、无水吡啶、甲醇和四氢呋喃(THF)均为分析纯试剂(天津市科密欧化学试剂有限公司),反应用试剂使用前经过蒸馏处理;正己烷和异丙醇均为色谱纯试剂(天津市科密欧化学试剂有限公司);外消旋体(Sigma-Aldrich上海分公司)。

核磁共振-氢谱(¹H-NMR)仪(500 MHz,美国Bruker公司),傅里叶变换红外光谱(FT-IR)仪(美国Perkin Elmer公司),热重分析(TGA)仪(美国TA仪器公司),HPLC工作站(日本JASCO公司)。

直链淀粉类衍生物A1和A2的合成是在直链淀粉糖单元的3个位置上分别引入3种不同的取代基而实现的,其合成过程如图1所示。首先,取适量直链淀粉在80 ℃下真空干燥4 h,充分溶解于DMSO中;温度降至40 ℃,加入乙烯基苯甲酸酯和磷酸氢二钠,反应210 h,实现对糖单元2-位羟基的选择性酯化^[20];停止反应,用异丙醇隔离产物,60 ℃下真空干燥至恒重,产率为91%。然后,将上述产物溶于无水吡啶,加入三苯基氯甲烷,对糖单元6-位进行保护,在70 ℃下反应24 h;加入过量的4-氯苯基异氰酸酯,80 ℃下反应14 h,实现4-氯苯基氨基甲酸酯基团在糖单元3-位的引入;停止反应,用甲醇对产物进行隔离,60 ℃下真空干燥至恒重,产率为89%。再将所得中间产物溶解于含有少量盐酸的四氢呋喃溶液中,室温下充分搅拌12 h,实现对糖单元6-位的去保护;用甲醇隔离产物,60 ℃下真空干燥至恒重,产率为79%。最后,将上述产物溶解于无水吡啶,加入过量的3,5-二甲基苯基异氰酸酯或3,5-二氯苯基异氰酸酯,80 ℃下反应14 h;用甲醇隔离并洗涤产物,60 ℃下真空干燥至恒重,获得直链淀粉-2-苯甲酸酯-3-(4-氯苯基氨基甲酸酯)-6-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(A1)和直链淀粉-2-苯甲酸酯-3-(4-氯苯基氨基甲酸酯)-6-(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(A2),产率分别为87%(A1)和91%(A2)。

直链淀粉衍生物A3、A4和A5的合成是通过在直链淀粉糖单元2-位和3-、6-位上分别引入两种不同的基团而实现的,其合成过程如图1所示。首先,完成直链淀粉糖单元2-位的选择性酯化,具体步骤与上述方法一致。然后,将直链淀粉的2-位酯化产物充分溶解于无水吡啶中,加入过量的4-氯苯基异氰酸酯或3,5-二氯苯基异氰酸酯或环己基异氰酸酯,80 ℃下反应14 h;用甲醇隔离产物,60 ℃下真空干燥至恒重,即可得到直链淀粉-2-苯甲酸酯-3,6-二(4-氯苯基氨基甲酸酯)(A3)、直链淀粉-2-(4-氯苯甲酸酯)-3,6-二(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(A4)和直链淀粉-2-(4-氯苯甲酸酯)-3,6-二(环己基氨基甲酸酯)(A5),产率分别为83%(A3)、88%(A4)和87%(A5)。

运用¹H-NMR与FT-IR技术对上述反应过程中所有中间产物以及最终产物进行结构表征和分析,并确定产物纯度已达到预期目标。

称取一定量的直链淀粉类衍生物(A1～A5),充分溶解于四氢呋喃,运用涂覆法将样品溶液涂覆在氨丙基硅胶表面,真空旋转蒸发除去溶剂,经TGA确定所制备的5种直链淀粉类手性固定相的涂覆率分别为18.1%(A1)、18.8%(A2)、19.0%(A3)、19.6%(A4)和19.3%(A5)。

本文所用色谱柱的规格为25 cm×0.20 cm。用正己烷/异丙醇(90/10,v/v)作为匀浆液和顶替液,采用匀浆法装柱。HPLC工作站包括紫外-可见光检测器(JASCO UV-2070)和圆二色光谱仪(JASCO CD-2095)。所有色谱拆分均在常温下进行,检测波长为254 nm。流动相为正己烷/异丙醇(90/10,v/v),超声脱气后使用；流速为0.1 mL/min。色谱柱的柱效和死时间(t₀)分别用苯和1,3,5-三叔丁基苯测定。

采用区域选择性方法合成5种新型直链淀粉类衍生物(见图1)。首先,基于Dicke^[20]报道的糖单元2-位选择性酯化法,将苯甲酸酯基团引入直链淀粉糖单元的2-位;然后,依据糖单元6-位反应活性较高的特点,用三苯基氯甲烷完成糖单元的6-位保护;再加入带有不同侧基的苯基异氰酸酯,在糖单元的3-位引入带有不同侧基的苯基氨基甲酸酯基团;将该产物置于HCl/THF混合溶剂中于常温下充分搅拌,除去6-位的保护基(三苯甲基),还原6-位羟基;最后,加入过量带有不同侧基的苯基异氰酸酯,将带有不同侧基的苯基氨基甲酸酯基团引入糖单元的6-位,完成带有2种或3种不同取代基的直链淀粉类衍生物的合成。

用¹H-NMR和FT-IR对所合成的直链淀粉类衍生物的结构和取代度进行详细表征和分析。图2给出了所合成的直链淀粉衍生物A4的¹H-NMR谱。从图2可以看出,直链淀粉衍生物A4的各个基团质子的特征峰均可得到明确归属。从低场到高场,各个谱峰的归属结果如下:δ=9.46~10.61 ppm处为糖单元6-位和3-位所引入的3,5-二氯苯基氨基甲酸酯基团中的氨基峰,δ=6.53~7.82 ppm处为苯基上的质子峰,δ=3.93~6.26 ppm处是糖单元的质子峰。各质子峰面积比例非常接近理论值2∶10∶6。以上¹H-NMR分析结果充分证明我们所获得的直链淀粉衍生物A4的结构符合预期目标。

图2

Fig. 2

图2 直链淀粉衍生物A4的1H-NMR谱图(d5-吡啶, 80 ℃, 500 MHz) Fig.2 1H-NMR spectrum of amylose derivative A4 in pyridine-d5 at 80 ℃ (500 MHz)

此外,由FT-IR分析结果可知,直链淀粉衍生物A4在3 341 cm^-1处出现N-H特征吸收峰,在1 720 cm^-1处出现羰基C=O特征吸收峰,并且在3 500 cm^-1处的O-H伸缩振动吸收峰已基本消失,表明直链淀粉糖单元上的羟基已全部转化为苯甲酸酯或苯基氨基甲酸酯基团。

应用HPLC评价所制备的5种新型直链淀粉类手性固定相对9种手性化合物(3～11,如图3)的手性拆分性能。图4为手性化合物三乙酰基丙酮酸钴(8号)在手性固定相A4上的HPLC拆分谱图,其中t₁、t₂分别为先后洗脱的一对对映体的保留时间,t₀为死时间8.65 min,保留因子k₁和k₂可通过公式k₁=(t₁-t₀)/t₀和k₂=(t₂-t₀)/t₀计算得到,分别为2.38和4.00。最后由公式α=k₂/k₁计算得到分离因子α为1.68。该结果表明8号对映体在本文所制备的手性固定相A4上实现了基线分离。

图3

Fig. 3

图3 9种手性化合物(3~11) Fig.3 Nine racemates (3-11)

图4

Fig. 4

图4 三乙酰基丙酮酸钴(图 3中的8号化合物)在手性固定相A4上的HPLC拆分谱图 Fig.4 Chromatograms for the resolution of cobalt tris(acetylacetonate) (8# compound in Fig. 3) on CSP A4

3种新型直链淀粉类手性固定相A1、A2和A3对9种手性化合物的手性拆分结果列于表1中,同时为了对比分析,将同样在2-位具有苯甲酸酯基团且3-、6-位具有不同苯基氨基甲酸酯取代基的直链淀粉-2-苯甲酸酯-3-(3,5-二甲基)-6-(3,5-二氯)苯基氨基甲酸酯(1a)和直链淀粉-2-苯甲酸酯-3-(3,5-二氯)-6-(3,5-二甲基)苯基氨基甲酸酯(2a)的色谱拆分结果同时列于表1中。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 直链淀粉衍生物A1～A3对图3中9种对映体的色谱拆分结果及其与直链淀粉衍生物1a和2a的对比 Table 1 Resolutions of the nine racemates in Fig. 3 on amylose derivatives A1-A3 and comparison with amylose derivatives (1a and 2a) Racematein Fig. 3 A1a) A2a) A3a) 1ab) 2ab) k1 α k1 α k1 α k1 α k1 α 3 1.96(+) 1.69 1.69(+) 1.72 1.73(+) 1.65 1.28(+) 1.85 2.05(+) 2.31 4 1.04(+) 1.86 1.17(+) 1.21 1.03 1.00 0.82(-) 1.30 1.53(-) ～1 5 5.35(+) 1.47 5.36(+) 1.59 5.16(+) 1.34 3.84(-) 1.73 9.89(-) 1.97 6 3.34 1.00 3.72 1.00 2.32 1.00 2.27(-) 1.15 3.67(+) 1.24 7 1.40(+) 1.07 1.00(+) 1.20 1.10(+) 1.17 0.76(-) 1.18 0.98(+) 1.23 8 2.52 1.00 2.23(+) 2.07 4.21(+) 1.48 1.16(-) 1.75 1.70(-) 2.46 9 3.75 1.00 3.94 1.00 2.96(+) 1.17 2.73(-) 1.17 4.21(+) 1.13 10 0.56 1.00 0.50 1.00 0.39 1.00 - - - - 11 27.64 1.00 15.93(-) 1.05 9.28(-) 1.05 - - - - a) Column: 25 cm×0.20 cm; flow rate: 0.1 mL/min; eluent: hexane/2-propanol (90/10, v/v). The signs in parentheses represent the circular dichroism signal of the first-eluted enantiomer. b) Data taken from the reference 16: column, 25 cm×0.46 cm; flow rate, 0.5 mL/min; eluent, hexane/2-propanol (90/10, v/v); the signs in parentheses represent the optical rotation of the first-eluted enantiomer.

表1 直链淀粉衍生物A1～A3对图3中9种对映体的色谱拆分结果及其与直链淀粉衍生物1a和2a的对比 Table 1 Resolutions of the nine racemates in Fig. 3 on amylose derivatives A1-A3 and comparison with amylose derivatives (1a and 2a)

从表1可以看到,尽管对于A1～A3 3种直链淀粉类衍生物而言,其糖单元的2-位与3-位所引入的取代基均相同,三者在结构上的唯一差别在于糖单元6-位所引入的基团不同。但仅仅这一结构上的差异已导致这3种手性固定相的手性拆分性能存在较大的差别。总的来说,糖单元6-位带有吸电子侧基(-Cl)的A2和A3对除4号以外的其他多数对映体的拆分性能优于6-位带有供电子侧基(3,5-二甲基)的A1。尤其是7、8和11号对映体,在固定相A2和A3上可实现有效拆分,但在固定相A1上却几乎无法被拆分。与此同时,对于4号对映体(反式-2,3-二苯基环氧乙烷)而言,它在固定相A1上可获得有效拆分,分离因子达到1.86,远远高于在A2上的分离因子(1.21),而在A3上则根本没有分离迹象。以上结果表明,糖单元6-位上引入取代基的电负效应对于直链淀粉类手性固定相的手性识别与拆分性能具有较大的影响。对比A2与A3的色谱拆分结果不难发现,除了9号对映体以外,前者对于所测试的多数对映体的手性拆分性能均高于后者,意味着6-位所引入苯基氨基甲酸酯苯环上侧基的取代位置与数量对该类直链淀粉衍生物的手性识别性能也具有较大影响。这一结论与文献^{[5, 17, 19]}中所报道的结果相吻合。

此外,由A1与2a的对比分析发现,二者在糖单元2-、6-位上具有相同的取代基,仅3-位取代基上苯环所引入侧基的位置与数量不同。色谱拆分结果显示,在3-位上引入更多吸电子基团(-Cl)的2a对大多数对映体的拆分性能明显高于A1。尤其对于A1无法拆分的6、8和9号对映体,可在2a上获得高效拆分。A2和1a的结构差异也仅仅在于其糖单元3-位所引入取代基有所不同。二者色谱拆分结果的对比分析表明,1a对大多数对映体的拆分性能均优于A2。表明糖单元3-位取代基上苯环所引入侧基的位置与数量对于具有不同取代基直链淀粉类衍生物的二级结构影响较大,从而导致其立体选择性与手性识别性能发生较大变化。而4号和5号对映体在A1与2a上的洗脱顺序发生逆反,同时4、5、7和8号对映体在A2与1a上的洗脱顺序也发生逆转,说明3-位取代基上苯环所引入侧基的位置与数量对于该类直链淀粉衍生物的高阶有序结构具有一定影响。

表2中列出了本文所制备的另外2种新型直链淀粉类手性固定相A4和A5对9种手性化合物(3～11号化合物)的手性拆分性能,同时将直链淀粉-2-(4-氯苯甲酸酯)-3,6-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(3a)以及具有单一取代基的直链淀粉-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(ADCPC)和直链淀粉-三(环己基氨基甲酸酯)的色谱拆分结果同时列于表2中,便于对比分析。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 直链淀粉衍生物A4、A5对9种对映体的色谱拆分结果及其与直链淀粉衍生物3a、ADCPC和ATCHC的对比 Table 2 Resolutions of the nine racemates on amylose derivatives A4 and A5, and comparisons with amylose derivatives (3a, ADCPC and ATCHC) Racematein Fig. 3 A4a) A5a) 3ab) ADCPCc) ADCHCc) k1 α k1 α k1 α k1 α k1 α 3 1.74(+) 1.91 0.92(+) 1.08 0.75(+) 2.13 0.84(+) 1.34 0.46(+) 2.54 4 0.82(-) 2.15 0.43(+) 2.16 0.71(-) ～1 - - 0.44(-) ～1 5 7.26(+) 2.97 2.13(+) 1.28 2.98(-) 1.97 6.08(+) ～1 4.33(-) 1.12 6 5.34(+) ～1 0.66 1.00 1.16(+) 1.23 1.26(-) ～1 0.71(+) 1.70 7 0.68 1.00 2.59 1.00 0.71(+) ～1 0.37 1.00 1.42(+) 1.32 8 2.38(+) 1.68 0.34 1.00 0.36(-) 1.50 0.63(+) ～1 0.13(-) 1.00 9 5.24(-) 1.32 1.84(-) 1.24 1.81(+) ～1 1.62(+) 1.10 0.89(+) 1.48 10 - - 0.41(-) 1.12 - - - - - - 11 3.97(-) 2.17 18.77(+) 1.02 - - - - - - a, b) column: 25 cm×0.20 cm; flow rate: 0.1 mL/min; eluent: hexane/2-propanol (90/10, v/v); the signs in parentheses represent the circular dichroism signal of the first-eluted enantiomer. b) Data taken from reference 17. c) Data taken from reference 21: column, 25 cm×0.46 cm; flow rate, 0.5 mL/min; eluent, hexane/2-propanol (90/10, v/v); the signs in parentheses represent the optical rotation of the first-eluted enantiomer.

表2 直链淀粉衍生物A4、A5对9种对映体的色谱拆分结果及其与直链淀粉衍生物3a、ADCPC和ATCHC的对比 Table 2 Resolutions of the nine racemates on amylose derivatives A4 and A5, and comparisons with amylose derivatives (3a, ADCPC and ATCHC)

可以看到,尽管本文所制备的2种新型直链淀粉类衍生物A4和A5及已报道的另一种衍生物3a,在其糖单元2-位具有相同的取代基(4-氯苯甲酸酯),但其3-、6-位引入取代基的不同导致这3种衍生物呈现明显不同的手性拆分性能。对于3、5、6、8和11号对映体,糖单元3-、6-位具有含苯环取代基(苯基氨基甲酸酯)的直链淀粉衍生物A4和3a的手性拆分性能远远超过3-、6-位不具有含苯环取代基(环己基氨基甲酸酯)的A5。尤其是在A5上几乎无法拆分的8号和11号对映体,可在A4上实现高效的基线分离。固定相A4对3、5、6、8和9号对映体的保留因子远远大于A5和3a,表明3-、6-位引入具有吸电子效应的苯基氨基甲酸酯基团会增强直链淀粉衍生物与对映体分子之间的相互作用,这在一定程度上可能提高该类直链淀粉衍生物对于对映体分子的立体选择性与手性识别作用。对A4和3a的手性拆分性能的进一步对比分析可发现,二者仅在3-、6-位取代基的电负效应有所不同,但它们对于某些对映体(如4、6和9号)表现出截然不同的识别性能。以上结果再次表明,糖单元3-、6-位引入取代基的结构与性能对于该类直链淀粉衍生物的二级结构产生了较大影响,并最终导致其手性拆分性能发生较大变化。

此外,对于3-、6-位具有相同取代基(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯),仅2-位取代基不同的直链淀粉衍生物A4与ADCPC、A5与ATCHC两对衍生物而言,前者与后者对于多数对映体的手性拆分性能差异显著。如5号和8号对映体在A4上获得高效拆分,而在ADCPC上无法拆分;在A5上无法识别的6号和7号对映体,却能在ATCHC上实现有效拆分。另外,这两对固定相对于某些对映体的保留因子(如A4和ADCPC对于8号和9号对映体,A5和ATCHC对于5、7和9号对映体)均有较大差别。说明固定相与对映体分子之间所形成的瞬间非对映体配合物的稳定性由于2-位取代基的不同而发生较大变化。以上结果表明,糖单元2-位所引入的取代基也对该类直链淀粉衍生物的手性拆分性能具有较大的影响。除了2-位取代基的电负效应所带来的影响以外,ADCPC与ATCHC在2-位上所具有的氨基也会引起衍生物与某些对映体分子之间产生不同的氢键相互作用,并导致衍生物的二级结构发生变化,从而形成不同的手性识别与拆分效果。

应用一系列区域选择性酯化方法合成了5种新型具有2种或3种不同取代基的直链淀粉类衍生物,分别为直链淀粉-2-苯甲酸酯-3-(4-氯苯基氨基甲酸酯)-6-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、直链淀粉-2-苯甲酸酯-3-(4-氯苯基氨基甲酸酯)-6-(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)、直链淀粉-2-苯甲酸酯-3,6-二(4-氯苯基氨基甲酸酯)、直链淀粉-2-(4-氯苯甲酸酯)-3,6-二(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)和直链淀粉-2-(4-氯苯甲酸酯)-3,6-二(环己基氨基甲酸酯),制备了HPLC手性固定相,并系统考察了它们对9种手性化合物的手性拆分能力。结果表明,糖单元2-位具有苯甲酸酯基团,同时3-、6-位具有不同苯基氨基甲酸酯基团的5种新型直链淀粉类衍生物具有各自不同的手性拆分优势。与已报道的区域选择性取代和单一取代的直链淀粉类衍生物相比,本文所制备的新型手性固定相对某些对映体分子显示出更优的手性识别能力。进一步对比分析表明,糖单元3个位置所引入取代基的结构、电负效应和引入位置对于直链淀粉类衍生物的手性拆分性能均具有较大的影响。同时,直链淀粉衍生物的高阶有序结构也可能受到糖单元3个位置所引入取代基的影响而产生不同的变化。