长期以来,抗生素(antibiotics)因价格低廉、使用方便、抗菌能力强而被大量用于人和动物的防病治病,同时添加在动物饲料中以提高饲料利用率和促进动物生长。大部分抗生素在人和动物体内不能被完全吸收,没被吸收的抗生素则以药物原形和代谢产物形式不断进入环境,成为新型重要的环境污染物,对生态环境和人体健康构成严重威胁[1,2]。有关抗生素引发的事件已经受到社会的广泛关注,如2014年12月25日央视报道我国海河、珠江等水系以及居民家中自来水检测出抗生素;2015年4月复旦大学公共卫生学院对江苏、浙江、上海地区的1 000多名儿童的尿液进行了检测,其中5类18种抗生素均有检出[3]。
目前抗生素的检测方法主要有高效液相色谱法[4,5,6,7,8,9]、毛细管电泳法[10,11]、免疫分析法[12,13]、液相色谱-质谱联用法[14,15,16,17,18]。检测样本种类较多,包括食品及保健品[9,19]、生物样本(血、尿等)[4]、环境样本(土壤、水等)[20]等。由于水体中残留的抗生素多以痕量水平存在,且种类繁多,通常都需要对水样进行富集浓缩后才能进行检测[7, 15, 21, 22]。而样品在富集浓缩过程中使用的有机试剂又会对环境造成危害,同时也需要较大的投入用于耗材的购买,并且耗费一定的时间。而对于突发性公共安全事件的快速筛查检测则需要一种简单、快速、有效的前处理方法。液相色谱-质谱联用法因具有高灵敏度和高选择性,抗干扰能力强,使之成为了抗生素药物残留定性确证的有效工具。本文利用高效液相色谱-串联质谱检测法(HPLC-MS/MS)进行水体中痕量β-内酰胺类药物残留的快速筛查与检测,采用的多反应监测扫描(MRM)模式能提供特征分子离子及其子离子信息,为目标物的定性与定量分析提供了可靠依据。本方法同时采用大体积进样可提高目标化合物的灵敏度,水样经过简单的除杂微孔滤膜过滤后直接进样,简单、快速,灵敏度高,重现性好,能满足水体中痕量的13种β-内酰胺类药物残留的快速筛查检测要求。
UHPLC LC 30A超高效液相色谱仪(日本SHIMADZU公司); Q-trap 5500液相色谱-串联质谱仪(美国AB SCIEX公司);离心机(美国Sigma公司);乙腈、甲醇、甲酸、乙酸均为色谱纯(德国Merck公司); MS级水(美国Fisher公司)。水样(水源水、出厂水、末梢水)由本实验室赴南京市区及周边地区进行采集并于当日检测。
13种β-内酰胺类化合物的结构式见图 1。氨苄西林(ampicillin)、头孢唑林杂质A(cefazolin impurity A)、哌拉西林(piperacillin)购自中国食品药品检定研究院;头孢氨苄(cephalexin)、苄青霉素(benzylpenicillin)、苯唑青霉素钠(oxacillin)、双氯青霉素(dicloxacillin)、青霉素钾(benzylpenicillin potassium)、头孢噻呋(ceftifour)购自德国DR公司;阿莫西林(amoxicillin)、阿洛西林(azlocillin)、氯唑西林(cloxacillin)、头孢匹林酸(cefapirin sodium)购自中国食品药品检定研究院。
分别准确称取13种0.01 g,用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中,配成质量浓度为1.0 g/L的标准储备液,储存于-20 ℃冰箱中。
分别准确吸取25 μL各单标准储备液于25 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制质量浓度为1.0 μg/L的混合标准储备液,于4 ℃下保存。
用相应的水样(按1.3节处理)作为基质溶液将混合标准储备液按比例逐级稀释后配成质量浓度分别为5、10、15、20、30、50、100、200、500、1 000 ng/L的混合基质加标溶液。
先将待测水样混匀后静置15 min,取1.5 mL上层清液于离心管中,以19 000 r/min离心5 min,取上清液过0.22 μm微孔滤膜,滤液直接测定。
液相色谱条件:色谱柱为Atlantis dC-C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm,Waters公司);流动相A相为0.05%(v/v)甲酸水溶液,流动相B相为甲醇-乙腈(4:6,v/v)。梯度洗脱程序:0～1.0 min,5%B; 1.0～7.0 min,5%B～95%B; 7.0～10.0 min,95%B; 10.0～10.1 min,95%B～5%B; 10.1～13.0 min,5%B。流速为0.5 mL/min;柱温为35 ℃;进样量为50 μL。
质谱条件:电喷雾电离(ESI)源，正离子电离;监测模式为MRM;雾化温度为550 ℃;气帘气压力为275.6 kPa(40 psi);雾化气压力为447.85 kPa(65 psi);辅助气压力为447.85 kPa(65 psi);喷雾电压为5.5 kV。其他质谱参数见表 1。
采用蠕动泵直接进样方式,将质量浓度为100 ng/mL的13种β-内酰胺类药物的混合标准液以7 μL/min的速度注入离子源,分别在正离子(ESI+)、负离子(ESI+)模式下进行Q1母离子全扫描,实验结果表明,13种化合物均在ESI+模式下具有较高的响应值。分别考察了喷雾电压、雾化温度、气帘气压力、雾化气压力、辅助气压力对离子响应强度的影响,同时对各分子离子进行子离子扫描,选取合适的离子对,在MRM模式下优化其去簇电压和碰撞电压,最终选定了最优参数。
一般情况下,酸性条件可提高化合物[M+H]+的正离子响应,碱性条件可提高化合物[M-H]-的负离子响应。本实验采用ESI+模式,因此选用酸性流动相。首先比较了含有0.05%、0.1%、0.5%(v/v)的甲酸水溶液-乙腈和乙酸水溶液-乙腈对分析物的离子化效率和色谱峰形的影响,发现以甲酸水溶液-乙腈为流动相时目标物的质谱响应更好(见图 2a～d)；同时发现酸度对目标物的响应和分离影响不大,而酸会加速β-内酰胺类药物的降解,因此选用0.05%(v/v)甲酸水溶液作为水相(流动相A相)。进一步优化不同体积比(6:4、5:5、4:6,v/v)的甲醇-乙腈(流动相B相)对目标物离子化效率和色谱峰形的影响(见图 2e和f),结果表明,甲醇和乙腈的体积比为4:6时各分析物的分离度及响应最佳,故本文选用0.05%(v/v)甲酸水溶液和甲醇-乙腈(4:6,v/v)为流动相,在1.4节条件下13种化合物的分离度好,响应高,分析时间短,重现性好。混合标准溶液的色谱图见图 3。
水体中的抗生素残留量基本在ng/L (ppt)级,而一般的质谱通常需要浓缩1 000倍才能进行检测。本实验中13种β-内酰胺类药物对酸碱的稳定性较差,极易发生降解,因此一种简单快速的前处理方法更利于目标物的检测。
本实验将水样静置15 min后取上清液,经高速离心后过0.22 μm微孔滤膜,滤液直接上机检测。分别比较了不同进样体积(10、25、50 μL)对目标物的灵敏度以及检出限的影响,结果表明,进样量为50 μL时,各目标物的灵敏度和检出限最高。这主要是因为进样量越大,进入质谱检测器的目标物的绝对量越高,从而提高了灵敏度,增强了目标物的响应值,因而满足了水体中痕量级抗生素残留的检测要求。
本研究采用外标法定量,分别以各分析物的峰面积(y)和对应的质量浓度(x,ng/L)进行线性回归计算,得到线性方程和相关系数。阿莫西林、阿洛西林、头孢噻呋、苄青霉素的线性范围为5～1 000 ng/L,哌拉西林的线性范围为10～1 000 ng/L,氨苄西林、氯唑西林、头孢氨苄、头孢匹林酸的线性范围为15～1 000 ng/L,青霉素钾的线性范围为20～1 000 ng/L,其余3种药物的线性范围为30～1 000 ng/L; β-内酰胺类药物线性相关系数(r2)均大于0.99;通过向阴性样品中添加β-内酰胺类药物考察方法的检出限(S/N=3)、定量限(S/N=10),各化学物的检出限和定量限分别小于10 ng/L和30 ng/L;分别在20、100和500 ng/L 3个加标水平进行加标回收率和精密度试验(n=7),方法的回收率在81.4%～102.3%之间,相对标准偏差在0.96%～10.6%之间。各化合物的检出限、定量限、线性相关系数、线性方程见表 2,加标回收率及精密度见表 3。
利用本方法分别对17份水样(6份水源水、6份出厂水、5份末梢水)进行检测,其中6份水源水中均检出阿莫西林,测定值分别为3.52、6.27、4.58、9.73、3.05、14.86 ng/L,出厂水和末梢水均未检出13种β-内酰胺类药物残留。
本文建立了一种利用高效液相色谱-质谱联用技术同时快速筛查检测水体中13种β-内酰胺类药物残留的方法。本方法简便、可靠,应用于实际样品检测的重现性良好,能满足13种β-内酰胺类药物残留的快速筛查与检测。
2016, Vol. 34 Issue (3): 299-305
PDF (1782 KB)
2016, Vol. 34 Issue (3): 299-305
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