聚六亚甲基双胍又称聚氨丙基双胍(PHMB),是由一系列不同聚合度(n≈10～12)的聚合物组成的混合物^[1]。为增加其在水中的溶解性,通常制备成盐酸盐,在水溶液中以阳离子形式存在,是一种安全、高效的杀菌剂^{[2, 3]},广泛用于国内外医疗中疾病的治疗和感染的预防^[4]。PHMB对细菌繁殖体、真菌及对空气中的自然菌也能达到很好的消毒效果^[5],还作为杀菌剂用于隐形眼镜护理液中^{[1, 6]}。近年来,出现了PHMB与醋酸洗必泰(CHA)复配的消毒产品以提高消毒效果^[7]。PHMB的测定方法有高效液相色谱法(HPLC)^{[1, 8, 9, 10]}、分光光度法^{[11, 12]}、光度胶体滴定法^[13]及毛细管电泳法(CE)^[14]。基于分离技术的CHA的测定方法主要有CE^{[14, 15, 16]}及HPLC^{[17, 18]}。分光光度法测定PHMB时需对水样进行严格的除菌去藻等处理,以避免颜色干扰,但仍不能消除具有相同吸收波长的基质干扰^[12]。我国国标采用的分光光度法^[11]操作较为烦琐,而且所用曙红Y染料与PHMB-HCl反应后形成的产物并未见明显的吸收。故导致该法的线性范围较窄,只能用于PHMB原料的测定,难以分析复方化学消毒剂实际样品。Abad-Villar等^[14]用搭建的毛细管电泳仪,采用非接触式电导检测,首次实现了PHMB与葡萄糖洗必泰(CHG)的同时分离与测定,然而所用电导检测器在商品化的毛细管电泳仪上并不普及,限制了该方法在实际中的应用。

苄索氯铵(BTC)存在于葡萄籽的提取物中^[19],可作为有效的杀菌剂用于人体内外,是近年来日益广泛应用的低刺激性高效杀菌剂^[20],并出现了PHMB与BTC复配在一起的复方化学消毒剂。文献报道的检测方法主要有HPLC^{[21, 22, 23]}及核磁共振法^[24]。但未见BTC与PHMB同时分离与测定的文献报道。

随着消毒技术的发展,另一新型、具有良好杀菌效果和安全性的高分子聚合物 聚六亚甲基单胍(PHMG)在医药、食品及日用品等方面得到愈来愈广泛的应用^[25],且其价格低于PHMB。文献报道的检测方法是胶体滴定法^[26],但用该法分析含醇样品时,需先将其煮沸,去除醇后再进行测定,较为烦琐,而且该法无法区分PHMG和PHMB。现行消毒规范中也尚未制订其含量的测定方法,在很大程度上影响了该类消毒产品的研究、评价及质量监督。

本实验室于2003年用HPLC分析PHMB时^[1],国内外知名试剂供应商还未能够生产出PHMB标准品,故只能用从PHMB原料供应商处购得的20% PHMB原料作为标准品,用多个色谱峰中的主峰进行定量,尽管得到了与产品配方相一致的检测结果,但这样做的弊端是量值无法溯源。近年来,随着对PHMB研究的不断深入及实验室对量值溯源要求的提高,可购买到纯度为97.5%的PHMB标准品,然而,用我们原来所建立的HPLC方法^[1]分析该标准品时,出现了多个色谱峰且无明显色谱主峰,影响准确定量。

本研究针对近年来新出现的实际样品中PHMB与CHA或PHMB与BTC复配在一起的情况,建立了同时用于这两组复配样品分离测定的MEKC新方法,解决了复方化学消毒剂中PHMB、CHA和BTC准确定量的问题。同时,本方法还解决了PHMG与PHMB的区分及PHMG的定量问题,具有良好的应用前景。

P/ACE MDQ毛细管电泳仪配二极管阵列检测器(PDA)(美国贝克曼库尔特有限公司);内径50 μ m未涂层熔融石英毛细管(河北永年瑞沣色谱配件有限公司); Milli-Elix/RiOs超纯水仪(美国Millipore公司)。

四硼酸钠(Na₂B₄O₇\510H₂O,＞99.5% ,中国医药公司北京采购供应站);氢氧化钠(NaOH,优级纯,北京化工厂);硼酸(H₃BO₃,优级纯,铁岭地区开原化工厂);十二烷基硫酸钠(SDS,≥99% ,Sigma-Aldrich);脱氧胆酸钠(SD,≥98% ,百灵威);聚乙二醇 20000 (PEG 20000,Fluka)。

标准品:PHMB盐酸盐(97.5% ,Dr. Ehrenstorfer GmbH),CHA(≥98% ,Sigma-Aldrich),BTC(≥99.9% ,Sigma-Aldrich),PHMG盐酸盐(苏州瑞美科生物技术有限公司),奎宁(quinine,＞98% ,TCI)

样品:1^#～4^#为消毒湿巾样品,购于当地超市,5^#～11^#为复方化学消毒剂液体样品,由生产厂家提供。

准确称取PHMG、CHA、BTC及PHMB各50 mg,分别置于15 mL塑料离心管中,用移液器加入超纯水10 mL,涡旋混匀,制得质量浓度均为5 g/L 的标准储备液,于4 ℃冰箱中冷藏保存。

液体样品用样品提取液稀释后直接进样;消毒湿巾样品则用剪刀剪成细小片,称取1 g,置于50 mL离心管中,加入10 mL样品提取液,超声提取10 min,将提取液转移至另一50 mL离心管中,再加入10 mL样品提取液,重复上述操作,将两次提取液合并、混匀即可直接进样分析。

毛细管柱:50.2 cm(有效长度:40 cm)×50 μ m i.d.;分离电压:24 kV;进样压力及时间:3.448 kPa,12 s;操作温度25 ℃;检测波长:214 nm。在区分PHMB及PHMG时,利用PDA同时采集214 nm及235 nm检测的电泳图,在235 nm与214 nm检测都有电泳峰则为PHMB,在235 nm检测时无电泳峰而在214 nm检测时有电泳峰的则为PHMG。

分离缓冲溶液:20 mmol/L 硼砂+30 mmol/L SDS+5 mmol/L SD+0.8 g/L PEG 20000;样品提取液:将分离缓冲溶液用超纯水稀释10倍。

新毛细管在使用前分别用1 mol/L NaOH冲洗20 min,超纯水冲洗5 min,分离缓冲液冲洗5 min。每次进样前依次用1 mol/L NaOH冲洗2 min,超纯水冲洗2 min,分离缓冲液冲洗2 min,以保证迁移时间和校正峰面积的重现性。

PHMB在235 nm有最大吸收^[1],CHA分别在214 nm和254 nm有最大吸收^{[15, 16]},BTC分别在215及260 nm有最大吸收^{[19, 22]},为实现PHMB与CHA或PHMB与BTC的同时检测,且在获得尽可能高的灵敏度的同时又避免基体干扰,本实验选择214 nm作为检测波长。

PHMB与CHA都属于双胍类阳离子消毒剂,PHMB是由聚合度不同的聚合物组成的混合物,具有一定的疏水性,实验用MEKC分离模式,通过胶束将其包裹形成大分子团,减少PHMB本身不同聚合度分子之间微小的差异。硼酸盐因紫外吸收低而成为CE中最常用的碱性分离缓冲体系,故本实验选用硼砂为分离缓冲溶液。

由于SD的分离能力优于SDS^[27],故实验初期,在20 mmol/L 硼砂分离缓冲溶液中加入5 mmol/L SD进行分离,因SD临界胶束浓度为5 mmol/L^[28],结果在17 min内未见到PHMB与CHA的峰(见图 1a),将SD浓度分别增至20、30及 50 mmol/L 时,PHMB与CHA峰形不好;因PHMB与CHA都属于双胍类阳离子消毒剂,而毛细管内壁带负电以致二者容易被吸附在管壁上,降低其灵敏度,故加入PEG 20000以抑制吸附。该类高分子可强烈吸附在毛细管壁上,影响电渗及分离过程^[28],但仍未见到PHMB与CHA的峰(见图 1b);考虑到PHMB是由聚合度不同的分子组成的混合物,故换用另一常用的阴离子表面活性剂SDS,则PHMB因疏水作用被SDS胶束包裹,使不同聚合度的PHMB能够在电场中以相同的速度迁移而被检测到。然而,当在20 mmol/L 硼砂中仅加入30 mmol/L SDS时,无法实现PHMB与CHA的分离,二者在同一时间出峰(见图 1c);向其中加入一定量的PEG 20000后,二者分离得到了改善,但仍无法达到基线分离(见图 1d);再尝试加入SD,PHMB与CHA的分离得到很好的改善(见图 1e)。故本实验最终选择分离缓冲溶液含有硼砂、SDS、SD、PEG 20000。

图1

Fig. 1

图1 分离缓冲液对PHMB与CHA分离的影响 Fig.1 Influence of running buffer on the separation of PHMB and CHA a. 20 mmol/L Na2B4O7 and 5 mmol/L SD; b. 20 mmol/L Na2B4O7, 5 mmol/L SD and 0.8 g/L PEG 20000; c. 20 mmol/L Na2B4O7 and 30 mmol/L SDS; d. 20 mmol/L Na2B4O7, 30 mmol/L SDS and 0.8 g/L PEG 20000; e. 20 mmol/L Na2B4O7, 5 mmol/L SD, 30 mmol/L SDS and 0.8 g/L PEG 20000. Capillary: 50.2 cm (effective length 40 cm)×50 μ m. Separation voltage: 24 kV; injection pressure and time: 3448 Pa for 12 s; detection: 214 nm; temperature: 25 ℃. Peaks: 1. CHA (20 mg/L); 2. PHMB (50 mg/L).

在硼酸盐的碱性分离缓冲体系中,SDS带负电,分离时其运动方向与电渗流(EOF)方向相反,由于在碱性分离体系中,EOF速度大于SDS胶束的电泳速度,因此,裹挟着PHMB聚合物的SDS胶束可以被EOF推至检测窗口而被以单一峰检测。一些疏水性的阳离子(如硫酸奎宁)可作为SDS的标记物,主要是奎宁阳离子能够通过静电、疏水作用与SDS产生相互作用^[29]。通过比较带正电的奎宁和带正电的不同聚合度的PHMB在本实验所用最佳分离缓冲体系中的迁移时间,获知PHMB与奎宁被SDS包裹后带相同的负电荷,相对分子质量较小的组分先迁移至检测窗口(见图 2)。

图2

Fig. 2

图2 奎宁与PHMB的电泳分离图 Fig.2 Separation electropherogram of quinine and PHMB The running buffer is the same as Fig. 1e and other MEKC conditions are the same as in Fig. 1. Peaks: 1. quinine (50 mg/L); 2. PHMB (50 mg/L).

pH控制着EOF的大小,影响分析物的迁移时间和分离效率。保持20 mmol/L 硼砂+30 mmol/L SDS+5 mmol/L SD+0.8 g/L PEG 20000不变,用硼酸或NaOH调节pH,研究了pH分别为9.09、9.20及9.42时对PHMB及CHA分离的影响(见图 3)。当pH分别为9.09及9.42时,PHMB与CHA的迁移时间长,且灵敏度低,峰展宽。pH为9.20时,二者分离时间短,灵敏度高,峰形好,可能的原因是使用硼酸或NaOH调节pH时,分离缓冲溶液中无机盐浓度增加,导致EOF降低,分离时间相应增加。故最佳pH为9.20(未调节pH)。

图3

Fig. 3

图3 pH对PHMB和CHA分离的影响 Fig.3 Influence of pH on the separation of PHMB and CHA The running buffer is the same as Fig. 1e and other MEKC conditions are the same as in Fig. 1.

分离缓冲液中盐浓度也是影响待测物分离与迁移时间的关键因素,增加盐浓度可抑制吸附、降低EOF而增加分离。保持30 mmol/L SDS+5 mmol/L SD+0.8 g/L PEG 20000浓度不变,分别试验了10、20及30 mmol/L 硼砂对PHMB及CHA分离的影响(见图 4a):随着硼砂浓度的增加,PHMB与CHA之间分离度增加、迁移时间也相应增加,且PHMB的峰展宽变形。硼砂最佳浓度为20 mmol/L。

图4

Fig. 4

图4 PHMB与CHA分离条件的优化 Fig.4 Optimization of separation conditions of PHMB and CHA a. concentration of Na2B4O7; b. concentration of SDS; c. concentration of SD; d. mass concentration of PEG 20000. Conditions: a. x mmol/L Na2B4O7, 30 mmol/L SDS, 5 mmol/L SD and 0.8 g/L PEG. 20 000; b. x mmol/L SDS, 20 mmol/L Na2B4O7 (pH 9.20, unadjusted), 5 mmol/L SD and 0.8 g/L PEG 20000; c. x mmol/L SD, 20 mmol/L Na2B4O7 (pH 9.20, unadjusted), 30 mmol/L SDS and 0.8 g/L PEG 20000; d. x g/L PEG 20000, 5 mmol/L SD, 20 mmol/L Na2B4O7 (pH 9.20, unadjusted) and 30 mmol/L SDS. Other MEKC conditions and specified peaks are the same as Fig. 1.

SDS浓度大于其临界胶束浓度时形成胶束,还可起到增溶及增加分离的作用。保持20 mmol/L 硼砂、5 mmol/L SD及0.8 g/L PEG 20000浓度不变,试验了10、30及50 mmol/L SDS对PHMB与CHA分离的影响(见图 4b)。结果发现随着SDS浓度增大,二者的迁移时间变短、分离度逐渐增加,但PHMB的峰明显展宽、灵敏度降低。SDS最佳浓度为30 mmol/L。

当分离缓冲液中硼砂、SDS及PEG 20000的浓度均为最佳(20 mmol/L、30 mmol/L 及0.8 g/L)时,PHMB与CHA达不到基线分离。SD独特的分子结构及其聚合性能,使得其分离能力优于SDS^[30]。故尝试将SD添加到分离缓冲液中构成SDS-SD双胶束,以改善PHMB与CHA间的分离。保持20 mmol/L 硼砂、30 mmol/L SDS及0.8 g/L PEG 20000浓度不变,试验了0、5及10 mmol/L SD对PHMB与CHA分离的影响(见图 4c),当SD浓度为5 mmol/L 时,PHMB与CHA分离效果好,二者的峰均增高且峰形好。SD的最佳浓度为5 mmol/L。

未使用添加剂的情况下,双胶束的MEKC分离模式并不能使PHMB与CHA达基线分离。PEG 20000可抑制蛋白质及多羟基化合物在管壁的吸附从而改善分离^{[31, 32]},故加入PEG 20000,结果表明PEG 20000可有效改善PHMB与CHA的分离;随着PEG 20000浓度的增大,二者间的分离度越来越大,然而当质量浓度大于0.8 g/L 时,虽然灵敏度升高,但CHA出现拖尾现象,且分离度降低(见图 4d)。本实验还分别比较了不同相对分子质量、不同质量浓度的PEG对PHMB与CHA间分离的影响,结果表明:随着PEG相对分子质量的增加,其分离度逐渐增大,当PEG相对分子质量过大时,PHMB峰变形。可能是由于PHMB本身由不同聚合度的聚合物组成,PEG相对分子质量越大,在增加PHMB与CHA分离度的同时也增加了其自身相对分子质量不同的聚合物间的分离。因此,本实验最终选择PEG 20000作添加剂,其最佳质量浓度为0.8 g/L。

样品提取(或稀释)液在CE准确定量中起着极其重要的作用,既可改善分离、增加定量重现性,还可提高检测灵敏度^[16]。带正电的PHMB与带负电的SDS在一定浓度时形成不带电荷且不溶于水的离子对;随着SDS浓度的增加,带正电的PHMB因静电引力被SDS胶束完全包围,故沉淀复溶,利于PHMB与CHA的分离。实验比较了分离缓冲液、样品提取液及纯水做样品提取(或稀释)液时对PHMB与CHA分离检测的影响。结果发现用样品提取液做样品介质时,因样品堆积效应,使得PHMB和CHA的峰远比纯水做样品介质时高,而且峰形较尖锐、分离好。

BTC也属阳离子表面活性剂,在上述已经优化的PHMB与CHA的最佳分离缓冲液中,无论改变哪种组分的浓度,均无法使BTC与CHA达到基线分离。但在上述条件下,用70 cm毛细管(有效长度为60 cm)×50 μ m i.d.可将CHA、PHMB以及BTC分离,但所需时间长(见图 5)。因此,当实际分析需要时,可通过加长分离毛细管的长度实现三者的同时分离与测定。

图5

Fig. 5

图5 PHMB、CHA与BTC同时分离的电泳图 Fig.5 Electropherogram of PHMB, CHA and BTC Capillary: 70 cm (effective length 60 cm)×50 μ m i.d. Separation voltage: 27 kV; injection pressure and time: 3.448 kPa for 20 s; detection wavelength: 214 nm; temperature: 25 ℃. The running buffer is the same as Fig. 1e. Peaks: 1. CHA (10 mg/L); 2. BTC (10 mg/L); 3. PHMB (50 mg/L).

在上述最佳电泳条件下,分别将PHMG、PHMB、CHA与BTC的标准储备液用样品溶液逐级稀释,分别配制成3、20、40、60、80、100、120、140 mg/L 的PHMG工作液、PHMB和CHA的混合工作液以及PHMB和BTC的混合工作液,依次进样,校正峰面积(峰面积除以迁移时间)外标法定量,校正峰面积(y)与质量浓度(x,mg/L)具有良好线性关系。线性回归方程、线性范围、相关系数(r)、检出限(LOD)及定量限(LOQ)如表 1所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 线性回归方程、线性范围、相关系数(r)、检出限及定量限 Table 1 Linear regression equations, linear ranges, correlation coefficients (r), LODs and LOQs Compound Linear regression equation r LOD/(mg/L) LOQ/(mg/L) PHMG y=85.618 x-82.30 0.9991 1.0 3.0 PHMB y=63.08 x-27.52 0.9995 1.0 3.0 CHA y=86.28 x-16.32 0.9995 1.0 3.0 BTC y=53.27 x-31.78 0.9995 1.0 3.0 y: correct peak area; x: mass concentration, mg/L; linear range: 3-140 mg/L.

表1 线性回归方程、线性范围、相关系数(r)、检出限及定量限 Table 1 Linear regression equations, linear ranges, correlation coefficients (r), LODs and LOQs

PHMB的检出限优于文献[9]中的50 mg/L 和文献[10]中的4 mg/L,CHA的检出限优于文献[17]报道的2～10 mg/L,BTC的检出限优于文献[23]报道的1.11～1.97 mg/L。PHMG的检出限与文献[26]相一致。

在上述优化的最佳条件下,分别在低、中、高3个质量浓度水平进行仪器精密度实验。所得4种物质的迁移时间和校正峰面积的RSD列于表 2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 仪器精密度(n=7) Table 2 Results of instrumental precision (n=7) Compound ρ(Compound)/(mg/L) RSDs/% Migration time Corrected peak area PHMG 6 0.28 1.5 60 0.14 4.5 120 0.34 6.3 PHMB 6 3.90 3.3 60 0.27 1.6 120 3.71 1.5 CHA 6 0.34 2.9 60 0.33 1.1 120 3.52 1.1 BTC 6 0.18 1.6 60 0.25 4.3 120 0.17 2.5

表2 仪器精密度(n=7) Table 2 Results of instrumental precision (n=7)

选择样品7^#、10^#和11^#,按1.3节的样品前处理方法处理样品,每个样品平行处理7份,以考察方法精密度。在最佳MEKC条件下直接进样测定,计算其RSD。 样品7^#中PHMB和CHA含量的RSD分别为3.9%和4.3%；迁移时间的RSD分别为0.18%和0.16%。样品10^#中PHMB和BTC的含量的RSD分别为1.2%和0.10%;迁移时间的RSD分别为0.25%和0.38%。样品11^#中PHMG的含量和迁移时间的RSD分别为2.5%和0.22% 。

以2^#、10^#和11^#样品为本底,分别在低、中、高3个质量浓度水平进行加标回收试验。结果见表 3。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 4种复方化学消毒剂有效成分的加标回收率 和RSD(n=5) Table 3 Recoveries and RSDs of the four effective components in compound chemical disinfectants (n=5) Compound Background/(mg/L) Added/(mg/L) Recovery/% RSD/% PHMB - 10 84.1 5.7 60 92.6 3.2 120 84.5 5.6 PHMG 0.016 10 91.0 3.0 60 101.8 4.2 120 106.2 4.3 CHA 0.0197 10 85.9 1.9 60 98.6 1.3 120 93.4 4.2 BTC 1.06 10 91.7 2.6 60 109.6 4.2 120 93.5 4.6 -: not detected.

表3 4种复方化学消毒剂有效成分的加标回收率 和RSD(n=5) Table 3 Recoveries and RSDs of the four effective components in compound chemical disinfectants (n=5)

本文选取4份消毒湿巾样品和7份液体样品,按1.3节方法处理后进行检测,结果见表 4。部分电泳图见图 6。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 MEKC法对11件样品中PHMG、PHMB、CHA 和BTC的测定结果 Table 4 Contents of PHMG, PHMB, CHA and BTC in 11 samples determined by MEKC Sample No. Analyte Content/% RSD/%( n=5) Content labeled/% 1 PHMB 0.065 6.5 0.06 CHA - - n 2 PHMB - - n CHA 0.035 1.9 0.01-0.1 3 PHMB 0.007 3.5 N CHA - - n 4 PHMB 0.006 3.6 N CHA - - n 5 PHMB 0.63 3.7 0.62 CHA - - n 6 PHMB 0.22 1.1 0.1-0.3 CHA - - n 7 PHMB 0.099 1.5 0.1 CHA 0.77 1.9 0. 65-0.8 8 PHMB - - n CHA 0.79 2.6 0. 65-0.8 9 PHMB 0.207 0.02 0.2 CHA - - n 10 PHMB 1.44 0.5 1.1-1.5 BTC 1.12 0.9 1.0-1.4 11 PHMG 0.39 4.23 0.29-0.39 -: not detected; n: not contained; N: contained but the content not labeled.

表4 MEKC法对11件样品中PHMG、PHMB、CHA 和BTC的测定结果 Table 4 Contents of PHMG, PHMB, CHA and BTC in 11 samples determined by MEKC

图6

Fig. 6

图6 7#、10#和11#样品电泳图 Fig.6 Electropherograms of samples 7#, 10# and 11# Running buffer: 0.8 g/L PEG 20000, 20 mmol/L Na2B4O7, 5 mmol/L SD and 30 mmol/L SDS. Other MEKC conditions are the same as Fig. 1. Peaks: 1. CHA; 2. PHMB; 3. BTC; 4. PHMG.

从表 4数据可以看出,样品的检测值与标识值基本吻合。故本文所建MEKC方法适用于消毒产品中复配在一起的PHMB与CHA或PHMB与BTC的同时分离与测定,用该法也能区分样品中的PHMB和PHMG。

在使用HPLC测定PHMB时,PHMB会分成几个峰,而MEKC方法中利用双胶束,使不同聚合度且带正电的PHMB只出一个峰,容易定量。MEKC方法前处理简单,样品用样品提取液稀释后可直接进样,得到的电泳图基本无干扰;该法具有良好的重现性,结果准确,操作简便,可作为分离与检测样品中复配在一起的PHMB与CHA或PHMB与BTC的首选方法。此外,建立的MEKC方法还适用于消毒剂PHMG的检测与定量,充分证明了该方法的实用性。