金属螯合亲和色谱,又称固定化金属离子亲和色谱(immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC),是1975年Porath等^[1]提出的分离纯化蛋白质的技术。先把螯合剂亚氨基二乙酸(iminodiacetate,IDA)交联到琼脂糖载体上,然后与金属离子生成配合物^[2]。由于该配合物是三配位,还有一个空的轨道可以与蛋白质上组氨酸的咪唑基或半胱氨酸上的巯基配位,所以具有亲和作用^{[3, 4, 5, 6]}。把组氨酸作为标签与目标蛋白共表达^{[7, 8, 9, 10]},然后用金属离子亲和色谱分离在重组蛋白研究中获得了广泛的应用^{[11, 12, 13]}。在短肽合成过程中,由于目标产物与杂质之间的差别很小,给分离过程带来了极大的挑战。如果把金属离子亲和色谱用于含有组氨酸或半胱氨酸的短肽分离,可能也会取得理想的效果。考虑到葡聚糖或琼脂糖等软基质载体制备复杂、价格昂贵、不耐压等^{[14, 15, 16, 17]}问题,本文采用硬度大、价格低廉的氯甲基化聚苯乙烯交联微球^[18](氯球)作为载体来进行金属离子亲和色谱介质的制备并探索其在短肽分离中的应用。

X-5显微熔点测定仪(未校正,北京泰克仪器有限公司); LTQ-XL电喷雾电离质谱(美国Thermo Finnigan公司); INOVA-400MHz超导核磁共振波谱仪(美国Varian公司); AKTA purifier(GE Healthcare制造);分析型高效液相色谱仪(日立全自动L2000); Kromasil C18分析色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,中科院大连化物所); UV-2600型紫外可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司); CSR-4-10纯水机(北京爱思泰克科技开发有限责任公司)。氯甲基化聚苯乙烯交联微球,粒径范围100~400 μm,取代度0.4~4.0 mmol/g,购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司;商品镍柱Ni Sepharose^TM 6 Fast Flow,粒径90 μm,琼脂糖基质,交联度6%,GE Healthcare制造;保护及游离氨基酸,购于上海吉尔化工有限公司;His-Lys-Tyr三肽(组氨酰赖氨酰酪氨酸)、Phe-His-Thr三肽(苯丙氨酰组氨酰苏氨酸)以及Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg六肽(谷氨酰谷氨酰蛋氨酰谷氨酰胺酰精氨酰精氨酸),于西安华澳丽康活性蛋白与多肽工程中心合成。其他试剂均为分析纯,实验用水为超纯水。

以芴甲氧羰基-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)为原料,采用二环己基碳二亚胺(N,N′-dicyclohexylcarbodiimide,DCC)法^[19]合成芴甲氧羰基-叔丁氧羰基-L-赖氨酸乙酯(Fmoc-Lys(Boc)-OEt),再用哌啶脱Fmoc,即可得叔丁氧羰基-L-赖氨酸乙酯(Lys(Boc)-OEt)。其具体方法如下:量取150 mL二氯甲烷(DCM),加入配有磁力搅拌器、恒压滴液漏斗(顶口一侧连接橡皮管通往尾气吸收液)、温度计的500 mL三颈圆底烧瓶中,分别将9.37 g(20 mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH及1.75 mL(30 mmol)无水乙醇加入到DCM中,用冰盐水浴冷却至0 ℃,缓慢加入溶有4.95 g(24 mmol)DCC的DCM(50 mL)溶液。在该条件下反应1 h后,转至室温反应过夜。用薄层色谱(TLC)追踪检测至原料中Fmoc-Lys(Boc)-OH消失,过滤除去不溶物,用乙酸乙酯淋洗2遍滤饼,合并滤液,用无水硫酸镁干燥后过滤。减压蒸出溶剂得到透明黏状物。用无水乙醚(300 mL)超声处理,析出白色固体。减压蒸出乙醚,得白色固体9.88 g,即Fmoc-Lys(Boc)-OEt。TLC的展开剂为乙酸乙酯-石油醚(1∶2,v/v)。

取9.88 g Fmoc-Lys(Boc)-OEt溶于100 mL四氢呋喃(THF)中,加入6 mL(60 mmol)哌啶,常温下搅拌。TLC监控反应(TLC展开剂为乙酸乙酯-石油醚(1∶2,v/v))至原料消失。减压蒸出溶剂,向所得产物中加少量水,用5%(体积分数)盐酸调pH至8左右,用乙酸乙酯萃取。所得有机相用饱和NaCl洗涤,无水MgSO₄干燥,抽滤,回收溶剂,得粗产物。向所得粗产物中加入200 mL正己烷,在低温下析出白色物质,将其滤去。滤液减压蒸出溶剂,得淡黄色物质3.4 g,即为Lys(Boc)-OEt。测熔点,用H-NMR、IR、MS确定产物。

称取2 g(取代度:1 mmol/g)氯甲基聚苯乙烯交联微球于50 mL烧杯中,用适量N,N-二甲基甲酰胺(DMF)浸泡30 min,抽去液体,再用DMF将微球洗2遍。之后依次向烧杯中加入1.586 g(4 mmol)的Lys(Boc)-OEt,10 mL的DMF溶液,1.4 mL(8 mmol)的N,N-二异丙基乙胺(DIEA),室温搅拌2 h,用5%(体积分数)水合茚三酮乙醇溶液检测微球为白色,即证明Lys(Boc)-OEt交联到微球上。然后抽去液体,用DMF、异丙醇交替洗涤微球3遍,抽掉洗涤液体。向烧杯中加入25%(体积分数)的三氟乙酸(TFA)/DCM溶液,室温搅拌1 h,脱除Boc保护基团^[20],用上述茚三酮检测微球为黑色,说明Boc保护基团被脱除。抽去液体,用DMF、异丙醇交替洗涤微球3遍,抽掉洗涤液体。向烧杯中依次加入10 mL的DMF溶液,0.85 mL(8 mmol)的氯乙酸乙酯,1.4 mL(8 mmol)的DIEA,室温搅拌约24 h。用上述茚三酮检测微球为白色,说明氯乙酸乙酯已与微球上的氨基反应。抽去液体后,用DMF、异丙醇交替洗涤3遍,抽掉洗涤液体。加入20 mL 10%(质量分数)的NaOH溶液,室温搅拌1 h,将酯基水解。再用超纯水洗涤微球3遍,滤掉液体,抽干。加入10 mL 200 mmol/L的六水合二氯化镍(NiCl₂\56H₂O)溶液,室温搅拌1 h,抽滤除去液体后,用水洗涤直至洗涤液中无Ni²⁺,即得到Ni²⁺亲和色谱介质。

制备反应的流程示意图见图 1。

图 1

Fig. 1

图 1 制备反应的流程示意图 Fig. 1 Schematic diagram of preparation TFA: trifluoroacetic acid; DCM: dichloromethane.

微球检测:本文采用多肽固相合成的检测方法,即茚三酮显色法^[21],能够快速测定微球上的氨基,通过颜色变化来对反应完成度进行判定。具体方法是:取少量洗涤并滤干的微球于试管中,加入2~3 mL的茚三酮溶液,在电热恒温水箱(100 ℃)中放置2~3 min,将试管放在装有摄像头的电脑上观察微球颜色,并记录。

Ni²⁺的检测:本文采用丁二酮肟法,能够快速检测镍离子是否螯合到微球上,并判断介质对镍离子的螯合程度。也可以快速检测水洗涤液中是否有镍离子,操作简便、灵敏。具体方法是:配制1%(质量分数)的丁二酮肟乙醇溶液50 mL,滴加浓氨水调pH到8左右。取少量洗涤并滤干的微球于3 mL的离心管中,加入2 mL的丁二酮肟溶液,摇匀,观察微球的颜色并记录。取2 mL的丁二酮肟于4 mL离心管中,收集水洗涤液,摇匀,观察丁二酮肟溶液的颜色变化。

取10 mg的His-Lys-Tyr或Phe-His-Thr三肽溶于4 mL的超纯水中,制成样品溶液备用。

将制备好的镍离子亲和介质加超纯水悬浮后装入柱体积为8 mL(规格:10.5 cm×1 cm)的玻璃色谱柱中,并将其连接到AKTA purifier设备上(检测器UV-900,监测波长215 nm),用超纯水平衡色谱柱,待基线稳定后,开始上样。上样量为4 mL,上样流速为2 mL/min,洗脱流速为5 mL/min。上样后,用超纯水洗脱,待样品穿柱峰出现时开始收集穿柱液,之后洗脱到基线平衡后收集平衡洗脱液。再用10倍柱体积的200 mmol/L咪唑水溶液恒流洗脱并收集洗脱液。用HPLC分别测定样品溶液、穿柱液、平衡洗脱液及咪唑洗脱液中的样品成分。

HPLC分析条件:流动相A为0.065%(体积分数) TFA/H₂O,流动相B为0.05%(体积分数) TFA/ACN;洗脱程序为0~30 min,1%B~51%B;流速1 mL/min;柱温25 ℃;检测波长215 nm;进样量20 μL。

取10 mg的His-Lys-Tyr三肽以及5 mg的Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg六肽分别溶于4 mL的超纯水及pH 7.4的PBS缓冲液(含1 mol/L NaCl)中,制成样品备用。

在混合肽分离纯化实验中采用两种缓冲液体系进行分离效果的比较。上样缓冲液:a) 超纯水,b) pH 7.4 20 mmol/L PBS缓冲液(含1 mol/L NaCl);洗脱液:a) 200 mmol/L咪唑水溶液,b) pH 7.4 20 mmol/L PBS缓冲液(含200 mmol/L咪唑,1 mol/L NaCl)。

纯化操作同上。用HPLC分别分析样品溶液、穿柱液、平衡洗脱液及咪唑洗脱液中的成分。

HPLC分析条件同上,除咪唑洗脱液进样量为80 μL外,其他成分进样量均为20 μL。

将使用后的介质,用3倍介质体积的脱镍溶液(含1 mol/L NaCl的50 mmol/L EDTA,pH 8.0)过柱洗脱,再用5倍介质体积的0.5 mol/L的NaOH过柱洗脱,之后用10倍以上介质体积的超纯水冲洗,洗完后用丁二酮肟检测微球及水洗脱液。待微球和洗脱液都检测为阴性时,用3倍介质体积的NiCl₂溶液过柱,超纯水冲洗柱,至洗脱液中检测不到Ni²⁺。再用丁二酮肟检测微球,即可判断亲和介质是否再生成功。

取2 g已制备好的镍离子亲和介质,加入15 mL含1 mol/L NaCl的50 mmol/L乙二胺四乙酸二钠(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),浸泡并搅拌30 min,取上清液,在紫外分光光度下测吸收值,对照Ni²⁺标准曲线,计算镍离子含量,即可得到镍离子载量。

采用DCC法制备的Lys(Boc)-OEt收率为68%,熔点120.5~125.5 ℃,相对分子质量为274.246,质谱数据:m/z 292.56(M+18,丰度100%),m/z 275.32(M+H,丰度30%)。其H-NMR数据为:1H NMR(400 MHz,MeOD) δ 3.63(q,J=7.0 Hz,2H),3.33(dt,J=3.2,1.6 Hz,2H),2.60(d,J=7.7 Hz,1H),1.92~1.51(m,2H),1.45(m,2H),1.20(t,J=7.0 Hz,3H)。再结合IR可确定合成产物即为Lys(Boc)-OEt。

微球的检测主要分阴性检测(微球为白色)和阳性检测(微球为黑色,颜色也会因氨基酸而异)。阴性检测说明微球上没有氨基裸露,阳性检测说明微球上有氨基裸露,以此来判断Lys(Boc)-OEt、氯乙酸乙酯是否偶联到氯球上,检测的标准是使检测的通过率达到98%以上。

Lys(Boc)-OEt的偶联:Lys(Boc)-OEt有一端氨基被Boc基团保护,另一端未被保护的氨基可连接到氯球上。因此微球检测为阴性检测,显白色,如图 2a所示,说明偶联成功。

图 2

Fig. 2

图 2 微球的观察结果 Fig. 2 Observation results of microspheres a. microspheres coupling with Lys(Boc)-OEt; b. microspheres removed the Boc; c. microspheres coupling with ethyl chloroacetate.

脱Boc后的检测:当Boc保护基脱除后,被保护的氨基裸露出来,微球检测为阳性检测,显黑色,如图 2b所示,说明脱保护成功。

偶联氯乙酸乙酯:微球脱保护后氨基裸露,与氯乙酸乙酯在碱性条件下反应,使氨基上的氢被氯乙酸乙酯取代,此时检测为阴性检测,微球显白色,如图 2c所示,说明偶联成功。

丁二酮肟又称为镍试剂,是用来测定镍的专一试剂,其原理是在碱性溶液中,丁二酮肟与镍离子生成玫红色配合物。用丁二酮肟检测微球时,使其变成玫红色,说明微球上结合了Ni²⁺,根据颜色的深浅可以判断螯合镍离子的量,如图 3所示。

图 3

Fig. 3

图 3 负载Ni2+的微球 Fig. 3 Microspheres with Ni2+

用水洗涤柱以除去未结合的Ni²⁺,是否除去完全用丁二酮肟检测洗涤液来判断。若水洗涤液变成玫红色并有少量沉淀,即还存在未结合Ni²⁺,直至水洗涤液不再变色说明未结合的Ni²⁺被冲洗完全。

组氨酸与金属离子作用较强,因此本文用自制的镍离子亲和介质对含组氨酸的His-Lys-Tyr三肽及Phe-His-Thr三肽进行亲和性能测试。测试自制镍离子亲和介质是否对含组氨酸的短肽具有结合能力；并对His-Lys-Tyr三肽与Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg六肽的混合样品进行了纯化测试。

对样品溶液、穿柱液、平衡洗脱液(水洗液)及咪唑洗脱液的HPLC分析结果如图 4所示。与样品溶液相比,穿柱液中三肽峰高减小,这是因为样品在纯化过程中被稀释，同时部分含组氨酸的样品保留在色谱柱上。从基线平衡时水洗液的色谱图可以看出未结合三肽已经被洗脱完全。当用咪唑溶液洗脱时,三肽峰又出现了,说明被亲和作用结合的三肽被洗脱下来。以上结果说明所制亲和介质对含组氨酸的三肽有亲和能力。采用咪唑溶液洗脱时三肽色谱峰很小,一方面是因为咪唑浓度很大,显得三肽峰小,另一方面,在洗脱过程中被稀释了。

图 4

Fig. 4

图 4 His-Lys-Tyr的色谱图 Fig. 4 HPLC chromatograms of His-Lys-Tyr

样品溶液、穿柱液、平衡洗脱液及咪唑洗脱液的HPLC分析结果如图 5所示。样品溶液色谱图显示该三肽的出峰时间为11.766 min,在该峰之前至少还有3个杂质峰。这些杂质峰在穿柱液中还隐约可见。经水洗至基线后,再用咪唑溶液洗脱,在三肽之前出峰的杂质就被除去了。这进一步说明所制亲和介质对含组氨酸的三肽具有亲和能力。

图 5

Fig. 5

图 5 Phe-His-Thr的色谱图 Fig. 5 HPLC chromatograms of Phe-His-Thr

超纯水缓冲体系 混合样品溶液、穿柱液、平衡洗脱液及咪唑洗脱液的HPLC分析结果如图 6所示。与混合样品溶液的色谱图相比,穿柱液中三肽和六肽的色谱峰都降低了,这一方面是因为部分含组氨酸的三肽与镍柱结合,另一方面说明样品在纯化过程中被稀释。水洗至基线平衡后,用咪唑溶液洗脱,此时洗脱液中只有含组氨酸的三肽,而没有不含组氨酸的六肽。这是因为六肽不含组氨酸,不能与介质产生亲和作用,在基线洗脱过程中被洗出了,而含组氨酸的三肽能够产生亲和作用,被保留。当用咪唑溶液洗脱时,才被洗出,达到与其他不含组氨酸的杂质分离的目的。

图 6

Fig. 6

图 6 超纯水体系中混合样品的色谱图 Fig. 6 HPLC chromatograms of mixed sample

磷酸盐缓冲体系 混合样品溶液、穿柱液、PBS平衡洗脱液及咪唑洗脱液的HPLC分析结果如图 7所示。可以看出,混合样品溶液和穿柱液在PBS平衡之前均存在两种肽,PBS缓冲液洗至基线平衡后,用含200 mmol/L咪唑的PBS洗脱液洗脱,其色谱图显示只存在含组氨酸的三肽,不存在不含组氨酸的六肽。在相同的HPLC分析条件下分析PBS缓冲液及含咪唑的PBS洗脱液,可以确定三肽前的一些杂峰均来自磷酸盐缓冲液。在纯化条件相同的情况下,图 7与图 6的咪唑洗脱液色谱图中均可以找到含组氨酸的三肽峰,六肽因不含组氨酸与镍柱没有亲和作用而均被分离,因此缓冲液体系的不同不会影响自制镍柱对含组氨酸多肽的分离效果。

图 7

Fig. 7

图 7 磷酸盐缓冲液体系中混合样品的色谱图 Fig. 7 HPLC chromatograms of mixed sample on the homemade column

采用GE Healthcare制造的商品化琼脂糖基质镍柱Ni Sepharose^TM 6 Fast Flow,使用磷酸盐缓冲液体系纯化操作,分析结果如图 8所示。

图 8

Fig. 8

图 8 混合样品在商品镍柱上的色谱图 Fig. 8 HPLC chromatograms of mixed sample on the commercial column

比较图 7与图 8,自制镍柱与商品镍柱均对含组氨酸的三肽有亲和作用,而不含组氨酸的六肽均被除去。且图 7与图 8的咪唑洗脱液的色谱图显示三肽峰的出峰时间与出峰形态基本一致,因此自制镍柱可以达到与商品镍柱同样的分离效果。

用丁二酮肟检测法比较脱镍及重新螯合镍后微球的颜色变化就能定性确定再生是否成功。脱镍后微球没有明显的玫红色,而重新用镍溶液过柱后微球有明显的玫红色,且颜色很深,表明再生成功。

EDTA与Ni²⁺形成的配合物的最大吸收波长为593 nm。配制不同浓度的Ni²⁺标准溶液,与EDTA反应后在593 nm处检测并以Ni²⁺浓度对吸收值进行线性回归,其线性方程为Y=8.185 7X-0.004,r²=0.997 6,其中Y为吸收值,X为Ni²⁺的浓度(mol/L)。测定由EDTA溶液螯合洗脱的Ni²⁺溶液的吸收值,从标准曲线中计算得出Ni²⁺浓度为0.003 5 mol/L。计算得到每克微球载Ni²⁺量为3.08 mg或52.5 μmol。

考察pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0共6个不同pH值的缓冲液对自制镍离子亲和介质的影响。分别取6份1 mL的镍离子亲和介质于5 mL的离心管中,再分别加入2 mL的不同pH值的缓冲液,浸泡30 min后,从6个离心管中各取1 mL的上清液加入装有2 mL丁二酮肟溶液的离心管中,静置15 min之后,测定各离心管中丁二酮肟与Ni²⁺形成的配合物在440 nm波长下^[22]的吸收值,其吸收值分别为0.080 2、0.070 4、0.062 4、0.035 2、0.029 8、0.034 9。

另取0.404 9 g NiCl₂\56H₂O溶于水中并稀释至1 000 mL,此时1 mL溶液含0.1 mg镍,再将其稀释成1 mL含10 μg镍的标准溶液,取1 mL的镍标准溶液加入装有2 mL丁二酮肟溶液的离心管中,静置15 min,测定其吸收值为0.086 6。

结果显示在pH 3.0~6.0的范围内,吸收值随pH值的增加呈递减趋势;pH 6.0~8.0之间,吸收值基本一致。通过与标准镍溶液(10 μg/mL)的吸收值比较,各pH值下的吸收值均低于标准镍溶液的吸收值,说明Ni²⁺洗脱损失整体都很小,而且酸性时比偏碱时稍高。

金属离子亲和色谱介质常用琼脂糖凝胶,螯合剂为亚氨基二乙酸。由于凝胶不耐压,而且价格较贵,因此考虑使用价廉、耐压的氯球替代。氯球是氯甲基苯结构,若继续用亚氨基二乙酸螯合剂则可能会因空间位阻影响亲和能力。因此,用赖氨酸替代亚氨基二乙酸,相当于在螯合剂和微球之间加了间隔臂,应该有利于亲和作用。初步的结果显示,它能够选择性地亲和含组氨酸的短肽,并使之与不含组氨酸的物质分离。至于赖氨酸的手性是否对于手性异构体有区别能力,还需做进一步的研究。

本文以氯甲基化聚苯乙烯交联微球为载体,把赖氨酸偶联到微球上,再与氯乙酸酯耦合制成新型镍离子亲和介质。该介质制备方法操作方便,反应条件温和,所用原料便宜易得。所制亲和介质对含组氨酸的短肽具有选择性亲和作用,容易与不含组氨酸的其他物质分离,达到了商品化琼脂糖基质镍柱的效果。而且纯水洗脱与用缓冲液洗脱的分离效果没有区别,这也使得该介质的应用范围更加宽广。相信该介质在短肽合成纯化、含组氨酸短肽分析方面会有广阔的应用前景。