有机氯农药(organochlorine pesticides,OCPs)是一类高效、广谱的杀虫剂,由于其稳定性强而不易降解的特点,致使其易在食品及各种农产品中残留^[1]。有机氯农药残留量低,测定时易受复杂基质的干扰^[2],因此建立简便快速、高选择性、高灵敏度的有机氯农药检测技术一直是农残检测中的热点问题。

有机氯农药残留主要采用气相色谱法(GC)^{[3, 4]}和气相色谱-质谱法(GC-MS)^{[5, 6, 7]}测定。目前烟草行业测定有机氯的标准方法(YC/T 405.2-2011)为GC法^[8],该方法前处理复杂,缺乏有机氯农药的定性信息。GC-MS法则能提供目标物的质谱信息,增加定性的准确性,其常用的电子轰击电离(EI)源灵敏度高,但易受复杂样品中基质的干扰,对样品前处理要求较高^{[6, 7]};与EI源相比,负化学电离(NCI)源对含有电负性基团(如-Cl、-F、=S、-O-、-P=O等)的分析物具有高选择性和高灵敏度,可有效减少基质干扰,提高灵敏度,更适合分析具有较强电负性的物质^[9]。NCI作为一种软电离技术,能使大部分待测物质得到一个强的准分子离子峰,碎片较少,图谱简单,易于解析,大大增加了定性的准确性^[10]。此外,以高分辨飞行时间质谱(TOF-MS)作为质量分析器,可实现精确质量数的测定,提高痕量农药鉴定的准确性^{[11, 12]}。目前,国内外学者已将GC-NCI-MS技术成功应用于有机磷^[13]、有机氯^{[5, 6, 7]}、拟除虫菊酯类^[14]等农药残留的分析检测中,但关于GC-NCI-TOF-MS技术应用的报道则很少,如多溴联苯醚^[15]等的测定。

本文拟结合QuEChERS方法在复杂样品前处理中简便快速、净化效果好的优势^{[16, 17]},以及GC-NCI-TOF-MS法快速、高选择性、高灵敏度、定性准确的优势,建立了一种简捷、快速、准确的方法定性和定量分析烟草中有机氯农药残留。

GCT Premier气相色谱-飞行时间质谱联用仪(美国Waters公司); 3K30高速冷冻离心机(德国Sigma公司); VX-200漩涡混合仪(美国Labnet公司);样品定量浓缩仪(瑞士Buchi公司); BT224S电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司); Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)。

丙酮、正己烷、乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司);乙酸乙酯为色谱纯(美国Sigma-Aldrich公司);冰乙酸为分析纯(国药集团化学试剂有限公司);六氯苯(hexachlorobenzene)、 α -六氯环己烷( α -HCH)、 β -六氯环己烷( β -HCH)、 δ -六氯环己烷( δ -HCH)、林丹(lindane)、七氯(heptachlor)、艾氏剂(aldrin)、顺-氯丹(cis-chlordan)、反-氯丹(trans-chlordan)、狄氏剂(dieldrin)标准物质均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司,纯度≥99% ; SampliQ QuEChERS EN萃取试剂盒(4.0 g无水硫酸镁、1.0 g氯化钠、1.0 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠),QuEChERS分散固相萃取试剂盒①(150 mg无水硫酸镁、50 mg N-丙基乙二胺(PSA)键合固相吸附剂),QuEChERS分散固相萃取试剂盒②(150 mg无水硫酸镁、50 mg C₁₈吸附剂、50 mg N-丙基乙二胺键合固相吸附剂)均购自美国Agilent公司;烟草样品采集于玉溪市峨山县。

按照YC/T 31^[18]规定制备烟末样品(40目),称取2 g烟末样品(精确至 0.000 1 g),置于50 mL具盖离心管中,加入10 mL水,振荡至样品被水充分浸润后,静置10 min。准确移取10 mL乙酸乙酯-正己烷(1: 1,v/v)溶液至离心管中,以 2 000 r/min 振荡2 min,于-18 ℃冷冻保存10 min后,加入SampliQ QuEChERS EN萃取试剂盒,立即以 2 000 r/min 振荡2 min,然后以 6 000 r/min 离心5 min。将上清液转移至定量浓缩仪中,于35 ℃浓缩至近干,用1 mL乙酸乙酯-正己烷(1: 1,v/v)溶液溶解残渣。

将上述复溶得到的溶液转移至QuEChERS分散固相萃取试剂盒①中,以 2 000 r/min 振荡2 min,然后以 6 000 r/min 离心5 min,取上清液经0.22 μ m有机相滤膜过滤,待进样。

混合标准储备液:分别准确称取2.0 mg六氯苯、顺-氯丹、反-氯丹,10.0 mg α -六氯环己烷、 β -六氯环己烷、 δ -六氯环己烷、林丹、七氯、艾氏剂、狄氏剂于100 mL容量瓶中,用乙酸乙酯-正己烷(1: 1,v/v)溶解并定容,配制10种有机氯农药的混合标准储备液。

混合标准使用液:准确移取1.0 mL混合标准储备液于100 mL容量瓶中,用乙酸乙酯-正己烷(1: 1,v/v)溶解并定容,配制10种有机氯农药的混合标准使用液。

系列混合标准溶液:分别准确移取0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mL的混合标准使用液于10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯-正己烷(1: 1,v/v)稀释定容,配制系列混合标准溶液,其中六氯苯、顺-氯丹、反-氯丹的质量浓度分别为0.001、0.002、0.004、0.01、0.02、0.04和0.1 mg/L,α -六氯环己烷、 β -六氯环己烷、 δ -六氯环己烷、林丹、七氯、艾氏剂、狄氏剂的质量浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 mg/L。

色谱柱:DB-35 MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m);进样口温度:260 ℃;载气:氦气,纯度≥99.999% ;恒流流速:1 mL/min;进样量:1 μ L,不分流进样;程序升温:起始温度50 ℃,保持1 min;以25 ℃/min 升温至180 ℃;以3 ℃/min 升温至200 ℃;以10 ℃/min 升温至280 ℃,保持5 min。

离子源:NCI;电离能:50 eV;离子源温度:180 ℃;发射电流:200 μ A;传输线温度:250 ℃;溶剂延迟:7 min;反应气:甲烷(纯度≥99.999% );扫描范围:m/z 50～650; 10种有机氯农药的保留时间、测定值、预测值及其他参数见表 1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 10种有机氯农药的保留时间、测定值、预测值及其他参数 Table 1 Retention times, measured values, predicted values and other parameters of the 10 organochlorine pesticides No. Compound Retention time/min Measured value ( m/z) Predicted value ( m/z) Error/10 -6 Elemental composition 1 hexachlorobenzene 11.38 283.8093 283.8102 -3.0 C 6 35Cl 5 37Cl 2 α-HCH 11.73 254.8887 254.8883 1.6 C 6H 6 35Cl 4 37Cl 3 lindane 13.15 254.8885 254.8883 0.9 C 6H 6 35Cl 4 37Cl 4 β-HCH 14.12 254.8887 254.8883 1.6 C 6H 6 35Cl 4 37Cl 5 heptachlor 14.41 299.8647 299.8648 -0.3 C 10H 3 35Cl 4 37Cl 6 δ-HCH 15.02 254.8892 254.8883 3.6 C 6H 6 35Cl 4 37Cl 7 aldrin 15.38 329.9114 329.9118 -1.1 C 12H 9 35Cl 4 37Cl 8 trans-chlordan 17.61 409.7924 409.7919 1.3 C 10H 6 35Cl 6 37Cl 2 9 cis-chlordan 17.86 409.7925 409.7919 1.5 C 10H 6 35Cl 6 37Cl 2 10 dieldrin 18.68 379.8673 379.8677 -1.1 C 12H 8 35Cl 5 37ClO

表1 10种有机氯农药的保留时间、测定值、预测值及其他参数 Table 1 Retention times, measured values, predicted values and other parameters of the 10 organochlorine pesticides

采用经典的QuEChERS方法提取烟草样品中10种有机氯农药,并对提取溶剂进行优化。根据相似相溶原理选择提取溶剂,考察了0.1%(v/v) 乙酸/乙腈、正己烷、乙酸乙酯、丙酮-正己烷(1: 1,v/v)、乙酸乙酯-正己烷(1: 1,v/v)作为提取溶剂的提取效果,加标烟草样品的回收率如图 1所示。综合比较,当乙酸乙酯-正己烷(1: 1,v/v)作为提取溶剂时,10种有机氯农药的回收率最高,且质谱图杂峰少,选择性好。

图1

Fig. 1

图1 不同提取溶剂对烟草样品中10种有机氯 农药回收率的影响 Fig.1 Effect of extraction solvents on recoveries of 10 OCPs in tobacco samples EtOAc: ethyl acetate; For Nos. 1-10, see Table 1.

烟草样品的提取液中含有色素、脂肪等基体组分,采用分散固相萃取法进行进一步净化。目前,分散固相萃取法常采用PSA、C₁₈、石墨炭黑(GCB)等对样品提取液进行净化。PSA可以去除提取液中大量的脂肪酸;C₁₈对油脂类物质具有较好的吸附效果,但分析低脂肪基质时,可能会降低农药的回收率;GCB对含有大量色素的样品的基质净化效果比较明显,能有效去除色素和固醇类物质,但对六氯苯等具有平面结构的农药会产生吸附作用^[19]。因此,结合本实验分析的样品基质和农药类型,选用PSA和C₁₈作为分散固相萃取剂,考察两种不同萃取剂对净化效果的影响:(a)50 mg PSA、150 mg MgSO₄; (b) 50 mg PSA、50 mg C₁₈、150 mg MgSO₄。两种萃取剂所得烟草样品的TIC色谱图如图 2所示。结果表明,两种萃取剂对基质的净化效果无明显差异,但加入C₁₈吸附剂后,10种有机氯农药的回收率均出现一定程度的降低,尤其是六氯苯、 α -HCH、林丹、反-氯丹,这与文献报道的以C₁₈作为吸附剂会导致部分农药的回收率降低^[20]一致。

图2

Fig. 2

图2 两种不同萃取剂对烟草样品的总离子色谱图 Fig.2 Total ion chromatograms of tobacco samples with different absorbents a. 50 mg PSA, 150 mg MgSO4; b. 50 mg PSA, 50 mg C18, 150 mg MgSO4. For peaks 1-10, see Table 1.

有机氯农药残留量低,且处理后仍有少量干扰物,因此采用较缓的升温程序,使干扰物与目标物分离。如图 3所示,10种有机氯农药在优化后的升温程序下均实现良好分离。分别比较了进样口温度为220、240和260 ℃时10种有机氯农药的响应值。结果表明,进样口温度越高,目标物的响应越强。当进样口温度为260 ℃时,10种有机氯农药的响应值比220 ℃时提高了12.1%～26.8% 。因此将进样口温度设为260 ℃。

图3

Fig. 3

图3 烟草样品中10种有机氯农药的总离子色谱图 Fig.3 Total ion chromatogram of the 10 organochlorine pesticides in a tobacco sample For peaks 1-10, see Table 1.

选取响应值高的分子离子(准分子离子)或碎片离子作为特征离子,对电离能等质谱参数进行优化。发现当电离能为50 eV时,目标物的响应值最高。其他优化的质谱参数见表 1。图 3为优化条件下烟草样品中10种有机氯农药混合标准溶液的TIC色谱图。选择的特征离子响应值高,选择性好,不受烟草中其他组分的影响,抗基质干扰能力强。

在NCI源中,试样分子主要通过俘获电子形成分子离子,或者在撞击下经半异裂解脱去自由基形成阴离子碎片。大部分有机氯农药得到的碎片较少,结构相对稳定的分子则直接得到一个强的准分子离子峰,增加了定性的准确性。六氯苯仅产生一个强的分子离子峰(见图 4a); α -HCH的分子离子在NCI源中不稳定,脱去一个Cl后形成阴离子碎片(见图 4b)。

图4

Fig. 4

图4 (a)六氯苯和(b) α -HCH的NCI-MS质谱图 Fig.4 NCI-MS spectra of (a) hexachlorobenzene and (b) α -HCH

高分辨质谱的质量精度能达到10^-6级,再结合原子组成的限定条件,可以初步确定分子离子和碎片离子的元素组成^[11]。有机氯化合物中含有多个氯元素,且氯元素的两个同位素³⁵Cl和³⁷Cl在自然界中均有较高的丰度,可以在分子离子或准分子离子以及碎片离子区域看到氯元素的同位素离子峰簇^[12]。选择特征离子,根据测定的相对分子质量推测元素组成,结果见表 1。10种有机氯农药的特征离子与理论质量数误差均小于5×10^-6,在可接受的误差范围内,可用于推测元素组成。

此外,可根据氯元素的同位素峰簇强度比进一步确认化合物的元素组成。如图 4a所示,通过同位素离子峰簇以及峰簇内各峰的强度比,对六氯苯定性分析。六氯苯中分子离子同位素峰簇中响应最强的5个化合物的组成分别为C₆³⁵Cl₆、C₆³⁵Cl₅³⁷Cl、C₆³⁵Cl₄³⁷Cl₂、C₆³⁵Cl₃³⁷Cl₃、C₆³⁵Cl₂³⁷Cl₄,测得的响应强度比为52.7: 100: 80.2: 33.6: 8.7,和理论计算值52.1: 100: 79.9: 34.1: 8.2十分接近。 α -HCH 的离子峰簇见图 4b,响应最强的5个化合物的组成分别为C₆H₆³⁵Cl₅、C₆H₆³⁵Cl₄³⁷Cl、C₆H₆³⁵Cl₃³⁷Cl₂、C₆H₆³⁵Cl₂³⁷Cl₃、C₆H₆³⁵Cl₄³⁷Cl,测得这5个化合物的响应强度比为60.8: 100: 62.3: 21.1: 3.0,和理论计算值62.5: 100: 64.0: 20.5: 3.3也十分接近。

综上分析,有机氯化合物中含氯的特征离子的质荷比、丰度比和保留时间可共同用于有机氯农药的定性鉴定,从而提高定性分析的可靠性。

用乙酸乙酯-正己烷(1: 1,v/v)溶液配制系列混合标准溶液并进行测定,以各离子的响应峰面积对质量浓度绘制标准曲线。将不含本实验所测定的10种有机氯农药的空白烟草样品按1.2节处理后,测定20次,以空白响应的3倍标准偏差作检出限,10倍标准偏差作定量限;加标烟草样品按照1.2节处理后测定,做7次平行试验,计算峰面积的相对标准偏差。线性范围、相关系数、检出限及精密度等信息见表 2。由表 2可知,本方法与YC/T 405.2-2011标准方法相比,具有更低的定量限。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 烟草样品中10种有机氯农药的线性范围、相关系数(r2)、检出限、定量限、相对标准偏差和回收率 Table 2 Linear ranges, correlation coefficients (r2), LODs, LOQs, RSDs and recoveries of the 10 OCPs in tobacco samples Compound Linear range/(mg/L) r2 RSD( n=7)/% LOD/(μg/kg) LOQ/(μg/kg) Recovery( n=5)/% LOQ of YC/T 405.2-2011 [8]/(μg/kg) Hexachlorobenzene 0.001-0.100 0.9997 4.7 0.04 0.13 90.4-93.0 3 α-HCH 0.005-0.500 0.9994 5.6 0.19 0.62 85.1-86.5 3 Lindane 0.005-0.500 0.9992 4.3 0.20 0.66 86.1-87.3 3 β-HCH 0.005-0.500 0.9997 5.1 0.75 2.48 82.1-84.3 8 Heptachlor 0.005-0.500 0.9996 6.5 0.53 1.74 77.2-78.0 5 δ-HCH 0.005-0.500 0.9991 5.0 0.33 1.09 87.5-89.6 5 Aldrin 0.005-0.500 0.9972 3.9 0.38 1.24 86.9-89.5 3 trans-Chlordan 0.001-0.100 0.9999 4.0 0.09 0.29 87.8-88.3 5 cis-Chlordan 0.001-0.100 0.9999 3.7 0.13 0.42 85.3-86.9 5 Dieldrin 0.005-0.500 0.9995 5.1 0.80 2.64 90.5-91.5 5

表2 烟草样品中10种有机氯农药的线性范围、相关系数(r2)、检出限、定量限、相对标准偏差和回收率 Table 2 Linear ranges, correlation coefficients (r2), LODs, LOQs, RSDs and recoveries of the 10 OCPs in tobacco samples

在空白烟草样品中分别添加低、中、高三种浓度的混合标准溶液,其中六氯苯、反-氯丹和顺-氯丹的加标水平分别为2.0、10.0和50.0 μ g/kg,其余农药的加标水平分别为5.0、25.0和100.0 μ g/kg。将加标烟草样品静置过夜,待充分吸收后,按1.2节处理测定,做5次平行试验,回收率结果见表 2,满足农药残留分析的可靠性要求。

采用本实验建立的方法对2个加标烟草样品进行测定,并与YC/T 405.2-2011标准方法测定的结果进行比较,结果见表 3。由表 3可知,两种方法对实际样品的测定结果无明显差异。本方法前处理操作简便,能实现对烟草中10种有机氯农药的准确定性鉴定与定量分析。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 烟草样品中10种有机氯农药的含量(n=3) Table 3 Contents of 10 organochlorine pesticides in tobacco samples (n=3) Compound Sample 1/(μg/kg) Sample 2/(μg/kg) The established method YC/T 405.2-2011 [8] The established method YC/T 405.2-2011 [8] Hexachlorobenzene 4.2±0.4 4.4±0.4 21.1±1.2 21.4±1.6 α-HCH 10.1±0.8 10.4±0.9 50.8±2.1 50.2±4.1 Lindane 10.5±0.6 10.3±0.7 51.2±2.6 50.8±3.3 β-HCH 10.8±0.5 11.0±0.6 50.1±1.9 50.6±2.6 Heptachlor 10.0±0.6 10.8±0.7 50.5±1.6 51.2±2.6 δ-HCH 10.3±0.4 10.6±0.6 50.3±2.8 50.8±3.0 Aldrin 10.9±0.5 10.7±0.9 50.9±3.1 50.2±4.2 trans-Chlordan 4.3±0.3 4.5±0.5 20.9±0.9 20.2±1.4 cis-Chlordan 4.3±0.4 4.2±0.4 20.7±1.1 20.4±1.3 Dieldrin 10.6±0.8 10.9±0.9 51.3±2.5 51.8±3.2

表3 烟草样品中10种有机氯农药的含量(n=3) Table 3 Contents of 10 organochlorine pesticides in tobacco samples (n=3)

本文将QuEChERS前处理方法和GC-NCI-TOF-MS检测技术应用于烟草中10种有机氯农药残留的定性鉴定和定量分析。结合负化学电离源对有机氯农药的高选择性和灵敏度,以及高分辨飞行时间质谱的精确质量测定,得到有机氯农药特征离子的精确质量数、同位素离子峰簇、碎片离子丰度比和保留时间,从而实现10种有机氯农药的定性鉴定。该方法检出限低,定量准确,适用于有机氯农药残留的检测分析。