具有旋光活性的高分子(又称手性聚合物)基于它的手性结构而具有广泛的应用,其中一个很重要的应用领域就是手性识别,手性聚合物的这种识别能力已经应用于分子识别、手性拆分以及不对称催化领域中^{[1,2,3,4,5,6]}。手性聚合物最实际和广泛的应用是在高效液相色谱(HPLC)中作为手性固定相(CSP)来分离外消旋化合物^[7,8]。在众多的聚合物基手性固定相中,键合型手性固定相具有溶剂耐受性好,分离模式灵活等优点,已经成为一类重要的手性固定相^[9]。

聚(甲基)丙烯酰胺衍生物已经被证实是一类优良的HPLC手性固定相材料,主要用于极性对映体特别是手性药物的拆分^[10,11]。研究表明,聚(甲基)丙烯酰胺衍生物CSP的手性识别能力很大程度上取决于其规整的高级结构^{[12,13,14,15,16,17]}。

本文设计合成了一种新型的光学活性丙烯酰胺衍生物——(S)-1-丙烯酰-2-(N-苯基甲酰胺基)吡咯烷((S)-APACP),在Lewis酸存在下,通过自由基聚合将其键合到硅胶表面,制备键合型手性固定相,采用HPLC评价了手性固定相的识别能力,并讨论了Lewis酸和流动相组成对其手性识别能力的影响。

Jasco高效液相色谱系统,包括Co-2060柱温箱、PU-2089泵、UV-2070紫外吸收检测器和CD-2095圆二色手性检测器等(日本Jasco公司); Avance III 500核磁共振波谱仪(德国Bruker仪器有限公司); PL341旋光自动分析仪(美国PE公司); J-810圆二色光谱仪(日本Jasco公司); Waters Delta 600凝胶渗透色谱仪(美国Waters仪器公司); T50型热重分析仪(美国TA仪器公司)。

(S)-脯氨酸、丙烯酰氯、1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、三氟甲磺酸钇(Y(OTf)₃)、三氟甲磺酸镱(Yb(OTf)₃)、甲基丙烯酸异氰基乙酯(分析纯,上海晶纯试剂有限公司);氢氧化钠、偶氮二异丁腈(AIBN)、三乙胺(分析纯,天津光复精细化工研究所);乙酸乙酯、甲醇、甲苯、苯胺、四氢呋喃、正己烷、异丙醇、氯仿(分析纯,天津科密欧化学试剂有限公司);正己烷、异丙醇、丙酮、氯仿(色谱纯,天津科密欧化学试剂有限公司)。

单体的合成分两步进行。第一步,以(S)-脯氨酸和丙烯酰氯为原料,在0 ℃冰水浴中,碱性水溶液条件下合成中间产物(S)-1-丙烯酰吡咯烷-2-羧酸((S)-APCA),在乙酸乙酯中进行重结晶;第二步,以二氯甲烷为溶剂,(S)-APCA和苯胺为原料,HOBt和EDC为偶联剂,在0 ℃冰水浴中合成单体(S)-APACP,在正己烷-乙酸乙酯(2∶1,v/v)的混合溶剂中重结晶,得到纯净的(S)-APACP单体。其反应过程如图1所示。

图1

Fig. 1

图1 单体(S)-APACP的合成路线示意图 Fig.1 Synthesis route for monomer (S)-APACP EDC: 1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydrochloride; HOBt: 1-hydroxy benzotriazole; TEA: triethylamine.

键合型手性固定相的制备分3步进行(见图2),第一步——氨丙基硅胶(ASG)的制备:在氮气保护下,以无水甲苯为反应介质,3-氨基丙基三乙氧基硅烷和硅胶为反应原料,于100 ℃下回流反应16 h,冷却到室温,过滤后用甲苯和甲醇洗涤,于60 ℃真空烘箱干燥,得到氨丙基硅胶;第二步——甲基丙烯酸酯衍生化的氨丙基硅胶(MASG)的制备^[13]:在氮气保护下,以无水甲苯为反应介质,氨丙基硅胶和甲基丙烯酸异氰基乙酯反应原料,于90 ℃下回流反应5 h,冷却到室温,过滤后用四氢呋喃和甲醇洗涤,于60 ℃真空烘箱干燥,得到甲基丙烯酸酯衍生化的氨丙基硅胶;第三步——键合型手性固定相(Im-CSP)的制备:将一定量的MASG、单体(S)-APACP、引发剂AIBN和Lewis酸(若需要)加入到反应瓶中,抽真空置换氮气3个循环后,在氮气气氛下加入一定量的反应溶剂甲醇,封闭反应管,于60 ℃下聚合反应24 h,冷却到室温,过滤后用四氢呋喃和甲醇洗涤,于60 ℃真空烘箱干燥,得到键合型手性固定相。

图2

Fig. 2

图2 键合型手性固定相的制备反应路线图 Fig.2 Preparation of immobilized-type chiral stationary phases PAPACP: APACP polymer.

采用上述方法制备的键合型手性固定相因聚合物已键合到硅胶表面,无法对其链结构进行表征,因此,采用自由基聚合法制备了APACP均聚物(PAPACP),具体操作过程如下:向装有玻璃三通的10 mL反应管中加入一定量的单体和Lewis酸(若需要),抽真空置换氮气3个循环后,在氮气气氛下加入一定量的反应溶剂和AIBN溶液,封闭反应管,于60 ℃下聚合反应24 h。向聚合物溶液中加入少许反应溶剂稀释后,将聚合物溶液滴入200 mL甲醇中沉淀聚合物,离心分离,所得聚合物沉淀于60 ℃真空烘箱干燥过夜,称重,计算产率。

以正己烷-异丙醇(90∶10,v/v)混合溶液为匀浆液和顶替液,在40 MPa压力下采用匀浆法将所制备的键合型手性固定相装入不锈钢柱管(250 mm×2 mm)中。

采用Jasco高效液相色谱系统评价聚合物的手性识别能力，在室温下,以不同体积比的不同有机溶剂为流动相(经超声脱气后使用)进行分离,流速为0.1 mL/min。分别用苯和1,3,5-三叔丁基苯测定色谱柱的柱效和死时间(t₀),检测波长为254 nm。用于手性拆分的对映体结构见图3。

图3

Fig. 3

图3 用于手性拆分的对映体 Fig.3 Racemates for chiral separation Ph: phenyl; Co(acac)3: cobalt acetylacetonate.

单体(S)-APACP在正己烷-乙酸乙酯(2∶1,v/v)的混合溶剂中重结晶后,以氘代氯仿为溶剂在室温下测定其核磁共振氢谱,如图4所示。各谱峰的化学位移归属如下:δ=6.48～6.51 (多重峰,2H,双键端碳上的两个质子,1号质子),δ=5.80 (四重峰,1H,双键上的另一个质子,2号质子),δ=3.52～3.72 (多重峰,2H,五元环上与氮原子相连的亚甲基,3号质子),δ=1.76～2.70 (多重峰,4H,五元环上的两个亚甲基,4号、5号质子),δ=4.89 (三重峰,1H,五元环上的次甲基,6号质子),δ=9.79 (单峰,1H,酰胺基团的-NH,7号质子),δ=7.03～7.57 (多重峰,5H,苯环,8号、9号、10号质子)。单体(S)-APACP的比旋光度[α]²⁰_D=240.6°(测试样品浓度c=1.0 g/L,样品池长度l=10 cm,测试溶剂为四氢呋喃)。

图4

Fig. 4

图4 单体(S)-APACP的核磁共振氢谱图 Fig.4 1H NMR spectrum for monomer (S)-APACP TMS: tetramethylsilane.

本研究通过3步化学反应制备了键合型手性固定相,分别在不添加Lewis酸(Im-CSP-1)、添加Lewis酸Y(OTf)₃ (Im-CSP-2)和Yb(OTf)₃ (Im-CSP-3)的条件下通过自由基聚合反应制备了键合型手性固定相,采用热重分析法表征了聚合物的键合量(见图5)。对于ASG,从室温到800 ℃没有明显的失重,失重率仅为0.8%,主要是硅胶上的少量水分及小分子有机物的失去。对于MASG,在170～260 ℃温度区间内,失重率为1.3%,主要是硅胶上键合的有机小分子的失去。对于Im-CSP,3条曲线的失重趋势基本一致,其失重可分为3个阶段,首先是室温到325 ℃有较小的失重,主要是少量水分及有机小分子的失去;第二阶段为325～465 ℃,失重比例较大,可归属为键合到硅胶上的聚合物链的断裂;第三阶段是465～730 ℃,有一定的失重,可归属为剩余聚合物链的失去。根据总失重量可计算键合到硅胶上的聚合物量,并将其列于表1中,Im-CSP的聚合物键合量分别为11.8%、10.9%和10.2%。可见,添加Lewis酸作为催化剂时,聚合物的键合量有所降低。这是由于在反应体系中,除了图2所示的单体(S)-APACP在硅胶表面的键合反应外,溶液体系中还存在单体(S)-APACP的均聚反应,两者相互竞争。聚合体系中加入Lewis酸后,Lewis酸通过与单体的配位作用使单体活化,加速了聚合反应^[15],键合反应与均聚反应竞争的结果是在反应体系中生成了更多的均聚物,因此,加入Lewis酸时,聚合物的键合量略有降低。

图5

Fig. 5

图5 键合型PAPACP手性固定相的热重分析曲线 Fig.5 Thermogravimetric analysis curves of immobilized-type PAPACP chiral stationary phases (CSPs)

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 键合型手性固定相在硅胶上的PAPACP键合量 Table 1 PAPACP content of immobilized-type CSP on silica gel CSP Lewis acid (LA) PAPACP content/% Im-CSP-1 none 11.8 Im-CSP-2 Y(OTf)3 10.9 Im-CSP-3 Yb(OTf)3 10.2 [APACP]0=1.0 mol/L; initiator: AIBN, [AIBN]0=0.02 mol/L; [LA]0=0.1 mol/L; solvent: CH3OH; temperature: 60 ℃; time: 24 h.

表1 键合型手性固定相在硅胶上的PAPACP键合量 Table 1 PAPACP content of immobilized-type CSP on silica gel

表2列出了3种键合型CSP在正己烷-异丙醇(90/10,v/v)为流动相条件下的色谱拆分结果,3种CSP均对7号、9号和10号对映体表现出识别能力,与不添加Lewis酸条件下制备的键合型CSP相比,添加Lewis酸条件下手性固定相对7号和9号对映体的识别能力有一定程度的改善,这可能是由于Lewis酸的存在对聚合物的链结构产生了影响,从而影响了其手性识别能力。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 键合型PAPACP手性固定相的手性识别能力比较 Table 2 Comparison of chiral recognition ability of immobilized PAPACP CSP Racemate in Fig. 3 Im-CSP-1 Im-CSP-2 Im-CSP-3 k1 α k1 α k1 α 1 0.07 1.00 0.06 1.00 0.04 1.00 2 0.10 (+) ～1 0.09 1.00 0.07 1.00 3 1.16 1.00 1.08 1.00 0.99 1.00 4 0.57 1.00 0.56 1.00 0.54 1.00 5 0.31 1.00 0.26 1.00 0.24 1.00 6 1.57 1.00 1.57 1.00 1.56 1.00 7 0.38 (+) 1.27 0.37 (+) 1.32 0.44 (+) 1.32 8 0.38 1.00 0.29 1.00 0.35 1.00 9 0.71 (-) 1.18 0.65 (-) 1.24 0.71 (-) 1.27 10 6.40 (-) ～1 7.63 (-) ～1 7.32 (-) ～1 Mobile phase: hexane/isopropanol, 90∶10 (v/v); column size: 250 mm×2 mm; flow rate: 0.1 mL/min.

表2 键合型PAPACP手性固定相的手性识别能力比较 Table 2 Comparison of chiral recognition ability of immobilized PAPACP CSP

对采用自由基聚合法制备的均聚物PAPACP的手性光学性质进行表征。表3总结了不同反应条件下单体(S)-APACP自由基聚合反应的实验结果,可以发现,在甲醇中,无论是否添加Lewis酸Y(OTf)₃或Yb(OTf)₃作为催化剂,单体(S)-APACP的自由基聚合均获得了具有旋光活性的聚合物,添加Lewis酸Y(OTf)₃和Yb(OTf)₃时,聚合物的比旋光度分别降低了21和26,这表明在Lewis酸存在下,所得聚合物的构象发生了变化。另外,在添加Lewis酸的聚合物反应中,聚合物的相对分子质量略有增加,相对分子质量分布也在一定程度上变宽,这可能与Lewis酸催化下,单体得到活化,聚合速率提高有关。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 添加或不添加Lewis酸情况下(S)-APACP的自由基聚合反应结果a) Table 3 Results for the radical polymerization of (S)-APACP in the absence and presence of Lewis acida) No. Lewis acid (LA) Yield/%b) [α]20Dc) Mn/104d) PDId) 1 none 91.8 -99 3.12 1.91 2 Y(OTf)3 96.7 -78 3.62 2.26 3 Yb(OTf)3 95.9 -73 3.91 2.24 a) [APACP]0=0.5 mol/L; initiator: AIBN, [AIBN]0=0.02 mol/L; solvent: CH3OH; [LA]0=0.1 mol/L; temperature: 60 ℃; time: 24 h. b) Yield: methanol-insoluble part. c) Determined by spectropolarimetry in tetrahydrofuran; sample mass concentration: 1 mg/mL; cell length: 10 cm. d) Tested by gel permeation chromatography (GPC); Mn: number average molecular weight; PDI: polydispersity index.

表3 添加或不添加Lewis酸情况下(S)-APACP的自由基聚合反应结果a) Table 3 Results for the radical polymerization of (S)-APACP in the absence and presence of Lewis acida)

图6为均聚物PAPACP的圆二色光谱(CD谱)图,可以发现,传统自由基聚合获得的聚合物,其圆二色光谱图在π-π^*电子跃迁区域出现两个负的康顿(Cotton)效应,分别在213 nm和238 nm;添加Lewis酸Y(OTf)₃或Yb(OTf)₃作为催化剂时,所得聚合物的CD谱图仍存在上述两个Cotton效应,且强度有所增加,同时在257 nm处出现了一个弱的正Cotton效应。上述结果表明,Lewis酸作为催化剂时,聚合物主链有可能形成了并不完美的单手螺旋片段,其螺旋构象所产生的光学活性效应部分抵消了侧基手性中心对光学活性的贡献^[18],因此聚合物的比旋光度有所降低。

图6

Fig. 6

图6 甲醇中自由基聚合得到的PAPACP的圆二色光谱图 Fig.6 Circular dichroism spectra of PAPACPs prepared by the radical polymerization in methanol

键合型手性固定相的优势在于具有良好的溶剂耐受性,丰富了流动相的选择空间,并且可以通过提高对映体的溶解性而改善拆分效果。本文尝试在流动相中添加极性溶剂四氢呋喃和氯仿,采用HPLC评价键合型手性固定相Im-CSP-3的识别能力,实验结果见表4。当流动相中添加约10%(v/v)的四氢呋喃时(流动相2),Im-CSP-3的识别能力发生了变化,对7号对映体的识别能力有所改善,其拆分的色谱图见图7;同时,对1号、3号和10号对映体也表现出了一定的识别能力,但是对9号对映体的识别能力略有下降。当流动相中添加约10%(v/v)的氯仿时(流动相3),Im-CSP-3的识别能力明显变差,仅对9号对映体表现出较好的识别能力,对1号、3号和7号对映体表现出较弱的识别能力。当流动相为正己烷-四氢呋喃(70/30,v/v)时,手性固定相的识别能力与正己烷-异丙醇(90/10,v/v)作为流动相相比,略有降低。

图7

Fig. 7

图7 乙酰丙酮钴对映体(7#)在Im-CSP-3上拆分的色谱图 Fig.7 Chromatograms for the resolution of racemate 7 Co(acac)3 on Im-CSP-3 Mobile phase: hexane-tetrahydrofuran-isopropanol (90∶10∶1, v/v/v).

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 4种流动相组成对键合型PAPACP手性固定相Im-CSP-3手性识别能力的影响 Table 4 Effect of eluent on the chiral recognition ability of immobilized PAPACP CSP (Im-CSP-3) Racemate in Fig. 3 Mobile phase 1 Mobile phase 2 Mobile phase 3 Mobile phase 4 k1 α k1 α k1 α k1 α 1 0.04 1.00 0.24 (-) ～1 0.56 (-) ～1 0.24 1.00 2 0.07 1.00 0.12 1.00 0.04 1.00 0.01 1.00 3 0.99 1.00 1.33 ～1 1.31 (+) ～1 0.32 1.00 4 0.54 1.00 0.06 1.00 0.01 1.00 0.01 1.00 5 0.24 1.00 0.08 1.00 0.01 1.00 0.01 1.00 6 1.56 1.00 3.73 1.00 0.02 1.00 0.23 1.00 7 0.44 (+) 1.32 0.08 (+) 1.36 0.10 (+) ～1 0.29 (+) 1.26 8 0.35 1.00 0.26 1.00 0.21 1.00 0.08 1.00 9 0.71 (-) 1.27 13.0 (-) 1.17 0.01 (-) 1.11 1.16 (-) 1.09 10 7.32 (-) ～1 8.03 (-) ～1 0.01 1.00 1.10 (-) ～1 Column size: 250 mm×2 mm; flow rate: 0.1 mL/min; mobile phase 1: hexane-isopropanol (90∶10, v/v); mobile phase 2: hexane-tetrahydrofuran-isopropanol (90∶10∶1, v/v/v); mobile phase 3: hexane-chloroform-isopropanol (90∶10∶1, v/v/v); mobile phase 4: hexane-tetrahydrofuran (70∶30, v/v).

表4 4种流动相组成对键合型PAPACP手性固定相Im-CSP-3手性识别能力的影响 Table 4 Effect of eluent on the chiral recognition ability of immobilized PAPACP CSP (Im-CSP-3)

通过两步化学反应合成了新型的光学活性单体(S)-APACP,采用核磁共振氢谱表征了单体的化学结构;通过3步化学反应制备了聚甲基丙烯酰胺衍生物类键合型手性固定相,采用热重分析法表征了聚合物的键合量,采用高效液相色谱评价了键合型手性固定相的识别能力,分析了影响其手性识别能力的因素。该手性固定相具有良好的溶剂耐受性,这不仅扩展了流动相的选择范围,而且还可以通过提高对映体的溶解性而达到良好的拆分效果。