麦香类物质是啤酒中重要的风味物质,主要包括含氧的杂环和含氮的杂环化合物。其来源于糖类和氨基酸的美拉德反应^{[1, 2, 3]}及酵母代谢过程^{[4, 5]}。2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮(2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone,DMHF)和2(或5)-乙基-5(或2)-甲基-4-羟基-3(2H)呋喃酮(2 (or 5)-ethyl-5(or 2)-methyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone,EMHF)都具有甜味、焦糖味,在啤酒中的阈值分别为300和700 μg/L。DMHF在啤酒中的质量浓度在200~700 μg/L之间,经常会超出阈值,是最重要的麦香风味物质。2-乙酰吡咯(2-acetylpyrrole,2-AP)在啤酒中的阈值较高,但同样是代表性的麦香风味物质^{[4, 5, 6]}。3种啤酒麦香风味物质的化学结构式见图 1。

图 1

Fig. 1

图 1 2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮(DMHF)、2(或5)-乙基-5(或2)-甲基-4-羟基-3(2H)呋喃酮(EMHF)和2-乙酰吡咯(2-AP)的化学结构式 Fig. 1 Chemical structures of DMHF, EMHF and 2-AP

啤酒中麦香物质的检测以往以气相色谱-质谱法为主。根据样品前处理方式的不同,主要分为液液萃取-气相色谱-质谱法(GC-MS)^{[5, 6, 7]}和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法^{[8, 9, 10, 11, 12, 13]}。若使用液液萃取方式,进样口超过250 ℃的高温会导致样品中的糖和氨基酸发生美拉德反应,造成假阳性,导致结果偏高;而当采用顶空固相微萃取时,样品要经过萃取纤维头的吸附、脱附,环节较多,采样量偏少,且顶空进样涉及气液平衡,易受扰动,灵敏度和重现性都无法保证。此外,这3种麦香风味物质的沸点在215~250 ℃之间,较难气化。气相色谱-质谱法更适合检测沸点较低如吡嗪类的麦香风味物质。超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)由于其特有的技术优势,样品前处理相对简单,特别适合检测啤酒中这类高沸点的化合物,是GC-MS检测麦香类物质的有效补充。此外,UPLC-MS/MS的应用主要集中在食品安全领域,而在啤酒风味物质检测中的应用在国内外都是一个全新的研究领域。

超高效液相色谱/三重四极杆串联质谱仪(Iclass+Xevo TQ MS,美国Waters公司),超纯水机(美国Millipore公司),超声波仪(S120H,美国Elmasonic公司)。

DMHF(纯度98%)、EMHF(纯度96%)和2-AP(纯度99%)均购自Sigma Aldrich公司。乙腈和甲醇(色谱纯,Burdick & Jackson公司)。

C₁₈固相萃取柱(Supelclean ENVI-18,3 mL,Supelco公司)。样品过滤采用复合滤膜(Acrodisc Syringe Filter,13 mm,0.2 μm GHP Minispike,Waters公司)。所选取的啤酒样品均购自市场。协定法麦汁由本实验室制备,而大生产麦汁为啤酒工厂的送样。

依次用6 mL乙腈和6 mL水活化C₁₈固相萃取柱。啤酒样品和发酵液要先振摇除气,再经过超声脱气10 min以去除绝大部分二氧化碳气体。取1 mL样品上样至活化后的C₁₈固相萃取柱,用1 mL超纯水淋洗,用1.5 mL乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(50:50,v/v)混合溶液分两次洗脱,洗脱液经复合滤膜过滤后进样分析。

色谱柱:ACQUITY UPLC HSS T3(50 mm×2.1 mm,1.8 μm);流动相A为0.1%(v/v)甲酸水溶液;流动相B为0.01%(v/v)甲酸乙腈溶液;梯度洗脱程序:0~1.0 min,2%B; 1.0~4.0 min,2%B~10%B; 4.0~6.0 min,10%B~30%B; 6.0~6.1 min,30%B~95%B; 6.1~8.0 min,95%B; 8.0~8.1 min,2%B; 8.1~10.0 min,2%B;流速:0.4 mL/min;柱温:35 ℃。

电喷雾离子化正离子(ESI+)模式,毛细管电压700 V,锥孔电压22 V,去溶剂气温度400 ℃;去溶剂气流量1 000 L/h,锥孔反吹气流量100 L/h;碰撞气(氩气)流量0.15 mL/min。主要参数见表 1。采用多反应监测(MRM)技术,选取包括母离子在内的两对离子,一对离子用于定量,另一对离子用于定性。并且根据色谱出峰顺序,分时间段采集待测离子对。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 3种麦香风味物质的质谱检测参数 Table 1 MS/MS parameters for the determination of the three sweet flavors Compound Acquisition time/min Mr Qualitative ion pair (m/z) Quantification ion pair (m/z) Cone voltage/V Collision energy/V DHMF 1.75-3.50 128.1 129.1＞43.0 129.12＞57.0 25 10 2-AP 3.50-4.70 109.1 110.1＞68.0 110.1＞43.0 25 10 EMHF 3.50-4.70 142.1 143.2＞97.0 143.2＞101.1 20 12

表 1 3种麦香风味物质的质谱检测参数 Table 1 MS/MS parameters for the determination of the three sweet flavors

啤酒中含有大量的糖类和蛋白化合物,会污染质谱系统,造成基质干扰。这些干扰物质大多数属于强极性水溶性化合物,可以通过C₁₈固相萃取柱有效去除。将质量浓度为1 000 μg/L的混合标准溶液1 mL流经已活化的C₁₈固相萃取柱,收集流出液。流出液中均未检出目标化合物,说明待测物被有效地保留在C₁₈固相萃取柱上。然后用1.5 mL洗脱溶液分2次进行洗脱。选择此洗脱体积是因为样品瓶的体积为2.0 mL,两次洗脱液的体积共为1.5 mL,这样操作比较方便。洗脱液的成分要尽量与流动相一致,故本实验考察了采用不同体积比(0:100、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0)的乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液的洗脱效果。将洗脱液收集过滤后上机检测。根据洗脱曲线,当乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液的体积比为50:50时,目标化合物的回收率都接近100%,效果最佳。

将质量浓度为500 μg/L的混合标准溶液进样检测。其定量离子的MRM谱图如图 2a所示。啤酒样品经前处理后上机检测,其MRM定量离子图见图 2b。3种化合物的保留时间为:DMHF 2.77 min,2-AP 4.45 min,EMHF 4.59 min。由于采用分时间段采集待测离子,从而有效降低了干扰。对比标准样品和啤酒样品的谱图,保留时间对应准确,这为准确定量奠定了基础。啤酒属于水溶性体系,存在很多极性较强的化合物,在2.77 min DMHF出峰附近有一些极性接近的物质流出，但由于达到了基线分离,故不会影响其定量的准确性;而在2-AP和EMHF出峰附近没有其他未知色谱峰。

图 2

Fig. 2

图 2 (a)DMHF、EMHF、2-AP混合标准溶液(500 μg/L)和(b)啤酒样品的定量离子MRM色谱图 Fig. 2 MRM chromatograms of (a) the mixed solution of DMHF, EMHF and 2-AP standards (500 μg/L) and (b) a beer sample at quantification ions

称取适量的DMHF、2-AP和EMHF,用乙腈溶解配制1 000 mg/L的单组分标准溶液;然后将上述单组分标准溶液用0.1%(v/v)甲酸水溶液稀释配制质量浓度为20、50、100、200、500、1 000 μg/L的混合标准溶液。将上述标准溶液按1.4节和1.5节条件进样检测。以峰面积y对质量浓度x(μg/L)强制过原点绘制标准曲线。DMHF的线性方程为y=27.56x,2-AP的线性方程为y=78.39x,EMHF的线性方程为y=96.68x。决定系数R²均大于0.999。3种麦香化合物在0~1 000 μg/L均具有良好的线性。

在啤酒样品中分别添加3个浓度水平的麦香风味物质混合标准溶液,经前处理后进样检测。每个水平重复测定6次。将标准溶液逐步稀释,以3倍信噪比为检出限(LOD),以10倍信噪比为定量限(LOQ)。加标回收率、重现性和灵敏度指标见表 2。可见3种麦香风味物质的平均回收率为74.3%~86.7%,相对标准偏差为4.8%~7.3%。DMHF是3种化合物中极性最强的,其在C₁₈固相萃取柱上的保留相对较弱,且其结构较难电离,导致回收率、重现性和检出限指标均低于2-AP和EMHF。但DMHF在啤酒中含量较高,能够满足实际检测的要求。

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 DMHF、EMHF、2-AP的加标回收率、精密度(RSD)、检出限和定量限 Table 2 Spiked recoveries, precisions (RSDs), LODs and LOQs of DMHF, EMHF and 2-AP Compound Spiked/(μg/L) Found/(μg/L) Recovery (n=6)/% RSD (n=6)/% LOD/(μg/L) LOQ/(μg/L) DMHF 50.0 37.15 74.3 7.2 2.5 5.0 100.0 76.4 76.4 7.3 200.0 155.2 77.6 7.1 2-AP 20.0 16.42 82.1 5.1 1.0 2.0 50.0 41.7 83.4 4.9 100.0 82.8 82.8 5.2 EMHF 20.0 17.08 85.4 5.3 1.0 2.0 50.0 43.35 86.7 4.8 100.0 86.6 86.6 4.9

表 2 DMHF、EMHF、2-AP的加标回收率、精密度(RSD)、检出限和定量限 Table 2 Spiked recoveries, precisions (RSDs), LODs and LOQs of DMHF, EMHF and 2-AP

分别选取不同类型的麦汁和啤酒样品进行检测。由普通麦芽制成的协定法麦汁(Congress wort a~c)、高麦香麦芽制成的协定法麦汁(Congress wort d~f),大生产麦汁(Factory wort a~d),下面发酵啤酒(Lager beer a~d),印度淡色爱尔啤酒(IPA beer a~d)。实际测定时,印度淡色爱尔啤酒(IPA beer a~d)要先用水稀释5倍。每个样品从前处理开始至上机检测重复3次。表 3为实际样品中3种麦香风味物质的质量浓度。

表 3

Table 3

表 3(Table 3)

表 3 麦汁和啤酒样品中麦香物质的质量浓度 Table 3 Mass concentrations of the three sweet flavors in wort and beer samples Sample No. Sample DMHF/(μg/L) 2-AP/(μg/L) EMHF/(μg/L) 1 Congress wort a 19 8 N. D. 2 Congress wort b 33 17 N. D. 3 Congress wort c 16 5 N. D. 4 Congress wort d 112 78 N. D. 5 Congress wort e 121 76 N. D. 6 Congress wort f 123 80 N. D. 7 Factory wort a 196 97 N. D. 8 Factory wort b 174 80 N. D. 9 Factory wort c 236 88 N. D. 10 Factory wort d 171 86 N. D. 11 Lager beer a 541 63 12 12 Lager beer b 433 63 14 13 Lager beer c 168 27 5 14 Lager beer d 371 37 9 15 IPA beer a 3751 293 63 16 IPA beer b 2403 226 34 17 IPA beer c 1981 459 32 18 IPA beer d 3751 293 63 N. D.: not detected.

表 3 麦汁和啤酒样品中麦香物质的质量浓度 Table 3 Mass concentrations of the three sweet flavors in wort and beer samples

由表 3可见,由普通麦芽制成的协定法麦汁由于没有经过煮沸过程,热负荷低,所以3种麦香物质的含量都是最低的。高麦香麦芽由于特殊的工艺,高温焙烤过程令3种麦香物质含量明显高于普通麦芽协定法麦汁,前者平均是后者的3~10倍。大生产麦汁经过了近60 min煮沸过程,导致相应麦香物质含量高于协定法麦汁。EMHF在所有麦汁样品中均没有检出。

酵母能够代谢美拉德反应的中间产物生成DMHF和EMHF,导致二者在啤酒中的含量明显高于相应的麦汁。不同品类的啤酒由于配方不同,麦香物质的含量差异很大。下面发酵啤酒中DMHF的质量浓度一般在160~540 μg/L之间,2-AP的质量浓度一般在30~70 μg/L之间,EMHF是3种麦香物质中浓度最低的,一般在5~20 μg/L之间。印度淡色爱尔啤酒中这3种麦香物质的含量都远高于普通下面发酵啤酒,前者平均是后者的5~10倍。

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术定量检测了啤酒和麦汁中的DMHF、EMHF和2-AP 3种麦香风味物质。本方法样品处理简单、准确、灵敏,是检测啤酒中沸点较高的麦香类物质有效、可靠的方法,是GC-MS方法的有效补充,可用于啤酒生产过程控制。DMHF是啤酒中最重要的麦香风味物质,其含量最高,常常会高于阈值。2-AP虽然没有达到阈值,却是吡咯类的代表性麦香风味物质。