乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、印乌头碱、滇乌头碱、粗茎乌头碱甲和宋果灵是毛茛科乌头属植物中重要的生物碱,具有强心、镇痛、抗肿瘤、调节免疫等药理作用^[1],乌头类生物碱是川乌、草乌、附子等常用药材的主要活性成分,但同时具有较强的毒性,治疗剂量与中毒剂量十分接近^[2],极易发生因用药过量、误食等事件引起中毒甚至死亡。由于毒性大,给药剂量小,同时在体内代谢迅速,该类生物碱在体内的含量很低,加上生物样品基质复杂,因此既需要快速高效的前处理技术,又需要高灵敏度的检测方法。

目前生物样品中乌头类生物碱的检测方法主要有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^[3]、高效液相色谱法(HPLC)^[4]和液相色谱-质谱联用法(LC-MS)^{[1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18]}等。上述方法中,GC-MS法一般需要衍生化,分析时间长;HPLC则存在灵敏度和选择性低等缺点,难以满足生物样品中乌头类生物碱的准确检测。LC-MS具有灵敏度高、选择性强等优点,近年来广泛应用于生物样品中乌头类生物碱的分析,特别是LC-MS/MS,可以通过多级质谱碎裂得到母离子及相应各级子离子的信息,定性和定量结果更为准确。目前,生物样品中乌头类生物碱的前处理方法主要有蛋白质沉淀法^{[5, 6, 7]}、液相微萃取法^[8]、液液萃取法^{[9, 10, 11, 12, 13]}、离线固相萃取法^{[14, 15, 16, 17, 18, 19]}等。采用蛋白质沉淀法不能去除生物检材中的电解质和盐类,易产生基质效应,污染离子源;液相微萃取法、液液萃取法和离线固相萃取法存在操作繁琐、耗时等缺点。在线固相萃取(on-line SPE)是近年新发展起来的一项前处理技术,具有自动化操作、高通量、可重复使用等优点,可以显著简化前处理过程,尤其适用于复杂的生物样品。如今已广泛应用于法庭毒物分析^[20]、药物分析^[21]、食品安全^[22]、环境科学^[23]等诸多领域。目前,采用在线固相萃取技术检测生物样品中乌头类生物碱的分析方法鲜有报道,Hayashida等^[19]采用柱切换技术实现在线预浓缩,结合LC-MS选择离子监测(SIM)模式分析了血清中的河豚毒素和乌头类生物碱,样品只经过简单的过滤便直接进样,简化了样品的前处理过程,但SIM模式分析基质复杂的生物样品的选择性较差。液相色谱质谱联用法检测乌头类生物碱通常采用选择离子监测^{[9, 19]}或多反应监测(MRM)^{[1, 2, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17]},而Chen等^[24]采用干扰更小、选择性更强的连续反应监测(CRM)模式分析了附子中的中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱(体外研究),样品前处理采用甲醇超声提取30 min,耗时较长。

本文建立了在线固相萃取技术结合液相色谱-线性离子阱多级质谱快速检测生物样品中7种乌头类生物碱的分析方法,采用CRM扫描模式,可明显降低生物样品中内源性物质引起的基质干扰,从而提高待测组分的选择性。该方法具有前处理操作简单、灵敏度高、选择性强、检出限低等优点,特别适用于生物样品中乌头类生物碱的分析。

Dionex^TM Ultimate 3000^TM双三元液相色谱系统(美国赛默飞世尔科技有限公司),配备DGP-3600SD脱气机、TCC-3000SD柱温箱(带六通阀)、WPS-3000TFC-ANALYTICAL自动进样器;LTQ XL^TM型线性离子阱质谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司),配加热电喷雾离子源(HESI-II)、Xcalibur^TM数据处理系统、Mass Frontier 7.0^TM软件;3-18R高速冷冻离心机(美国TOMOS公司); SB 3200-DT超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司); Master-s UV超纯水发生器(上海和泰仪器有限公司)。

乌头碱(aconitine,纯度98.7%)、新乌头碱(mesaconitine,纯度99.5%)、次乌头碱(hypaconitine,纯度98.7%)、印乌头碱(indaconitine,纯度97.3%)、滇乌头碱(yunaconitine,纯度98.9%)、粗茎乌头碱甲(crassicauline A,纯度98.0%)、宋果灵(songorine,纯度99.5%)标准品均购自北京坛墨质检科技有限公司;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵均为色谱纯(美国Fisher公司),三羟甲基氨基甲烷(Tris)为分析纯(上海润捷科技发展有限公司)、盐酸为分析纯(成都科龙化工试剂厂);实验用水为超纯水。

分别准确称取上述7种标准品,用甲醇溶解定容,配制成200 mg/L的单标准储备液,于-15 ℃下保存。使用时根据需要用甲醇稀释,配制成不同质量浓度的单标准工作液和混合标准工作液。

Tris-HCl缓冲溶液(pH 9.2):取45 mL 0.2 mol/L的Tris溶液和5 mL 0.1 mol/L的HCl溶液,混匀,加水定容至1 L。

在线SPE柱:Waters Oasis^® HLB(20 mm×3.9 mm,15 μm);左泵为在线SPE泵,流动相:A为水,B为甲醇。分析柱:Accucore C18(100 mm×2.1 mm,2.6 μm);右泵为分析泵,流动相:A为0.01 mol/L 含0.1%(v/v)甲酸的乙酸铵溶液,B为0.1%(v/v)甲酸/甲醇溶液。柱温40 ℃;进样量50 μL;梯度洗脱及六通阀切换程序见表 1,on-line SPE/LC-LIT/MSn的流路图见参考文献^[20]。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 梯度洗脱及六通阀切换程序 Table 1 Gradient elution and valve switching programs SPE pump (left pump) Analytical pump (right pump) Valve Time/min Flow rate/(mL/min) φ(B)/% Time/min Flow rate/(mL/min) φ(B)/% Switch time/min Valve state 0 0.3 0 0 0.3 50 0 1_2 3 0.3 0 3 0.3 50 3 6_1 3 0.3 100 10 0.3 95 6 1_2 7 2.0 100 10 0.3 50 7 2.0 0 9 2.0 0 9 0.3 0 10 0.3 0 Mobile phases: B, methanol for SPE pump and 0.1% (v/v) formic acid/methanol for analytical pump; A, water for SPE pump and 0.01 mol/L ammonium acetate containing 0.1% (v/v) formic acid for analytical pump.

表 1 梯度洗脱及六通阀切换程序 Table 1 Gradient elution and valve switching programs

电离方式为电喷雾电离(ESI)正离子模式;扫描方式为CRM;喷雾电压为4 000 V;棱镜电压为85 V;鞘气和辅助气为氮气,其中鞘气压力为35 arb;辅助气压力为15 arb;碰撞气为氦气;离子源温度为300 ℃;毛细管温度为350 ℃;隔离窗口为2 amu。7种乌头类生物碱的主要质谱参数见表 2。

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 7种乌头类生物碱的主要质谱参数 Table 2 Main MS parameters of the seven aconitum alkaloids Analyte Ion pairs (m/z) Mean relative abundance/% Retention time/min Normalized collision energy/% Songorine 358.5/340.3/322.3* 100.0 4.51 35 358.5/340.3/312.3 44.2 Mesaconitine 632.7/572.4/512.3* 100.0 5.44 35 632.7/572.4/540.2 54.1 Hypaconitine 616.6/556.3/524.2* 100.0 5.67 35 616.6/556.3/496.3 81.5 Indaconitine 630.7/570.4/520.4* 100.0 5.68 35 630.7/570.4/538.3 81.6 Yunaconitine 660.8/600.4/550.3* 100.0 5.75 35 660.8/600.4/568.3 89.6 Aconitine 646.7/586.3/526.3* 100.0 5.79 35 646.7/586.3/554.2 38.1 Crassicauline A 644.7/584.4/552.3* 100.0 6.00 35 * Quantitative ion.

表 2 7种乌头类生物碱的主要质谱参数 Table 2 Main MS parameters of the seven aconitum alkaloids

全血和尿液:准确吸取0.1 mL全血(或尿液),分别置于10 mL试管中,加入0.5 mL乙腈,涡旋振荡1 min,再加入0.4 mL水,超声提取5 min后,以10 000 r/min的转速离心5 min,上清液供on-line SPE/LC-LIT/MSⁿ分析。

肝组织:称取0.5 g经绞碎均匀的肝组织,加入2.5 mL乙腈,涡旋振荡1 min,加入2 mL水,其余操作同全血(或尿液)处理。

分别对7种乌头类生物碱进行MS³数据依赖分析,结果均可进行MS²、MS³裂解,其中一级质谱均为[M+H]⁺离子,MS²均只产生1个强的子离子,MS³裂解除了粗茎乌头碱甲只得到1个强的次级子离子外,其余6种生物碱均产生2个或2个以上强次级子离子。7种乌头类生物碱的MS²和MS³全扫描质谱图见图 1。如果采用选择反应监测(SRM)模式检测乌头类生物碱,因MS²均只有一个子离子,定性识别点为2.5,达不到欧盟2002/657/EC指令规定的定性识别点至少达到4的要求;而采用CRM模式检测,即监测1个母离子、1个子离子及1个以上次级子离子时,定性识别点分别以1.0、1.5、1.5计算,除了粗茎乌头碱甲定性识别点为4外,其余6种乌头类生物碱的定性识别点均达到5.5。因此,本研究采用CRM模式进行检测。

图 1

Fig. 1

图 1 7种乌头类生物碱的MS2和MS3全扫描质谱图 Fig. 1 MS2 and MS3 full scan mass spectra of the seven aconitum alkaloids

除宋果灵外,其他6种乌头类生物碱均属于双酯型生物碱,化学结构式见图 2。在软电离条件下,这6种双酯型生物碱的MS²特征断裂为8位上的羧基以中性乙酸形式脱去,在MS²质谱图中可以观察到很强的[M+H-60]⁺特征碎片离子,且几乎没有其他碎片离子产生;在MS³质谱图中,这6种生物碱均裂解得到[M+H-60-32]⁺碎片离子,推测是1位碳上的甲氧基继续以甲醇形式脱去。此外,乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的MS³质谱图中还观察到了[M+H-60-60]⁺碎片离子,这3种生物碱在15位碳上均含有一个羟基,在MS²断裂时8位碳上的羧基和15位上的H以中性羧酸脱去,得到一个烯醇,烯醇由于不稳定经互变异构形成环酮,后者容易脱去一分子CO,同时由于甲醇分子的丢失,得到了[M+H-60-60]⁺离子;印乌头碱和滇乌头碱的MS³质谱图出现了[M+H-60-50]⁺碎片离子,这2种生物碱的15位碳上不含羟基,推测是8位碳上的羧基和1位碳上的甲氧基分别以中性形式丢失后,13位上的羟基继续以中性H₂O分子脱去,最终得到上述碎片离子。宋果灵的MS²、MS³质谱图分别出现很强的[M+H-18]⁺和[M+H-18-18]⁺碎片离子,推测是在1位和15位碳上的羟基相继丢失中性H₂O分子而形成;MS³质谱图还出现了较强的[M+H-18-28]⁺碎片离子,推测可能是12位碳脱去CO后形成。

图 2

Fig. 2

图 2 7种乌头类生物碱的化学结构及碎片离子 Fig. 2 Chemical structures and fragment ions of the seven aconitum alkaloids

本研究采用Waters Oasis^® HLB柱作为在线SPE柱,根据前期的研究工作^[20],可知萃取过程中极性大的基质流出SPE柱所需的时间为3 min,为有效除去基质,同时节省分析时间,选择在3 min时将六通阀由1_2切换至6_1状态。

新乌头碱和印乌头碱、乌头碱和粗茎乌头碱这2组药物的母离子、MS²子离子和MS³定性子离子相差2 amu,如果化合物共流出,相对分子质量较小的印乌头碱、粗茎乌头碱甲同位素离子对就会对相对分子质量较大的新乌头碱定性离子对(m/z 632.7/572.4/540.2)和乌头碱定性离子对(m/z 646.7/586.3/554.2)造成干扰,因此需要对色谱条件进行优化。

研究发现,采用Accucore C18作为色谱分析柱,初始有机相比例为50%,梯度洗脱,新乌头碱和印乌头碱、乌头碱和粗茎乌头碱这2组药物的保留时间均相差0.2 min以上,基本实现分离,可以保证新乌头碱和乌头碱定性结果的可靠性。7种乌头类生物碱的CRM色谱图见图 3。

图 3

Fig. 3

图 3 7种乌头类生物碱的连续反应监测(CRM)色谱图 Fig. 3 Consecutive reaction monitoring (CRM) chromatograms of the seven aconitum alkaloids * Quantitative ion.

本研究对样品稀释液进行了选择优化,选取以下3种不同pH值的样品稀释液:0.01 mol/L 含0.1%(v/v)甲酸的乙酸铵溶液(pH 4.0)、中性水(pH 7.0)和Tris-HCl缓冲溶液(pH 9.2)。在空白尿液中添加7种乌头类生物碱的混合标准工作液后按1.4节处理,考察不同pH值的样品稀释液对在线SPE萃取率的影响,结果见图 4。由图 4可知,7种乌头类生物碱在样品稀释液的pH值为7.0和9.2时,萃取效果较好;而在pH值为4.0时,萃取效果较差。这可能是由于乌头类生物碱是弱碱性药物,当样品稀释液呈碱性或呈中性时,乌头类生物碱在溶液中主要以分子形式存在,几乎不解离,从而提高样品在SPE柱上的吸附能力;而当样品稀释液呈酸性时,各生物碱以离子形式存在,在SPE柱上的吸附能力明显减弱,萃取效果较差。根据考察结果,同时考虑到加入缓冲盐会对离子源造成污染,最终选择中性水(pH 7.0)作为样品稀释液。

图 4

Fig. 4

图 4 样品稀释液pH值对萃取率的影响 Fig. 4 Influence of pH value of the solution for dilution on extraction efficiency

本研究选取乙腈作为沉淀蛋白剂,于在线SPE前对样品进行预处理。在空白尿液中添加7种乌头类生物碱的混合标准工作液,分别加入不同体积的乙腈和水,配制成含有不同体积分数的乙腈的样品溶液后,按1.4节处理。考察样品溶液中不同体积分数的乙腈对在线SPE萃取率的影响,以确定样品经沉淀蛋白后的稀释程度,结果如图 5所示。当样品溶液中的乙腈的体积分数为45%~70%时,7种乌头类生物碱的萃取率较高,均达到70%以上。考虑到生物样品沉淀蛋白后需经过稀释,以免污染仪器,即样品溶液中乙腈的含量不宜过高。因此选择用水稀释样品溶液,使乙腈的体积分数为50%。

图 5

Fig. 5

图 5 乙腈含量对萃取率的影响 Fig. 5 Influence of volume percentage of acetonitrile on extraction efficiency

在空白尿液中添加7种乌头类生物碱的混合标准工作液,按1.4节处理,得到待测样品溶液。将在线SPE泵流速分别设置为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min,考察流速对在线SPE萃取率的影响,结果见图 6。由图 6可知,在线SPE泵流速越小,萃取率越高。按前期研究工作^[20]的阀切换时间,考察了流速分别为0.1、0.2和0.3 mL/min时,基质流出SPE柱所需的时间。结果显示,上述3个流速下基质流出SPE柱的时间分别为5.5、4.0和3.0 min,且流速越低,基质色谱峰拖尾越严重,不能有效除去基质干扰。综合萃取率和基质干扰两方面因素,最终将在线SPE泵流速设为0.3 mL/min。

图 6

Fig. 6

图 6 在线SPE泵流速对萃取率的影响 Fig. 6 Influence of flow rate of on-line SPE pump on extraction efficiency

在全血、尿液和肝组织这3种空白基质中分别添加7种乌头类生物碱的混合标准工作液,得到系列浓度的加标样品溶液,按1.4节方法进行处理。以定量离子峰面积(y)对目标分析物的质量浓度(x,ng/mL或ng/g)进行最小二乘法回归运算(权重因子为1/x),建立二阶标准工作曲线,相关系数r²>0.999 0(见表 3)。以相对标准偏差(RSD)≤15%(n=5)的浓度作为定量限(LOQ);对定量限浓度重复进样8次,参照美国环保署(EPA)的计算方法^[25]确定各分析物的方法检出限(MDL)。

表 3

Table 3

表 3(Table 3)

表 3 生物样品中7种乌头类生物碱的线性范围、回归方程、相关系数(r2)、方法检出限和定量限 Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2), method detection limits (MDL)and limits of quantification (LOQs) of the seven aconitum alkaloids in biological samples Sample Analyte Linear range/unit Regression equation r2 MDL/unit LOQ/unit Whole blood songorine 2.00-1000 y=-0.0137969x2+87.4769x-118.593 0.9991 0.60 2.00 mesaconitine 0.20-1000 y=-0.250564x2+886.203x-128.486 0.9998 0.08 0.20 hypaconitine 0.20-1000 y=-0.288833x2+1344.38x-140.131 0.9999 0.02 0.20 indaconitine 0.20-1000 y=-0.434409x2+1843.39x-164.159 0.9999 0.04 0.20 yunaconitine 0.20-1000 y=-0.280093x2+1252.79x-153.761 0.9999 0.08 0.20 aconitine 0.20-1000 y=-0.238132x2+1094.14x-99.9451 0.9998 0.06 0.20 crassicauline A 0.20-1000 y=-0.406382x2+2271.77x-137.09 0.9998 0.02 0.20 Urine songorine 4.00-1000 y=-0.00198817x2+51.7186x-111.465 0.9991 0.60 4.00 mesaconitine 0.40-1000 y=-0.118619x2+636.076x-135.527 0.9998 0.02 0.40 hypaconitine 0.40-1000 y=-0.133602x2+923.849x-93.8941 0.9998 0.02 0.40 indaconitine 0.40-1000 y=-0.165221x2+1232.72x-110.632 0.9998 0.02 0.40 yunaconitine 0.40-1000 y=-0.095566x2+817.318x-111.429 0.9998 0.02 0.40 aconitine 0.40-1000 y=-0.12158x2+811.26x-109.643 0.9998 0.06 0.40 crassicauline A 0.40-1000 y=-0.155709x2+1431.67x-19.4259 0.9999 0.06 0.40 Liver tissue songorine 2.00-1000 y=-0.00336158x2+70.9647x-111.092 0.9995 0.40 2.00 mesaconitine 0.60-1000 y=-0.52941x2+1677.68x+1069.87 0.9996 0.04 0.60 hypaconitine 0.60-1000 y=-0.614271x2+2341.86x+1584.51 0.9997 0.04 0.60 indaconitine 0.60-1000 y=-1.03359x2+3621.05x+2321.84 0.9996 0.02 0.60 yunaconitine 0.60-1000 y=-0.836439x2+2648.5x+1569.42 0.9996 0.02 0.60 aconitine 0.60-1000 y=-0.66157x2+2359.3x+1384.3 0.9997 0.04 0.60 crassicauline A 0.60-1000 y=-1.38827x2+4793.44x+3078.89 0.9996 0.02 0.60 Unit: ng/mL for whole blood and urine samples; ng/g for liver tissue samples. y: peak area; x: mass concentration, ng/mL or ng/g.

表 3 生物样品中7种乌头类生物碱的线性范围、回归方程、相关系数(r2)、方法检出限和定量限 Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2), method detection limits (MDL)and limits of quantification (LOQs) of the seven aconitum alkaloids in biological samples

在全血、尿液和肝组织3种空白基质中分别添加不同含量的混合标准工作溶液,配制成低、中、高3个浓度水平的加标溶液,按1.4节方法进行处理,每个浓度水平重复测定6次,在相同条件下连续测定3 d,考察方法的日内精密度、日间精密度和回收率,结果见表 4。

表 4

Table 4

表 4(Table 4)

表 4 全血、尿液和肝组织中7种乌头类生物碱的回收率和精密度 Table 4 Recoveries and precisions of the seven aconitum alkaloids in whole blood, urine and liver tissue samples (n=6) Compound Spiked/unit Whole blood Urine Liver tissue Recovery/% Intra-day RSD/% Inter-day RSD/% Recovery/% Intra-day RSD/% Inter-day RSD/% Recovery/% Intra-day RSD/% Inter-day RSD/% Songorine 8 93.8 6.1 9.6 93.1 10.0 12.3 91.1 9.8 13.7 100 91.5 1.7 2.3 93.9 1.8 2.7 98.7 4.5 6.9 800 102.8 1.1 1.9 101.7 0.5 1.2 99.3 3.0 5.7 Mesaconitine 0.8 101.0 4.1 7.4 100.9 10.3 13.6 95.9 6.1 10.5 100 97.4 0.2 1.1 98.5 0.6 1.8 99.2 0.2 1.3 800 99.7 0.6 1.3 101.3 1.7 2.2 99.6 0.3 1.7 Hypaconitine 0.8 97.0 5.4 8.8 102.1 10.7 11.5 98.0 4.0 9.1 100 97.7 0.7 1.6 98.7 0.8 1.8 98.0 0.7 2.3 800 99.5 0.6 1.6 101.8 0.8 2.0 101.4 0.5 2.1 Indaconitine 0.8 103.3 1.4 5.8 103.2 8.7 11.2 94.4 0.9 5.4 100 97.8 0.5 1.8 97.9 0.5 1.7 96.2 0.5 2.5 800 99.9 0.2 1.0 101.1 0.9 2.4 100.6 0.9 3.3 Yunaconitine 0.8 96.5 4.3 8.5 101.7 7.3 10.8 100.1 1.4 6.2 100 98.7 0.7 2.4 98.3 0.7 1.7 96.4 0.8 2.4 800 100.6 0.6 2.1 100.9 1.3 1.9 100.4 1.6 3.6 Aconitine 0.8 100.7 3.1 6.5 103.4 6.5 10.2 103.6 6.4 9.0 100 97.9 1.6 2.6 98.5 0.7 1.8 97.1 0.4 1.5 800 98.8 1.8 2.8 101.0 0.6 1.5 100.4 0.5 2.2 Crassicauline A 0.8 104.7 3.2 5.9 104.6 4.7 9.9 102.5 2.7 7.6 100 99.1 0.6 1.3 99.2 0.7 1.9 95.9 0.2 1.3 800 99.3 1.3 2.0 100.9 1.1 2.6 99.5 1.4 2.1 Unit: ng/mL for whole blood and urine samples; ng/g for liver tissue samples.

表 4 全血、尿液和肝组织中7种乌头类生物碱的回收率和精密度 Table 4 Recoveries and precisions of the seven aconitum alkaloids in whole blood, urine and liver tissue samples

采用本研究建立的方法对广西壮族自治区公安厅物证鉴定中心受理的1起中毒案件的送检样品进行检测,检材包括1名中毒受害者的血样、1名中毒死者的血样和尿样。在中毒受害者的血样中检出印乌头碱,质量浓度为4.9 ng/mL;在中毒死者的血样和尿样中均检出了乌头碱、次乌头碱和印乌头碱,但3种生物碱的含量超过了本方法的定量上限。

本研究建立了在线SPE技术结合液相色谱-线性离子阱多级质谱快速测定生物样品中7种乌头类生物碱的分析方法。样品用乙腈沉淀蛋白,经稀释和离心后即可直接进样;利用在线SPE进行净化和富集,快捷高效,具有高通量和低损耗等优点;采用CRM扫描模式进行质谱检测,与SIM、MRM扫描模式相比,具有干扰小、选择性强、准确性高等优点,更适合生物样品中乌头类生物碱的筛查分析。