β₂-受体激动剂(β₂-agonists)是人工合成的苯乙醇胺类药物,常添加于动物饲料中以提高饲料的转化率,增加动物胴体的瘦肉率。近年来,因食用含有β₂-受体激动剂残留的动物性食品引起的食品安全事件已得到广泛关注^{[1, 2]}。我国明令禁止在动物饲养中使用克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等β₂-受体激动剂,并规定在动物性食品中不得检出此类药物。为此,广大科研工作者针对动物性食品中β₂-受体激动剂残留的检测方法,尤其是样品前处理的方法开展了深入研究。在已报道的前处理方法中,液液萃取^[3]需要大量有机溶剂;固相萃取^{[4, 5, 6, 7]}、固相微萃取^[8]、液相微萃取^[9]等方法净化步骤繁琐,灵敏度低,并且这些前处理技术均基于药物与载体基质的理化性质之间的相互作用而达到净化目的,存在选择性差等问题;免疫亲和色谱^[10]特异性高,但价格昂贵,操作条件苛刻。分子印迹技术(molecular imprinting technique,MIT)作为一项新型技术,俗称“塑料抗体”,具有与天然生物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗体相比拟的专一性,同时它是由化学合成的方法制备,又具有天然分子识别系统所不具备的抗恶劣环境的能力,表现出高度的稳定性和较长的使用寿命,近年被广泛应用于样品前处理过程^{[11, 12, 13, 14, 15]}。

分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer,MIP)具有与模板及其结构类似物在大小、形状上相契合的结合位点,能有效地从基质中选择性富集分析物,提高仪器分析的准确度和灵敏度。本研究通过优化分子印迹固相萃取(molecularly imprinted solid-phase extraction,MISPE)上样溶液的pH值、淋洗和洗脱溶剂的选择等净化条件及质谱条件,建立了快速检测猪尿中15种β₂-受体激动剂的MISPE-UPLC-MS/MS分析方法。该方法选择性好、灵敏度高、重复性好,且操作简单、迅速、准确,能有效降低基质干扰。

Acquity UPLC-Xevo TQ MS超高效液相色谱-串联质谱仪、固相萃取装置、Oasis^TM MCX固相萃取柱(美国Waters公司); 5804R台式高速冷冻离心机、微量移液器(德国Eppendorf公司); SupelMIPSPE(β-agonists,25 mg/10 mL,65 μm,美国Sigma公司); GHP针式滤膜(0.22 μm,美国Pall公司)。

甲醇、乙腈均为色谱纯(德国Merck公司);甲酸为色谱纯(北京迪马科技有限公司)。乙酸为分析纯(上海润捷化学试剂有限公司);乙酸铵、氨水(NH₃含量:25%~28%)均为分析纯(上海国药集团化学试剂有限公司)。

克仑特罗(clenbuterol,纯度>98.5%)、莱克多巴胺(ractopamine,纯度>98%)、沙丁胺醇(salbutamol,纯度>99%)、班布特罗(bambuterol,纯度>98%)、马布特罗(mabuterol,纯度>99%)、特布他林(terbutaline,纯度>98.5%)、非诺特罗(fenoterol,纯度>99%)、齐帕特罗(zilpaterol,纯度>98%)标准物质均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;妥布特罗(tulobuterol,纯度>99%)、西马特罗(cimaterol,纯度>99%)、氯丙那林(clorprenaline,纯度>99%)、西布特罗(cimbuterol,纯度>99.6%)、福莫特罗(formoterol,纯度>98%)、喷布特罗(penbuterol,纯度>99%)标准物质均购自德国Witega公司;苯乙醇胺A (phenylethanolamine A,纯度>98%)购自Toroto Research Chemiscal INC公司。15种β₂-受体激动剂的化学结构如图 1所示。

图 1

Fig. 1

图 1 15种β2-受体激动剂的化学结构 Fig. 1 Chemical structures of the 15 β2-agonists

准确称取15种β₂-agonists标准物质各10 mg,用甲醇定容至10 mL,配制质量浓度为1 g/L的标准储备液。分别移取适量的标准储备液,用甲醇稀释,配制质量浓度分别为0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10和20 μg/L的混合标准工作液。

色谱柱:Acquity LC BEH C₁₈柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm,美国Waters公司);柱温:35 ℃;流速:0.3 mL/min;进样量:5.0 μL;流动相:乙腈(A)和0.1%(v/v)甲酸水溶液(B)。梯度洗脱程序:0~2.0 min,10%A; 2.0~3.0 min,10%A~15%A; 3.0~4.0 min,15%A~55%A; 4.0~5.0 min,55%A~80%A; 5.0~5.5 min,80%A~10%A; 5.5~7.0 min,10%A。

离子源:电喷雾离子(ESI)源;正离子模式;检测方式:多反应监测模式(MRM);毛细管电压:2 700 V;离子源温度:150 ℃;雾化气(氮气)流量:1 000 L/h;锥孔气(氮气)流量:50 L/h;碰撞气(氩气)流量:0.24 L/h;雾化室温度:450 ℃。

移取2 mL猪尿样品,以5 000 r/min离心5 min,取上清液,用乙酸调节pH至7.0;依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 50 mmol/L乙酸铵(pH 6.7)活化MISPE柱;取上清液上样,依次用3 mL水、3 mL乙腈、2 mL 0.5%(v/v)乙酸/乙腈溶液淋洗,用洗耳球挤干溶液;用4 mL 10%(v/v)乙酸/甲醇溶液洗脱,收集洗脱液,用洗耳球挤干溶液;于50 ℃水浴下氮气吹至近干,用1 mL 0.1%(v/v)甲酸水/乙腈(9:1,v/v)复溶,过0.22 μm GHP滤膜,待测。

在电喷雾正离子模式下检测15种β₂-受体激动剂,通过优化特征离子对、毛细管电压、雾化室温度、碰撞电压等质谱条件,选取丰度较强、干扰较小的离子对作为定性、定量离子。15种β₂-受体激动剂的保留时间、母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数见表 1。为提高方法的灵敏度,降低基质干扰,本研究采用分段扫描的方式进行数据采集。15种β₂-受体激动剂定量离子的色谱图如图 2所示。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 15种β2-受体激动剂的质谱参数 Table 1 MS parameters of the 15 β2-agonists Compound Retention time/min Precursor ion (m/z) Daughter ion (m/z) Cone voltage/V Collision energy/V Zilpaterol 1.09 262.3 185.1 22 24 244.2* 22 14 Salbutamol 1.13 240.2 148.0* 22 18 222.1 22 10 Terbutaline 1.14 226.2 125.0 26 24 152.0* 26 14 Cimaterol 1.27 220.2 160.1 18 16 202.1* 18 10 Cimbuterol 1.87 234.2 143.0 20 24 160.1* 20 14 Fenoterol 1.94 304.2 107.0* 30 30 135.0 30 18 Ractopamine 3.36 302.2 107.0 24 30 164.1* 24 16 Clorprenaline 3.39 214.1 154.0* 24 16 196.1 24 12 Formoterol 3.64 345.2 121.0 26 34 149.0* 26 20 Tulobuterol 3.64 228.1 118.8 24 28 154.0* 24 16 Clenbuterol 3.64 277.1 131.9 20 30 203.0* 20 16 Bambuterol 3.82 368.3 294.2* 30 20 312.2 30 14 Mabuterol 3.93 311.2 217.0 24 26 237.1* 24 16 Phenylethanolamine A 4.31 345.2 150.1 22 22 327.2* 22 12 Penbuterol 4.66 292.3 133.0 30 16 236.2* 30 18 * Quantitative ion.

表 1 15种β2-受体激动剂的质谱参数 Table 1 MS parameters of the 15 β2-agonists

图 2

Fig. 2

图 2 (a)猪尿空白样品和(b)加标质量浓度为0.1 μg/L的猪尿样品中15种β2-受体激动剂的MRM色谱图 Fig. 2 MRM chromatograms of the 15 β2-agonists in (a) a blank swine urine sample and (b) a spiked sample (0.1 μg/L)

上样条件是MIPs有效吸附目标化合物的重要条件之一,直接影响MIPs的选择识别能力,并对其与目标化合物之间相互作用的稳定性起重要作用^{[16, 17]}。由于实验所用MISPE柱的吸附剂空穴中含有与β₂-受体激动剂在形状、大小上相契合的结合位点,且结合位点上的功能基团可通过氢键与β₂-受体激动剂特异性结合^[18]。β₂-受体激动剂分子中含芳香基团和离子基团(氨基、羧基等),极性较强,不同pH值的溶液影响β₂-受体激动剂分子的存在形式,使其更易得质子或失质子,影响氢键的形成。因此,本实验考察了不同pH值的猪尿样品对MIPs吸附性的影响。分别用乙酸铵溶液调节猪尿样品的pH至3.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、11.0,进行加标回收率试验。如图 3所示,猪尿样品的pH从3.0升至7.0时,各β₂-受体激动剂的回收率明显增加;而pH从7.0升至11.0时,回收率均显著降低;pH为7.0时,回收率最高。因为在酸性条件下,β₂-受体激动剂分子中的氨基加氢质子化;而在碱性条件下,β₂-受体激动剂分子中的氨基或羟基易失氢去质子,不易与MIPs吸附剂形成相互作用力,易被解离。H⁺与OH^-均影响了β₂-受体激动剂分子的存在形式,使其在MISPE柱上的保留能力变弱;H⁺与OH^-的浓度越大,破坏氢键形成能力越强;H⁺的影响能力大于OH^-。因此,本实验将猪尿样品的pH调节至7.0。

图 3

Fig. 3

图 3 不同pH值对猪尿样品中15种β2-受体激动剂回收率的影响 Fig. 3 Effect of pH value on the recoveries of the 15 β2-agonists in swine urine samples

MISPE在富集猪尿中痕量残留目标物时可能存在非特异性吸附,因此本实验通过优化MISPE淋洗条件,最大限度地提高MIPs结合位点和目标物之间的选择性作用,去除非特异性作用和基质干扰。通常用乙腈、甲醇及其相应的酸碱溶液作淋洗溶剂^{[16, 17]}。本实验分别以不同体积比的乙腈/水、甲醇/水、乙酸/乙腈、乙酸/甲醇溶液作淋洗液,收集各淋洗液,测定空白猪尿样品中不同β₂-受体激动剂的加标回收率。15种β₂-受体激动剂的淋洗率见图 4。不同体积比的乙腈/水(3:7、3:2、4:1、1:0,v/v),甲醇/水(3:7、3:2、4:1,v/v)的溶液淋洗能力较弱,各β₂-受体激动剂的淋洗率均忽略不计;纯甲醇淋洗液中,齐帕特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、苯乙醇胺A的淋洗率分别约为20%、6.6%、25%、8%;而纯乙腈可有效去除与结合位点结合的杂质和非选择性作用,同时使结合位点发生变化,更有利于洗脱溶液洗脱^[19]。0.5%(v/v)乙酸/乙腈淋洗液中,各β₂-受体激动剂的淋洗率均低于5%,可忽略;1%~2%(v/v)乙酸/乙腈淋洗液的淋洗能力较强,各β₂-受体激动剂均有不同程度的洗脱;而用0.5%(v/v)乙酸/甲醇溶液淋洗时,各β₂-受体激动剂的淋洗率均大于60%。猪尿样品流经MISPE柱后，先用水淋洗，不仅可有效去除样品中极性较大的杂质，还可以去除溶液中相应的盐类，以降低对MS/MS检测中的基质抑制问题。考虑到淋洗液不仅要保证回收率,而且要提高MISPE净化的选择性,本实验选用水、乙腈和0.5%(v/v)乙酸/乙腈作淋洗液。

图 4

Fig. 4

图 4 不同淋洗液对15种β2-受体激动剂淋洗率的影响 Fig. 4 Effect of washing solvent on the loss rates of the 15 β2-agonists

洗脱溶剂必须破坏目标物与MIPs结合位点间的作用,从而获得高富集因子。通过上样液与淋洗液的优化,发现酸性溶液和甲醇对回收率影响较大。因此,本实验选用乙酸/甲醇作为洗脱溶剂,用4 mL 10%(v/v)乙酸/甲醇洗脱时,各β₂-受体激动剂均获得较高的回收率。因此,本实验最终确定依次以水、乙腈、0.5%(v/v)乙酸/乙腈溶液淋洗,10%(v/v)乙酸/甲醇溶液洗脱。

本实验通过MISPE对8种镇静剂和5种磺胺类药物的吸附实验,测定了MISPE净化柱对β₂-受体激动剂的特异性吸附特点。将添加了8种镇静剂和5种磺胺类药物的猪尿样品按1.4节净化,依次以水、乙腈、0.5%(v/v)乙酸/乙腈溶液淋洗,用10%(v/v)乙酸/乙腈溶液洗脱,测定各药物的回收率。由表 2可知,8种镇静剂和5种磺胺类药物经水、乙腈、0.5%(v/v)乙酸/乙腈溶液淋洗后,各药物均被不同程度地淋洗下来,且经0.5%(v/v)乙酸/乙腈淋洗后,大部分药物均已被淋洗下来,回收率为58.7%~98.7%,表明8种镇静剂和5种磺胺类药物基本不被MISPE保留;而经10%(v/v)乙酸/乙腈溶液洗脱后,7个尚有保留的药物被洗脱,回收率小于40%。如图 5所示,8种镇静剂和5种磺胺类药物均具有苯环结构,由于苯环结构的存在可能导致8种镇静剂和5种磺胺类药物与MIPs间发生疏水作用,使其在上样过程中得到保留,但水、乙腈和0.5%(v/v)乙酸/乙腈淋洗溶液足以破坏其疏水作用而将其淋洗下来;由于这2类药物不具有β₂-受体激动剂侧链结构中的-NH-CH₂-CH(OH)-基团,不易与MIPs间形成氢键,因而8种镇静剂和5种磺胺类药物不能被MISPE柱特异性保留。

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 8种镇静剂和5种磺胺类药物在3种淋洗剂和1种洗脱溶液下的回收率 Table 2 Recoveries of eight sedatives and five sulfonamides in three washing solutions and an elution solution No. Compound Washing solutions/% Elution solution of 10%(v/v) acetic acid/acetonitrile/% Water Acetonitrile 0.5%(v/v) acetic acid/acetonitrile 1 acepromazine - 9 55.5 38 2 diazoxide - 73 8 21.2 3 xylazine - 8.2 50.5 40 4 diazapam - 60.4 8.1 29.8 5 lorazepam - 84.5 14 - 6 estazolam - 91 8 - 7 azaperone - 55.3 19 28.5 8 flurazepam - 62 25 11 9 sulfanitran - 68 30.7 - 10 sulfathiazole 18 79 - - 11 trimethoprim - 80 8 14 12 sulfamonomethoxine 23 73 - - 13 sulfameter 28 75 - - -: non-detection.

表 2 8种镇静剂和5种磺胺类药物在3种淋洗剂和1种洗脱溶液下的回收率 Table 2 Recoveries of eight sedatives and five sulfonamides in three washing solutions and an elution solution

图 5

Fig. 5

图 5 8种镇静剂和5种磺胺类药物的化学结构 Fig. 5 Chemical structures of eight sedatives and five sulfonamides

LC-MS/MS对复杂样品的痕量分析中,基质效应是不容忽视的问题^[20]。猪尿中含有蛋白、尿素、尿酸等杂质,这些杂质的存在会影响分析结果的可靠性。本研究对不同批次的猪尿样品的基质效应进行了考察,分别将不同体积的混合标准工作液加入经1.4节净化后的猪尿样品中,以β₂-受体激动剂的峰面积对加标浓度绘制基质加标标准曲线^[7],β₂-受体激动剂的斜率与试剂加标标准曲线的斜率比为88.1%~110.7%。结果表明,样品经MISPE柱净化后,基质效应对分析结果影响不明显。

本实验采用加标标准曲线进行线性关系的考察。用甲醇稀释混合标准工作液,制备浓度分别为0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10和20 μg/L的混合工作曲线溶液。以质量浓度(X,μg/L)为横坐标、定量子离子峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程与相关系数(r²)。从表 3可知,本方法在0.1~20 μg/L范围内15种β₂-受体激动剂线性关系良好(r²≥0.992)。在猪尿样品中添加不同浓度的标准品进行样品前处理,以实际测得的最低浓度为定量限(LOQ),按1/3的定量限浓度确定检出限(LOD),本方法的检出限和定量限分别为0.03和0.1 μg/L。

表 3

Table 3

表 3(Table 3)

表 3 15种β2-受体激动剂的回归方程及相关系数(r2) Table 3 Regression equations and correlation coefficients (r2) of the 15 β2-agonists No. Compound Regression equation r2 1 zilpaterol Y=1868.39X+63.386 0.992 2 salbutamol Y=10811.4X-347.586 0.996 3 terbutaline Y=20176.1X-944.44 0.993 4 cimaterol Y=9503.85X-153.117 0.995 5 cimbuterol Y=1868.39X-63.3867 0.992 6 fenoterol Y=696.772X-7.67336 0.995 7 ractopamine Y=5724.22X-152.39 0.997 8 clorprenaline Y=3381.04X+17.9315 0.998 9 formoterol Y=22641.7X+847.143 0.994 10 tulobuterol Y=16937X+500.796 0.996 11 clenbuterol Y=8377.61X-269.543 0.994 12 bambuterol Y=16452.5X-576.25 0.994 13 mabuterol Y=5823.33X+26.2063 0.998 14 phenylethanolamine A Y=5625.19X-67.6813 0.996 15 penbuterol Y=20811.4X+458.585 0.992 Linear range: 0.1-20 μg/L。

表 3 15种β2-受体激动剂的回归方程及相关系数(r2) Table 3 Regression equations and correlation coefficients (r2) of the 15 β2-agonists

采用外标法定量,选择0.1、0.5、2.5 μg/L 3个加标浓度进行回收率试验,每个浓度水平做6个平行试验,重复3次,15种β₂-受体激动剂的加标水平、平均回收率和相对标准偏差如表 4所示。不同加标浓度下,15种β₂-受体激动剂的回收率为65.6%~115.0%(n=18),批内、批间相对标准偏差分别为0.57%~16.1%和1.11%~16.8%。

表 4

Table 4

表 4(Table 4)

表 4 猪尿中15种β2-受体激动剂的平均回收率和批内、批间相对标准偏差 Table 4 Average recoveries, intra-RSDs and inter-RSDs of the 15 β2-agonists spiked in a swine urine sample No. Compound Added/(μg/L) Recovery(n=18)/% Intra-RSD(n=6)/% Inter-RSD(n=3)/% No. Compound Added/ (μg/L) Recovery(n=18)/% Intra-RSD(n=6)/% Inter-RSD(n=3)/% 1 zilpaterol 0.1 90.0 3.78 5.7 9 formoterol 0.1 115.0 4.16 3.99 0.5 80.3 2.73 2.8 0.5 95.3 1.0 3.06 2.5 89.8 12.5 16.8 2.5 107.8 7.02 5.07 2 salbutamol 0.1 88.3 9.45 7.32 10 tulobuterol 0.1 93.3 4.0 5.24 0.5 84.3 5.1 4.02 0.5 75.7 1.53 1.83 2.5 90.1 7.0 16.1 2.5 84.9 15.1 12.3 3 terbutaline 0.1 102.3 0.57 5.59 11 clenbuterol 0.1 85.0 7.09 8.36 0.5 88.3 2.08 2.84 0.5 96.6 2.0 3.53 2.5 96.5 1.53 13.9 2.5 89.4 13.0 15.6 4 cimaterol 0.1 83.3 5.55 7.03 12 bambuterol 0.1 96.1 4.51 3.79 0.5 84.6 0.57 3.14 0.5 88.7 2.31 2.91 2.5 86.8 16.1 15.0 2.5 65.6 7.86 13.0 5 cimbuterol 0.1 101.6 3.78 3.78 13 mabuterol 0.1 93.3 3.0 9.73 0.5 86.6 5.77 4.32 0.5 93.0 2.08 3.19 2.5 92.4 13.07 15.2 2.5 89.6 10.01 14.2 6 fenoterol 0.1 105.0 5.50 8.53 14 phenylethan- 0.1 103.3 5.50 9.51 0.5 100.6 2.03 1.11 olamine A 0.5 91.3 4.53 4.94 2.5 90.6 12.2 16.0 2.5 87.5 2.0 5.96 7 ractopamine 0.1 85.3 7.54 7.33 15 penbuterol 0.1 101.6 4.72 3.35 0.5 93.0 2.64 4.64 0.5 97.3 1.15 4.88 2.5 93.4 13.3 11.8 2.5 88.8 10.1 13.9 8 clorprena- 0.1 96.6 6.55 6.34 line 0.5 98.0 1.15 2.67 2.5 86.6 10.4 13.4

表 4 猪尿中15种β2-受体激动剂的平均回收率和批内、批间相对标准偏差 Table 4 Average recoveries, intra-RSDs and inter-RSDs of the 15 β2-agonists spiked in a swine urine sample

分别利用本研究建立的MISPE-UPLC-MS/MS分析方法和传统的混合型阳离子萃取柱(MCX)结合UPLC-MS/MS方法^[21]对山东省某屠宰场采集的50份猪尿样品进行测定。由检测结果中发现,有2份猪尿液样品中含有沙丁胺醇,2种方法测定的残留值分别为3.52、 5.78 μg/L和3.31、 5.95 μg/L;其余样品均为阴性,且两种方法检测结果一致。

本研究建立了MISPE-UPLC-MS/MS同时测定猪尿中15种β₂-受体激动剂残留的分析方法,同时优化了分子印迹固相萃取柱的上样、淋洗和洗脱条件。该方法无需复杂的样品前处理条件,通过MIPs的特异性吸附,有效降低了基质效应,提高了分析方法的选择性与灵敏度。