苯胺类化合物(aniline derivatives,ADs)作为合成染料、化妆品、医药和橡胶等的重要原料和中间体而被广泛应用,又因具有毒性强和潜在的致癌作用而成为我国规定的优先控制污染物。
根据文献报道,目前液相色谱-质谱法测定水中苯胺类化合物时多采用直接进样,联苯胺检出限一般为0.024～0.3 μg/L,苯胺检出限为0.023～2.0 μg/L[1]。在我国《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)中规定,联苯胺的标准限值是0.2 μg/L。采用直接进样时,部分仪器的灵敏度达不到标准限值的要求,而且直接进样测试废水样品时基质干扰很大。如陈勇等[2]采用直接进样液相色谱-质谱法(LC-MS)测定水中的联苯胺,地表水样品的回收率均大于70%,而生活污水和工业废水样品的加标回收率为33.0%～68.4%;赵云芝等[3]采用液相色谱-串联质谱法测定水中14种苯胺类化合物,在测定废水样品时,联苯胺和邻苯二胺的回收率低于50%。因此需要对水样进行富集和净化。常用的前处理方法包括液液萃取和固相萃取等方法,在处理废水样品时,液液萃取富集后还需要进一步净化处理,而固相萃取集富集和净化为一身,成为LC-MS分析的首选方法。
液相色谱-串联质谱中的基质效应是由于基质中的非挥发性组分与待测物在离子化的过程中产生竞争,影响待测物的离子化效率。产生基质效应的干扰性物质分为两类:一类是“内源性物质”,它源自于被分析物本身,并保留在最终的提取液中;另一类是“外源性物质”,来源于方法建立过程中的外部环境[4]。
消除基质干扰的方法主要有文献报道[4,5,6,7]的: (1)选择合适的色谱分离条件;(2)选择合适的样品前处理方法;(3)优化质谱分析条件;(4)使用合适的内标;(5)采用基质标准溶液校正。
本文通过上述5种消除基质干扰的方法来研究液相色谱-串联质谱法测定水中苯胺类化合物的基质干扰问题,并详细探讨和优化了色谱分离和固相萃取的条件,建立了固相萃取/液相色谱-串联质谱法测定水中苯胺类化合物的方法。
高效液相色谱-串联质谱仪:高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司);带ESI源API 4000 QTrap三重四极杆质谱仪(美国AB Sciex公司); Milli-Q超纯水发生器(美国Millipore公司); Shim-pack FC-ODS柱(150 mm×2.1 mm,3 μm,日本Shimadzu公司); N-EVAPⅢ氮吹仪(美国Organomation公司);固相萃取装置(美国Supelco公司); C18和HLB固相萃取柱(500 mg/6 mL)、混合型阳离子交换柱(Oasis MCX,150 mg/6 mL)(美国Waters公司);硅胶基质强阳离子交换柱(Discovery DSC-SCX,500 mg/6 mL,美国Supelco公司);微孔滤膜(0.22 μm,聚醚砜,天津津腾公司)。
甲醇(HPLC级,J&K Scientific Ltd.);甲酸(HPLC级,CNW Technologies);乙酸(HPLC级,Tedia公司);氨水(优级纯,含量为25%～28%);标准物质和标准溶液:间苯二胺(m-PDA)、邻苯二胺(o-PDA)、邻甲氧基苯胺(2-ASD)、邻甲苯胺(o-T)、间硝基苯胺(MNA)、间氯苯胺(3-CA)、2-萘胺(2-NA)、2,4-二甲基苯胺(2,4-DMA)、2,6-二甲基苯胺(2,6-DMA)、2,6-二乙基苯胺(2,6-DEA)、2-乙基-6-甲基苯胺(2-E-6-MA)和内标D5-苯胺(D5-ANL)购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH和美国AccuStandard公司,纯度均大于99%;苯胺(ANL)、联苯胺(BNZ)、对甲苯胺(p-T)、对硝基苯胺(PNA)、邻硝基苯胺(ONA)、3,3′-二氯联苯胺(DCB)、对氯苯胺(p-CA)标准溶液均购自美国AccuStandard公司。
苯胺类化合物标准储备液:分别准确称取适量的苯胺类标准物质,用甲醇配制质量浓度为100 mg/L的标准储备液,于-18 ℃避光保存;内标储备液:准确称取适量内标D5-苯胺标准物质,用甲醇配制质量浓度为100 mg/L的标准储备液,于-18 ℃避光保存;混合标准使用液:吸取适量苯胺类化合物标准储备液,用甲醇稀释,配制混合标准使用液,邻硝基苯胺和间硝基苯胺的质量浓度为10.0 mg/L,其余化合物的质量浓度为1.0 mg/L,于0 ℃避光保存;内标使用液:吸取适量D5-苯胺标准储备液,用甲醇配制成质量浓度为1.0 mg/L的内标使用液,于0 ℃避光保存。
采集某印染企业污水处理站的进口和出口废水,采样容器为棕色玻璃瓶,将水样充满样品瓶。采样后立即用氨水或甲酸调节pH至中性,于4 ℃冷藏避光保存。
上样前依次用10 mL甲醇和超纯水分别活化阳离子交换柱和固相萃取柱,对于MCX柱,取100 mL水样以3 mL/min的流速通过小柱;对于SCX柱,取20 mL水样以1 mL/min的流速通过小柱;两种阳离子交换柱均依次用5 mL 3%(v/v)乙酸水溶液和4 mL 10%(v/v)甲醇水溶液淋洗小柱,弃去淋洗液,用真空泵抽干10 min,最后分别用7 mL 5%(v/v)氨水甲醇洗脱MCX小柱,用5 mL 10%(v/v)氨水甲醇洗脱SCX小柱;对于HLB和C18固相萃取柱,取100 mL水样以1 mL/min的流速通过小柱，用氮吹仪吹干后,用10 mL二氯甲烷或二氯甲烷-丙酮(1:1,v/v)或二氯甲烷-正己烷(1:1,v/v)或甲醇溶液洗脱。固相萃取柱和阳离子交换柱的洗脱液于50 ℃氮吹浓缩至1.0 mL,用超纯水稀释2倍后,加入内标使用液10.0 μL,混匀,过0.22 μm聚醚砜微孔滤膜,滤液供LC-MS/MS测定。
色谱柱(Shim-pack FC-ODS,150 mm×2.0 mm,3 μm);流动相:A为0.005%(v/v)甲酸水溶液,B为甲醇溶液;梯度洗脱程序:5%B保持0.5 min,在9.5 min内升高至90%B,在0.1 min内降为5%B,平衡5 min;进样量:10 μL;柱温:40 ℃;流速:0.2 mL/min。
电喷雾离子(ESI)源正离子模式扫描,监测模式为多反应监测(MRM)。离子化参数:离子喷雾电压5 500 V;雾化气为氮气,压力为4.14×105 Pa;辅助气为氮气,压力为4.14×105 Pa;辅助气温度600 ℃;气帘气压力为2.41×105 Pa;质谱多反应监测参数见表 1。
在反相色谱分离过程中,基质干扰主要产生于分析时间的前段。因此,调整色谱条件,如降低流动相中有机溶剂的起始浓度,延长梯度洗脱的时间,以及改变流动相的组成和pH值等条件,使待测物的出峰时间推迟,以降低基质干扰。
在前期的研究工作[3]中,流动相采用甲醇和0.1%(v/v)甲酸水溶液进行梯度洗脱,甲醇的起始体积分数为35%。但在对废水样品分析时,发现基质干扰对出峰时间较早的邻苯二胺和联苯胺影响较大。因此,本实验降低了甲醇的起始体积分数,分别考察了当甲醇的体积分数为35%、20%、10%、5%、2%时,工业废水中的苯胺类化合物的回收率。结果表明,随着甲醇起始体积分数的降低,苯胺类化合物保留时间延长,大部分化合物的回收率有所提高,但当甲醇的体积分数为2%时,苯胺类化合物的峰形展宽。间苯二胺、邻苯二胺和联苯胺的回收率仍偏低,且依然受基质干扰的影响,需通过改变流动相的pH以延迟极性组分的出峰时间。
苯胺类化合物为弱碱性有机化合物,流动相的pH对保留时间影响较大,因此,在梯度洗脱程序中,甲醇的起始体积分数为5%的条件下,分别考察了当甲酸的体积分数为0.1%(pH 2.92)、0.05%(pH 2.98)、0.02%(pH 3.07)、0.01%(pH 3.18)、0.005%(pH 3.32)、0.002%(pH 3.66)时,工业废水中苯胺类化合物的加标回收率。结果表明,随着甲酸体积分数的降低,苯胺类化合物的保留时间推迟,回收率也有所提高,特别是间苯二胺、邻苯二胺和联苯胺化合物。当甲酸的体积分数为0.005%时,苯胺类化合物的回收率为74%(间苯二胺)～106%(间硝基苯胺);当甲酸的体积分数为0.002%时,间苯二胺的回收率有所下降,且实际样品的保留时间偏移较大。因此,最终选择甲醇和0.005%(v/v)甲酸水溶液作为流动相,且甲醇的起始体积分数为5%。
同时还考察了用10 mmol/L甲酸铵-甲酸缓冲溶液作流动相,调节pH值至3.0、4.0、5.0、6.7时,苯胺类化合物的保留时间、分离效果和响应强度。结果表明,苯胺类化合物在甲酸铵-甲酸缓冲溶液中的响应强度比在甲酸溶液中降低了1～2个数量级,且间苯二胺、邻苯二胺和联苯胺的保留时间延迟不明显,故未选择该缓冲溶液作为流动相。
本实验分别考察了当上样体积为5 mL时C18、HLB、MCX、SCX萃取柱的萃取效果。C18和HLB柱均用10 mL的二氯甲烷、二氯甲烷-丙酮(1:1,v/v)、二氯甲烷-正己烷(1:1,v/v)、甲醇洗脱;MCX和SCX柱均用5 mL 的5%(v/v)氨水甲醇和10%(v/v)氨水甲醇溶液洗脱。不同萃取柱的回收率见表 2。结果表明,C18柱在4种洗脱溶剂下的回收率均很低,HLB柱在4种洗脱溶剂下的回收率比C18柱稍高,但大部分苯胺类化合物回收率低于60%。苯胺类化合物属于弱碱性化合物,极性较强,常用的C18和HLB柱对苯胺类化合物吸附不完全,致使回收率偏低。而MCX和SCX柱具有吸附和交换两种作用力,对苯胺类化合物的富集效果较好。采用MCX柱时,苯胺类化合物在2种洗脱溶剂下的回收率差异不大,但邻苯二胺的回收率低于15%,其余17种苯胺类化合物的回收率为61.4%～96.7%,但当间苯二胺在上样体积为100 mL时,回收率偏低。采用SCX柱时,苯胺类化合物在2种洗脱溶剂下的回收率差异不大,但2-硝基苯胺回收率低于2%,其余17种苯胺类化合物回收率为58.6%～100.4%。因此,分析除邻硝基苯胺之外的17种苯胺类化合物时,采用SCX柱;分析除邻苯二胺之外的17种苯胺类化合物时,使用MCX柱。
采用MCX和SCX柱富集苯胺类化合物,将洗脱液浓缩至0.5 mL,用纯水定容至1 mL时,联苯胺、间苯二胺和邻苯二胺的回收率均低于50%;将洗脱液浓缩至1 mL时,联苯胺的回收率在80%以上,但间苯二胺和邻苯二胺的回收率仍低于50%;将洗脱液浓缩至1 mL后,用纯水稀释2倍以上时,间苯二胺和邻苯二胺的回收率在60%～80%之间,其他化合物的回收率在70%～100%之间。因此,浓缩后的剩余体积不宜太少,至少为1 mL。同时将浓缩液稀释2倍以上,可以避免溶剂效应,并降低基质干扰。
本实验考察了用4 mL体积分数分别为5%、10%、25%、50%、100%的甲醇水溶液淋洗MCX柱时苯胺类化合物的回收率。结果表明,当甲醇的体积分数从5%升至10%时,苯胺类化合物的回收率均有所提高,回收率为69.8%～86.4%;体积分数从10%升至50%时,联苯胺的回收率逐渐降低,其余苯胺类化合物的回收率差异不大;当甲醇的体积分数升至100%时,所有化合物的回收率均降低,其中对硝基苯胺和邻硝基苯胺的回收率降至10%以下。因此本方法选择10%(v/v)甲醇水溶液为淋洗液。
本实验还考察了10%(v/v)甲醇水溶液为淋洗液时,淋洗液的体积(2、4、6、8 mL)对苯胺类化合物回收率的影响。结果表明,当淋洗液体积从2 mL增至4 mL时,苯胺类化合物的回收率均有所提高;从4 mL增至8 mL时,各化合物的回收率稍有下降。因此本方法选择淋洗液的体积为4 mL。
本研究同时考察了2%(v/v)甲酸水和3%(v/v)乙酸水溶液作为淋洗液对苯胺类化合物回收率的影响。结果显示,大部分苯胺类化合物在2%(v/v)甲酸水和3%(v/v)乙酸水溶液两种条件下的回收率均在70%以上,且没有显著差异,仅间苯二胺和邻苯二胺在3%(v/v)乙酸水溶液条件下回收率有明显提高。因此最终选择3%(v/v)乙酸水溶液锁定苯胺类化合物。
(1)使用MCX柱的条件
本实验考察了用5 mL体积分数分别为2%、5%、10%、20%的氨水甲醇混合溶液进行洗脱时,氨水的含量对苯胺类化合物回收率的影响。如图 1所示,当氨水的体积分数从2%增至5%时,苯胺类化合物的回收率均有所提高;体积分数从5%增至10%时,各化合物的回收率差异不大,基本稳定;从10%增至20%时,各化合物的回收率有所下降。说明5%～10%(v/v)氨水甲醇溶液洗脱时,苯胺类化合物的回收率均较好。但氨水含量增加后,苯胺类化合物的保留时间偏移较大,特别是出峰时间较早的间苯二胺和邻苯二胺。3,3′-二氯联苯胺的回收率在5%(v/v)氨水甲醇洗脱时高于10%(v/v)氨水甲醇。而且在用100 mL地表水和地下水上样时,10%(v/v)氨水甲醇洗脱液浓缩过程中出现了浑浊。因此本方法选择5%(v/v)氨水甲醇溶液作为MCX柱的洗脱溶液。
本实验同时考察了用3、5、6、7、8 mL 5%(v/v)氨水甲醇溶液洗脱时,洗脱液体积对苯胺类化合物回收率的影响。结果表明,当洗脱液体积从3 mL增至5 mL时,苯胺类化合物的回收率均有所提高;从5 mL增至7 mL时,各化合物的回收率差异不大,基本稳定;当体积增加至8 mL时,各化合物的回收率稍有下降。因此本方法选择MCX柱的洗脱液体积为7 mL。
(2) 使用SCX柱的条件
本实验考察了用5 mL体积分数分别为5%、10%、20%的氨水甲醇混合溶液为洗脱液时,氨水的含量对苯胺类化合物回收率的影响。如图 2所示,当氨水的体积分数从5%增至10%时,邻苯二胺的回收率有所提高,其余苯胺类化合物的回收率基本稳定;体积分数从10%增至20%时,各化合物的回收率有所下降。因此本方法选择10%(v/v)氨水甲醇溶液为SCX柱的洗脱液。
本实验同时还考察了用3、5、6、7、8 mL 10%(v/v)氨水甲醇溶液洗脱时,洗脱液体积对苯胺类化合物回收率的影响。研究表明,当洗脱液体积从3 mL增至5 mL时,苯胺类化合物的回收率基本稳定;体积从5 mL增至8 mL时,各化合物的回收率有所下降。因此本方法选择SCX柱洗脱液的体积为5 mL。
本研究考察了采用SCX柱和MCX柱对某城镇污水处理厂进口污水、某印染企业污水处理站的进口和出口废水的加标样品进行萃取浓缩后,用超纯水稀释5、10、20倍时,苯胺类化合物的回收率。采用SCX柱对城镇污水样品进行净化处理,所得的加标回收率如图 3所示。随着浓缩液稀释倍数的增加,大部分苯胺类化合物的加标回收率逐渐提高。对于出口废水样品,浓缩液稀释5倍和10倍时,苯胺类化合物的回收率差异不大;对于较洁净的地表水样品,浓缩液稀释2倍时,回收率即可满足要求。因此,针对不同基质的水样,可根据情况选择合适的稀释倍数来降低基质干扰和溶剂效应。
取100 mL空白加标水样,采用MCX柱净化处理,考察上样流速(1.0、3.0、5.0、10.0 mL/min)对苯胺类化合物回收率的影响。结果表明,当上样流速从1.0 mL/min增至3.0 mL/min时,苯胺类化合物的回收率基本稳定;上样流速从3.0 mL/min增至10.0 mL/min时,各化合物的回收率稍有下降。因此本方法选择MCX柱的上样流速为3.0 mL/min。
对于SCX柱,重复上述实验操作,结果表明,上样流速不宜太快,以1.0 mL/min为宜。这是因为流速增大后,间苯二胺和邻苯二胺的回收率小于50%。
选择合适的离子源也是简便、有效消除基质干扰的方法[8,9]。本文比较了大气压化学电离(APCI)源和ESI源对苯胺类化合物基质干扰的影响。对废水样品采用直接进样方式进行加标回收率试验,结果表明,在这2种离子源条件下,苯胺类化合物的回收率均在80%以上,但使用APCI源,苯胺类化合物的响应强度降低,仅为ESI源的1/3左右。因此本实验选择ESI源作为离子源。
待测组分与其同位素在样品制备、色谱分离及质谱检测过程中具有相似的行为,受基质干扰的影响也一致。如果每种化合物均用其同位素作为内标,则同位素内标法是补偿基质干扰最理想的方法。但同位素内标价格昂贵,且不易得到。同时,内标法要求加入内标物的量要恒定,否则引起的误差更大。本实验选择D5-苯胺为内标物进行内标法定量分析。以10%(v/v)甲醇水-0.01%(v/v)甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,直接进样法检测工业废水样品,通过内标法和外标法计算苯胺类化合物的回收率,结果如图 4所示。结果表明,内标法部分补偿了苯胺类化合物受到的基质干扰,回收率较外标法高;但对极性强、出峰时间早、受到基质干扰影响大的间苯二胺的补偿效果不理想,回收率仅为30%～40%;以5%(v/v)甲醇水-0.005%(v/v)甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,所有苯胺类化合物的基质干扰较小,用内标法和外标法计算回收率,结果差异不大。
应用液相色谱-串联质谱法的研究中,采用基质标准溶液校正是最常用的补偿基质干扰的方法[10,11,12]。基质标准溶液是将空白样品经前处理后,加入一定量的待测物标准品,以对检测结果进行校正。
本文采用MCX柱萃取空白加标样品,分别用空白萃取液和超纯水配制基质标准溶液和标准溶液制作基质校准曲线和标准曲线,外标法定量,苯胺类化合物的回收率如图 5所示。大部分苯胺类化合物的回收率差异不大,但采用基质校准曲线在很大程度上补偿了2,6-二甲基苯胺、间氯苯胺和3,3′-二氯联苯胺的基质抑制效应,回收率明显提高。
取适量苯胺类化合物混合标准使用液和内标使用液于超纯水中,配制质量浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的混合标准溶液,内标的质量浓度为10.0 μg/L。在优化的色谱和质谱条件下进行分析,以分析物的质量浓度为横坐标(x,μg/L),分析物峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标(y),绘制标准曲线,各苯胺类化合物线性关系良好。线性方程、线性范围、相关系数等数据见表 3。苯胺类化合物和内标物的总离子流色谱图见图 6。
根据《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(HJ168-2010)[13]确定方法检出限(MDL): MDL=t(n-1,0.99)×S(当n=7时,t=3.143; S为标准偏差)。采用MCX柱萃取,当上样体积为100 mL,浓缩液稀释2倍时,16种苯胺化合物的方法检出限为0.002～0.035 μg/L;采用SCX柱萃取,当上样体积为20 mL,浓缩液稀释2倍时,17种苯胺化合物的方法检出限为0.013～0.207 μg/L(见表 3)。
采用空白基质加标的方法评价准确度与精密度,结果见表 4。以某饮用水源地表水为基质,采用MCX柱萃取,上样体积为100 mL,分别添加0.04、0.2、1.0 μg/L的苯胺类化合物标准溶液,每个添加水平做6个平行试验,16种苯胺类化合物的加标回收率为72.5%～92.5%,相对标准偏差为1.4%～9.6%;采用SCX柱对地表水进行萃取,上样体积为20 mL,分别添加0.2、1.0、5.0 μg/L的苯胺类化合物标准溶液,每个添加水平做6个平行试验,17种苯胺类化合物的加标回收率为66.5%～102%,相对标准偏差为2.4%～13.6%。该方法的准确度与精密度均可满足痕量分析的要求。
利用本实验建立的分析方法,对某饮用水源地的地表水、某城镇污水处理厂进口污水和某印染企业的污水处理站的进口和出口废水进行了测定。某饮用水源地的地表水和某城镇污水处理厂的进口污水样品中均未检出苯胺类化合物。在印染企业的废水样品中检测出了苯胺、对硝基苯胺、2,4-二甲基苯胺、2-萘胺、对氯苯胺和3-氯苯胺，在进口废水中的质量浓度分别为11.9、3.34、1.53、4.43、2.90、2.04 μg/L，在出口废水中的质量浓度分别为1.07、0.263、0.124、0.410、0.298、0.178 μg/L。
本研究通过优化固相萃取和色谱条件,建立了固相萃取/液相色谱-串联质谱检测水中苯胺类化合物的分析方法,并讨论了消除基质干扰的方法。在本实验讨论的5种消除基质干扰的方法中,调整色谱分离条件是最根本也是最有效的方法。Eduard等[14]研究亦表明,基质效应的大小直接依赖色谱的分离性能。也有报道称色谱条件的改变是最直接的分离内源性物质的方法[15]。其次是选择合适的前处理方法,以达到良好的回收率和最小的基质干扰。在前两种方法都无法消除基质干扰的情况下,可采用更换离子源、内标法定量和利用基质校准标准曲线来消除或补偿基质干扰。
2016, Vol. 34 Issue (3): 289-298
PDF (2481 KB)
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