母乳中的棕榈酸是以sn-2位棕榈酸的形式被婴幼儿机体吸收的^[1],而且sn-2位棕榈酸能够促进婴幼儿对钙、镁等物质及营养物质的吸收^[2],能够提高脂肪酸的吸收利用率,促进婴儿骨骼矿物质的沉积、预防便秘^[3]。1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(简称OPO)是一种典型的sn-2位棕榈酸,2008年中华人民共和国卫生部第13号公告批准了OPO作为营养强化剂用于婴幼儿配方食品。2012年发布的食品营养强化剂使用标准^[4]明确规定了OPO在婴幼儿配方奶粉中的添加量。OPO的生产工艺是由脂肪酶催化酯交换,使脂肪酸在丙三醇分子上的位置重新排列而得,伴有副产物1,2-二油酸-3-棕榈酸甘油三酯(简称OOP)。OOP是OPO的同分异构体,完全不具有OPO的生理功能,为了保证强化OPO的婴儿配方奶粉能达到应有的功效,需要准确测定OPO的含量,其关键是对OPO和OOP进行有效分离。目前报道的OPO检测方法主要有气相色谱法^[5]、气相色谱-质谱联用法^[6]、液相色谱-质谱联用法^{[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14]}、
液相色谱法^{[15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25]}等。气相色谱法和气相色谱-质谱联用法中使用的是高温毛细管柱,无法分离OPO与OOP这一类在分子组成上完全一致的同分异构体。无论是气相色谱-质谱联用法还是液相色谱-质谱联用法,如果色谱柱不能有效地将OPO与OOP分离,质谱仪是无法对其混合物进行分离检测而准确定量的。目前国家尚无关于OPO的检测标准,液相色谱法中使用的色谱柱有硅胶柱、C18柱和银离子柱,但对OPO与OOP的分离效果和OPO测定的重复性与准确性没有比较,无法确定适合分离OPO的色谱柱以建立准确的测定方法。

本研究尝试采用不同的色谱柱分离添加OPO的婴幼儿配方乳粉样品,以高效通用性检测器蒸发光散射检测器(ELSD)对OPO进行测定。比较不同色谱柱对OPO与OOP的分离效果、OPO测定的重复性、准确性以及灵敏度,建立准确测定OPO的方法,为制定婴幼儿配方乳粉中OPO的标准检测方法提供参考。

Waters 2695高效液相色谱仪,美国Waters公司;ELSD 2000蒸发光散射检测器,美国Alltech公司;RE-52AA旋转蒸发仪,上海亚荣生化市仪器厂;BS224S天平,德国Sartorius公司。

OPO(纯度≥99% )、OOP(纯度≥99% )购自瑞典Larodan公司;二氯甲烷(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、丙酮(色谱纯)、正己烷(色谱纯)、异丙醇(色谱纯)、氨水(质量分数约25% )、乙醚、石油醚和乙醇购自天津科密欧公司;实验用水均为蒸馏水;以上试剂除标注的外均为分析纯。

将25 mg OPO和OOP标准样品分别用二氯甲烷溶解,定容到25 mL容量瓶中,配制成 1 000 mg/L 的标准储备液。各取2 mL OPO和OOP标准储备液至10 mL容量瓶中,用二氯甲烷准确定容,得到200 mg/L 的OPO和OOP混合标准溶液。准确移取OPO标准储备液置于10 mL容量瓶中,用二氯甲烷准确定容,得到1～1 000 mg/L 的系列OPO标准工作溶液。取适量不同浓度的OPO标准工作溶液及OPO和OOP混合标准溶液注入样品瓶中待测。

称取婴幼儿配方乳粉约0.5 g于50 mL具塞离心管中,加入5 mL (65±5) ℃的水将试样充分溶解,加入1.0 mL氨水充分混合后将离心管放入(65±5) ℃的水浴中加热15～20 min,取出冷却至室温。加入5 mL乙醇进行混匀后,加入10 mL乙醚和10 mL石油醚,手动振摇1 min。将离心管放入离心机中,在500～600 r/min 下离心5 min,取出静止放置到上层液澄清,并明显与水相分离,将上层液尽可能地全部转移到旋转蒸发瓶中。再用乙醚和石油醚提取两次,合并醚液于旋转蒸发瓶中,于60 ℃下浓缩至干,用二氯甲烷转移并定容至25 mL容量瓶中,混匀后上机测定。

色谱柱:Agilent ChromSpher 5 Lipids色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m,银离子修饰阳离子交换配体键合球形硅胶吸附相);柱温:25 ℃;检测器:ELSD;载气流速:1.6 L/min;漂移管温度:60 ℃;流动相A:二氯甲烷;流动相B:丙酮;流速:0.8 mL/min;梯度洗脱程序:0～25 min,80%A; 25～27 min,80%A线性降至20%A; 27～33 min,20%A; 33～35 min,20%A线性升至80%A,保持5 min。

根据实验室的条件选择了硅胶色谱柱、C18色谱柱和银离子色谱柱进行试验,结果表明,用硅胶色谱柱分析OPO标准溶液和含OPO的样品待测液时,无论是以正己烷-异丙醇^[7]为流动相,还是以正己烷-丙酮^[10]为流动相,被测物都不被保留。当用C18色谱柱分离OPO标准溶液和含OPO的样品待测液时,分别以二氯甲烷-乙腈^{[9, 11, 12, 13, 16]}、乙腈-异丙醇^{[8, 17]}以及乙腈-丙酮^[15]为流动相,都能使OPO与其他油脂类杂质基本分离,且以二氯甲烷-乙腈为流动相时OPO的灵敏度较高。使用银离子色谱柱时,用二氯甲烷-丙酮^[18]作流动相能使OPO和其他油脂类杂质完全分离,用0.5% ～1%乙腈正己烷溶液^{[10, 14, 19, 20, 21, 22, 23, 24]}或正己烷-异丙醇-乙腈混合液^[25]作流动相也能达到相同的分离效果,但OPO的灵敏度较低,保留时间不稳定。因此使用C18色谱柱以二氯甲烷-乙腈为流动相,使用银离子柱以二氯甲烷-丙酮作流动相或以正己烷-异丙醇-乙腈作流动相,进行色谱条件的优化以分离OPO和OOP。

使用C18色谱柱,以二氯甲烷-乙腈作流动相,随着二氯甲烷在流动相中所占比例的降低,OPO的保留时间不断增加;当流动相中二氯甲烷的体积分数为35%时,OPO和OOP混合标准溶液与添加OOP标准溶液的样品待测液中,OPO和OOP的保留时间相同。进一步降低二氯甲烷在流动相中所占的比例,OPO和OOP仍然分离不开,而且OPO的响应变得很小,受到了基线噪声的干扰。结果说明C18色谱柱不能分离OPO和OOP,不能用于OPO的测定。

使用银离子色谱柱,以二氯甲烷-丙酮为流动相,在保证OPO和OOP完全分离的前提下,调整丙酮在流动相中所占体积分数为20%使OPO的灵敏度达到了最高,测定OPO和OOP混合标准溶液与添加OOP标准溶液的样品待测液,OPO和OOP完全被分离,OPO和OOP的保留时间稳定(见图 1左图)。以正己烷-异丙醇-乙腈(956: 40: 4,v/v/v)作流动相,OPO和OOP的分离效果很好,但OPO的灵敏度较低(见图 1右图),而且OPO和OOP的保留时间不稳定。这是由于流动相组分挥发导致流动相极性发生变化带来的影响,而乙腈在流动相中所占的体积分数小,无法进行梯度变化,OPO和OOP保留时间不稳定的现象难以改善。当以二氯甲烷-丙酮(80: 20,v/v)作流动相进行等度洗脱时,也存在流动相组分挥发导致OPO的保留时间不断波动的现象;另外,色谱柱中保留性强的物质不被洗脱出来也会对OPO的保留时间产生影响,故选用二氯甲烷-丙酮作为流动相,进行梯度洗脱。

图1

Fig. 1

图1 不同流动相条件下(a)OPO标准溶液、(b)OPO与OOP混合标准溶液及(c)添加OOP的样品待测液的色谱图 Fig.1 Chromatograms of (a) OPO standard solution, (b) mixed standard solution of OPO and OOP, and (c) a sample containing OPO and spiked with OOP eluted with different mobile phases Separation column: silver-ion column.

载气流速和漂移管温度是蒸发光散射检测器中可以调节的两个重要参数,建立HPLC-ELSD分析方法需要对这两个参数进行优化。在相同的载气流速下,漂移管温度从40 ℃开始升高,流动相逐渐得到充分挥发,噪声不断降低,OPO的响应不断增加;当漂移管温度为60 ℃时信噪比最高;漂移管温度进一步增加时,噪声大小基本维持不变,而OPO的响应开始大幅度降低,信噪比降低(见图 2a),所以漂移管温度确定为60 ℃。在其他条件不变的情况下,载气流速越小,形成的物质粒子半径越大,对激光的散射能力越强,相应的响应信号越大。但并不是载气流速越小越好,因为当载气流速太小时,流动相不能完全挥发,背景噪声会增加,信噪比也会降低。最优载气流速应是在可接受噪声的基础上,产生最大检测响应值时的最低流速。在相同的漂移管温度下,载气流速从1.0 L/min 开始增加,流动相逐渐得到充分挥发,噪声不断降低,而OPO的响应不断增加;当载气流速为1.6 L/min 时信噪比达到最高;载气流速进一步增加,噪声略有降低,而OPO的响应开始大幅度下降,信噪比变小(见图 2b),因此载气流速确定为1.6 L/min。

图2

Fig. 2

图2 OPO信噪比与(a)漂移管温度和(b)载气流速的关系图 Fig.2 Relationships of OPO signal to noise ratio and (a) temperature of drift tube and (b) flow rate of carrier gas

散射光的响应值与粒子质量的关系为I=km^b,m表示待测组分的粒子质量和,I表示待测组分所产生的散射光光强,k和b为常数。通过使用双对数方法产生线性曲线,即对待测组分的浓度和响应同时取对数,得到线性方程lg I=b lg m+lg k。取不同浓度的OPO标准溶液注入HPLC,记录目标峰峰面积。以峰面积的常用对数值(y)与标准品浓度的常用对数值(x)绘制线性回归曲线,其线性方程为y=0.684 5x-0.540 2,相关系数R²=0.999 8,线性范围1～1 000 mg/L,并以3倍信噪比计算出样品的检出限为20 mg/kg。

以同一个婴幼儿配方乳粉为实验材料,称取样品平行测定8次;再称取样品分别加入0.1 mL和1 mL 1.0 mg/L 的OPO标准溶液,进行8次平行测定;计算回收率以及样品测定值与回收率的相对标准偏差(RSD)。回收率为93.0% ～101.5% ,回收率的RSD为2.89% ～4.56% ,样品测定值的RSD为1.89% ～3.96% 。由此可以看出,测定结果较为稳定,方法的重复性较好,准确性好。

按照本方法对婴幼儿配方乳粉样品进行OPO的测定,其中标示添加OPO的样品有10个,OPO含量能达到国家规定标准^[4]的样品占10% 。标示添加OPO的样品色谱图中有OOP色谱峰出现(见图 3),说明该样品中含有OOP,如果检测方法不能分离OPO和OOP,就不能准确测定婴幼儿配方乳粉中OPO的含量。没有标示添加OPO的样品中均检出了OPO,含量在0.2～0.8 g/kg,说明婴幼儿配方乳粉不添加OPO也有本底。从实际样品的检测结果来看,该方法的灵敏度和准确度完全可以满足实际测试的需求。

图3

Fig. 3

图3 标示添加OPO的样品色谱图 Fig.3 Chromatogram of a sample containing OPO Peak identifications: 1. OPO; 2. OOP.

本文通过优化色谱条件分离了OPO和OOP,比较了正相色谱与反相色谱测定婴幼儿配方乳粉中OPO方法的优劣。其中硅胶色谱柱和C18色谱柱分离效果差,不适用于检测OPO;而银离子色谱柱配以二氯甲烷和丙酮作流动相测定婴儿配方乳粉中OPO,分离效果好,测定结果重复性好,准确度高,适合婴幼儿配方乳粉中OPO含量的生产监测和市场监管检测。