手性异构体在生物体内可能表现出不同的生理活性、药理活性和毒性等,光学纯异构体的制备与分离引起了研究者的极大兴趣。相较于不对称合成、结晶拆分及其他纯化方法,色谱法是目前获得单一对映体最有效的方法之一。高效液相色谱法(HPLC)在20世纪70年代后期逐渐发展起来,具有分离效能高、选择性好、检测灵敏和应用范围广等特点,目前已成为化学、医药、农药、商检和法检等领域中一项重要的分析和分离技术^[1]。

超临界流体色谱(SFC)技术发展于20世纪80年代,SFC分离主要以超临界CO₂和少量有机溶剂为流动相。与HPLC相比,分析速度快、时间短、分离效率高。流动相以超临界CO₂替代大量的有机溶剂,被视为一种绿色技术^{[2, 3, 4, 5, 6, 7]}。1985年,Mourier等^[8]首次采用SFC拆分手性化合物。Guiochon等^[9]应用SFC分离了80种手性化合物,取得了良好的分离效果。Novell等^[10]将寡糖聚合脯氨酸手性柱应用在SFC手性拆分中。Lin等^[11]将表面涂覆直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(AD)的手性固定相和表面涂覆纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(OD)的手性固定相联用,显著提高了拆分多手性中心化合物的能力。Nogle等^[6]发现在HPLC上可基线分离的样品在SFC上却无法有效拆分。Nelander等^[12]应用大赛璐OD手性柱分离了20种手性化合物,发现7种化合物在HPLC上的选择因子要高于在SFC上的选择因子,这些都说明SFC和HPLC的分离表现出一定的互补性。

本文分别采用SFC和HPLC方法对24种手性化合物在表面涂覆4种多糖衍生物的手性色谱柱上的手性分离进行研究,对比其在分离度和保留时间等方面的差异,探讨影响手性分离的因素。

Aglient 1200系列高效液相色谱系统,配真空脱气机、四元泵、自动进样器、100 μ L定量环、柱温箱、紫外检测器和工作站软件(美国Aglient公司); Chiralyser-MP型旋光检测器(德国IBZ Messtechnik公司); Waters超高效合相色谱系统(UPC²),配溶剂管理单元、样品管理单元、柱温箱、光电二极管阵列(PDA)检测器和Empower 3软件(美国Waters公司)。甲醇、异丙醇、乙醇和正己烷均为色谱纯(天津科密欧化学试剂有限公司)。本文使用4种手性固定相：硅胶表面涂覆纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(Enantiopak OD)、硅胶表面涂覆纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)(Enantiopak OJ)、硅胶表面涂覆直链淀粉-三[(S)- α -苯乙基氨基甲酸酯](Enantiopak AS)和硅胶表面涂覆直链淀粉-三(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)(Enantiopak AY)(见图 1); 24种手性化合物H1～H24(图 2)均由广州研创生物技术发展有限公司提供。

图1

Fig. 1

图1 4种多糖衍生物的结构示意图 Fig.1 Molecular structures of the four polysaccharide derivatives

图2

Fig. 2

图2 手性化合物H1～H24的结构示意图 Fig.2 Molecular structures of the chiral compounds H1-H24

手性化合物用乙醇溶解后进样。流动相使用前经过滤及超声脱气处理。HPLC分离实验在安捷伦1200系列高效液相色谱系统上进行,柱温:25 ℃;流速:1.0 mL/min。SFC分离在Waters超高效合相色谱系统上进行,柱温:35 ℃;流速:2.5 mL/min;背压:13.8 MPa。检测波长为手性化合物的最佳吸收波长。

手性异构体的保留因子分别由k₁=(t_R1-t₀)/t₀和k₂=(t_R2-t₀)/t₀计算得到,其中t_R1和t_R2分别为第一个和第二个洗脱对映异构体的保留时间(min),t₀为死时间(min)。分离因子 α =k₂/k₁, k₁为手性化合物两种对映异构体中弱保留组分的保留因子,k₂为强保留组分的保留因子。分离度R_s=2(t_R2-t_R1)/(w₂+w₁),其中w₁和w₂分别为相应对映异构体色谱峰的半峰宽^[13]。

在HPLC和SFC上拆分化合物H1～H14,色谱分离条件和结果见表 1,图 3为手性化合物第一个洗脱对映异构体洗脱时间的柱状对比图。结果表明,化合物H1～H10在SFC上的保留时间明显比在HPLC上短,且多数样品在SFC上的分离度大于其在HPLC上的分离度。SFC分离以超临界CO₂和少量有机溶剂为流动相,具有易扩散、黏度低和传质速率高的优点,可在较高的流速和较高的压力条件下进行分离和分析,故多数化合物在SFC上的保留时间明显小于HPLC^[11]。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 14种手性化合物在SFC和HPLC上的分离条件及结果 Table 1 Chromatographic conditions and separation results of the 14 chiral compounds by SFC and HPLC Compound No. Chiral column SFC HPLC Mobile phase (v/v) t R1/min α R s Mobile phase (v/v) t R1/min α R s H1 Enantiopak AS CO 2-IPA (80∶20) 4.32 1.55 4.81 Hex-IPA (80∶20) 13.03 1.63 2.52 H2 Enantiopak AS CO 2-IPA (80∶20) 10.80 1.55 5.00 Hex-IPA (80∶20) 32.93 1.50 1.48 H3 Enantiopak AS CO 2-IPA (80∶20) 5.26 1.56 4.98 Hex-IPA (80∶20) 13.13 1.67 2.40 H4 Enantiopak AS CO 2-IPA (80∶20) 4.42 1.79 5.43 Hex-IPA (80∶20) 9.17 1.57 1.94 H5 Enantiopak AS CO 2-IPA (80∶20) 3.42 1.11 1.75 Hex-EtOH (95∶5) 4.76 1.25 1.73 H6 Enantiopak AS CO 2-EtOH (90∶10) 2.22 1.39 3.68 Hex-EtOH (90∶10) 3.20 1.30 2.20 H7 Enantiopak AS CO 2-EtOH (90∶10) 2.25 1.40 3.84 Hex-EtOH (90∶10) 3.21 1.30 2.19 H8 Enantiopak OD CO 2-EtOH (90∶10) 5.93 2.02 12.12 Hex-EtOH (90∶10) 6.27 1.73 7.31 H9 Enantiopak OD CO 2-EtOH (90∶10) 2.23 1.31 3.96 Hex-EtOH (90∶10) 4.40 2.25 8.28 H10 Enantiopak OJ CO 2-IPA (93∶7) 2.00 1.10 1.51 Hex-EtOH (93∶7) 7.92 1.31 3.54 H11 Enantiopak OD CO 2 10.62 1.08 1.36 Hex 4.48 1.16 2.13 H12 Enantiopak OD CO 2 8.44 1.10 1.78 Hex 3.69 1.21 2.32 H13 Enantiopak OD CO 2 7.49 1.10 1.74 Hex 4.23 1.15 1.88 H14 Enantiopak OD CO 2 6.97 1.10 1.73 Hex 3.89 1.20 1.96 IPA: isopropanol; EtOH: ethanol; Hex: hexane. t R1: the retention time of the first-eluted enantiomer of the chiral compound; α : separation factor; R s: resolution.

表1 14种手性化合物在SFC和HPLC上的分离条件及结果 Table 1 Chromatographic conditions and separation results of the 14 chiral compounds by SFC and HPLC

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 10种手性化合物在SFC和HPLC上的分离条件及结果 Table 2 Chromatographic conditions and separation results of the 10 chiral compounds by SFC and HPLC Compound No. Chiral column SFC HPLC Mobile phase (v/v) t R1/min α R s Mobile phase (v/v) t R1/min α R s H15 Enantiopak OD CO 2-EtOH (90∶10) 1.57 1.19 1.29 Hex-EtOH (90∶10) 3.16 1.09 0.69 H16 Enantiopak OD CO 2-EtOH (90∶10) 1.67 1.23 2.72 Hex-EtOH (90∶10) 3.00 1.16 1.35 H17 Enantiopak OD CO 2-EtOH (90∶10) 1.75 1.25 2.83 Hex-EtOH (90∶10) 2.89 1.19 1.44 H18 Enantiopak AY CO 2-EtOH (90∶10) * 13.68 1.09 1.80 Hex-EtOH (90∶10) 6.68 1.13 0.62 H19 Enantiopak OJ CO 2-EtOH (90∶10) 3.11 1.19 2.54 Hex-EtOH (90∶10) 11.67 1.05 0.63 H20 Enantiopak OD CO 2-EtOH (93∶7) 19.58 1.12 2.00 Hex-EtOH (97∶3) 48.65 1.35 5.18 1.13 2.24 1.14 2.32 1.23 3.90 1.38 5.44 H21 Enantiopak AS CO 2-IPA (80∶20) 6.00 NS NS Hex-IPA (80∶20) 12.47 1.86 2.20 H22 Enantiopak OJ CO 2-EtOH (97∶3) 1.68 1.13 1.02 Hex-EtOH (97∶3) 3.03 1.38 1.19 H23 Enantiopak AY CO 2-EtOH (0.3% 4.16 1.05 NS Hex(0.1%TFA)- 12.34 1.13 1.39 TFA) (90∶10) EtOH (90∶10) H24 Enantiopak OD CO 2-EtOH (90∶10) 2.17 1.06 1.02 Hex-EtOH (90∶10) 3.04 1.12 1.07 * Flow rate: 0.5 mL/min. TFA: trifluoroacetic acid. NS: not separated.

表2 10种手性化合物在SFC和HPLC上的分离条件及结果 Table 2 Chromatographic conditions and separation results of the 10 chiral compounds by SFC and HPLC

图3

Fig. 3

图3 14种手性化合物在SFC和HPLC上第一个洗脱的异构体的保留时间对比图 Fig.3 Comparison of the retention times for the first-eluted enantiomers of the 14 chiral compounds by SFC and HPLC, separately

化合物H11～H14(即多氯联苯类化合物)在SFC条件下的保留时间都比在HPLC上长(见图 4),这可能是由于多氯联苯样品极性较低,以正己烷为流动相可更好地被洗脱。

图4

Fig. 4

图4 化合物H11～H14在Enantiopak OD柱上的色谱图 Fig.4 Chromatograms of compounds H11-H14 on the Enantiopak OD column

化合物H15～H24的色谱分离条件和分离结果见表 2。从图 5可知,17种化合物在SFC和HPLC上的分离因子均大于1.1;化合物H11、H18、H21、H23和H24在HPLC上的分离因子大于1.1,比在SFC上的分离效果好;而化合物H15和H19在SFC上的分离因子和分离度等都比HPLC好,两者表现出一定的互补性。这些差异主要归因于其分离机理和流动相体系的不同。

图5

Fig. 5

图5 最佳分离条件下在HPLC和SFC中选择因子大于1.1的化合物分布图 Fig.5 Distribution of the compounds with the selection factors more than 1.1 in SFC and HPLC modes under the optimal separation conditions

化合物H15～H17具有相似的分子结构,对其在SFC和HPLC上的分离结果(见表 2)进行了比较,探讨了结构对手性分离的影响。结果表明,随着苯环烷基侧链碳数的增加,化合物H15～H17弱保留组分在SFC上的保留时间呈现缓慢增加的趋势,而在HPLC上的保留时间则表现为减小趋势。化合物的疏水性随着侧链碳数增加而增大,与正己烷间的疏水-疏水作用增强,流动相对样品的洗脱作用增强。它们在SFC上的分离度和分离因子都优于HPLC。

图 6为H20(叶菌唑)在SFC和HPLC上的色谱图。在选定的流动相条件下,4种手性异构体在SFC和HPLC上都实现了基线分离(R_s＞1.5),同时在SFC上的洗脱时间明显比在HPLC上的短。非常有趣的是,观察到了因流动相条件不同而引起的对映体洗脱顺序反转现象。此前研究者对洗脱顺序反转现象已有较多报道,固定相类型、流动相pH值、有机改性剂和添加剂的种类及比例等因素的变化均可能引起对映体的洗脱顺序反转^{[14, 15, 16, 17, 18]}。

图6

Fig. 6

图6 H20(叶菌唑)在SFC和HPLC上的色谱图 Fig.6 Chromatograms of H20 (metconazole) using SFC and HPLC Chiral column: Enantiopak OD. Mobile phase: CO2-EtOH (90: 10, v/v); flow rate: 2.5 mL/min; photodiode array detector for SFC-UV. Mobile phase: Hex-EtOH (98: 2, v/v); flow rate: 1.0 mL/min; ultraviolet detector for HPLC-UV. Mobile phase: Hex-EtOH (98: 2, v/v); flow rate: 1.0 mL/min; optical rotatory detector for HPLC-ORD.

在本文中叶菌唑的对映体与手性选择剂三(3,5-二甲苯氨基甲酰化)纤维素间的相互作用(如氢键、 π - π 作用等)受到流动相条件改变的影响,手性固定相与手性异构体间的识别和结合能力不同,故其在SFC和HPLC上表现出不同的洗脱顺序。同时,还采用旋光检测器对叶菌唑对映异构体的洗脱顺序进行研究,确定异构体间的对应关系。

本文分别采用SFC和HPLC研究了24种手性化合物在涂覆型多糖手性柱上的分离,对比了分离结果的差异。化合物H1～H10在SFC上的洗脱快于HPLC。对轴手性化合物(H11～H14),HPLC表现出更好的分离性能,这可能与其极性较小、在正己烷中具有更好的溶解性有关。SFC和HPLC分离表现了一定的互补性,在SFC上较难拆分的化合物在HPLC上得到较好的分离。更有趣的是,在分离叶菌唑时观察到了因流动相体系不同而引起的对映体洗脱顺序反转现象,可能是由于流动相体系的改变影响了手性异构体与手性固定相间的相互作用。