随着生命科学、医学、材料科学等学科的不断发展,液相色谱作为一种高效分离技术已成为这些重要学科研究中必不可少的工具^{[1, 2, 3]}。但因这些研究中获得的样本量都较少,为了适应这种分析需求,液相色谱正朝着一个更加微量化的方向发展,即毛细管液相色谱(capLC)。科研人员要求高效快速地对样本进行分析的同时,越来越追求绿色化学,即尽可能地减少毒性流动相的使用量。

液相色谱微量化的研究可追溯到20世纪80年代^{[4, 5, 6]},但由于检测手段的限制,微量样本无法检测,导致这项研究没有取得显著进展。目前,随着蛋白质组学等新兴生命学科的发展,微量样本的分离分析越来越重要。并且由于质谱检测器的发展解决了检测灵敏度的问题,使得液相色谱系统的微量化受到了广泛关注,而毛细管色谱柱作为微量色谱系统分离分析的“心脏”,成为学者们研究的重点。

毛细管色谱柱可以分为填充毛细管色谱柱、整体毛细管色谱柱以及开管毛细管色谱柱。填充毛细管色谱柱是目前最常用的毛细管色谱柱^[7],可供选择的商品化填料较多,并且其分离机理较清楚。但它在使用时压力较高,通过增加柱长的方法进一步提高分离效果比较困难。另外,柱塞处容易产生气泡,重复性较差。

整体毛细管色谱柱的出现解决了填充柱柱塞效应以及装填重复性差的问题,近20年来已成为研究者们研究的热点^[8],已有商品化的整体柱问世。整体毛细管色谱柱根据其合成材料可分为有机聚合物整体柱和硅胶基质整体柱两大类^[7]。有机聚合物整体柱适用的pH范围宽,但机械性能差,受热易变形;硅胶基质整体柱的机械性能和热稳定性较好,但适用的pH范围较窄。整体毛细管色谱柱在蛋白质组学研究中的应用报道较多^{[9, 10, 11]},在应用过程中系统压力较填充柱有所改善,但进一步增加柱长来提高柱效还存在压力高的问题。

开管毛细管色谱柱是指在毛细管内壁键合或涂覆一层固定相的色谱柱,最早出现在气相色谱的应用中。随着开管毛细管色谱柱理论的不断完善,其实际应用也得到了迅速发展^{[12, 13]},在毛细管电色谱(CEC)、毛细管区带电泳(CZE)、液相色谱(LC)、固相微萃取(SPE)等领域应用广泛,几乎取代了填充柱在气相色谱中的应用。另外,开管毛细管色谱柱还有通过固定酶作为蛋白质酶切反应器等多种应用。本文针对开管毛细管色谱柱在液相色谱中的制备和应用进行综述。

开管毛细管色谱柱解决了填充柱存在的柱塞效应和焦耳热效应的问题,其理论上最显著的优点就是使用时比填充柱和整体柱的反向压力低^[12]。1958年,Golay^[14]首先将开管毛细管柱应用于气相色谱中,并提出了Golay方程。该方程指出,由于毛细管柱是空心的,只有一个流路,因此不存在涡流扩散,而涡流扩散效应是导致色谱峰展宽的一个重要原因。

与开管毛细管气相色谱(OT-GC)中所用的色谱柱相比,用于开管毛细管液相色谱(OT-LC)中的色谱柱内径要减小至原来的10^-2~10^-3才能获得较高的柱效,这是由于毛细管内径的减小最大限度地减小了流动相和固定相之间的扩散系数。Guiochon^[15]指出OT-LC柱内径不能大于填充柱内固定相粒径的两倍。基于此项研究,学者们纷纷尝试制备内径为5~10 μm的OT-LC柱。然而,为了最大化地提高分离效率以及峰容量,必须增加开管柱的长度,这就导致了反向压力的显著提高。因此,在实际应用中,研究者也通常会采用稍大内径的毛细管进行制备,通常可将内径扩展至25~100 μm。

由于OT-GC柱减小了样品的扩散和稀释,使得其在分离效率方面具有明显的优势。尤其是在检测灵敏度方面的提高,使得分离分析微量样本成为可能,这就使其在蛋白质组学、法医学、生物分离工程等领域中的应用具有巨大的优势。另外,毛细管液相色谱中使用的开管毛细管色谱柱内径小,溶剂消耗少,这也符合绿色化学的要求,值得重视和发展。

OT-LC柱的制备方法主要有物理涂覆法和化学键合法。

物理涂覆法是通过疏水作用、静电吸引吸附等作用使含有不同基团的物质被涂覆到毛细管内壁上的方法。通过物理涂覆固定相制作开管毛细管色谱柱制备简单,但其涂覆的固定相易脱落、不稳定,色谱柱寿命较短,并且在制备和使用过程中堵塞的可能性很大。因此制备此种OT-LC柱大多选用较大内径(通常为75 μm)的毛细管,一方面是为了降低使用时的压力,不至于导致涂层脱落;另一方面可防止毛细管柱堵塞。Dasgupta等^[16]通过在毛细管上交替涂覆壳聚糖和戊二醛制作了一种多层阴离子交换OT-LC柱。在4.5 m×75 μm的毛细管内壁连续涂覆24层后,可有效分离一些常见的阴离子(F^-、Cl^-、NO₂^-、Br^-和NO₃^-),其柱效平均可达12 000理论塔板/m。Kubáň等^{[17, 18]}也选择了内径为75 μm的毛细管,通过涂覆丁二烯-马来酸共聚物(PBMA)制备了阳离子交换OT-LC柱,开发了一种重量轻、能量低、成本低的便携式离子交换OT-LC系统。它采用的是流体动力学的进样模式以及重力驱动的洗脱方法,因此不需要泵输送洗脱液,也不需要进样系统。这种OT-LC系统可以快速分离碱金属离子(Na⁺、K⁺、Cs⁺、Ca²⁺、Mg²⁺等)和过渡金属离子,使用弱络合作用有机酸的低电导率洗脱液和无接触的电容检测可以同时分离一价和二价阳离子。

Qu等^[19]也选用内径为75 μm的毛细管制作OT-LC柱,通过氨基与二氧化硅粒子之间强烈的静电吸附作用将二氧化硅纳米粒子涂覆在毛细管内壁。实验表明,这种OT-LC柱的保留因子和分离度都随着涂层数的增加而显著增加,重现性良好。使用3次涂层的开管毛细管色谱柱分离芳香族化合物的柱效高达269 280理论塔板/m。这种方法还被用于分离蛋清蛋白质,酸性和碱性蛋白质均能在一次分析中得到很好的分离。

与以上方法不同的是,Wang等^[20]选用内径为1.5 μm的极细毛细管进行开管毛细管色谱柱的制作。通过在毛细管内壁涂覆羟丙基纤维素,使该开管柱具有多种色谱行为,包括流体动力色谱、分子排阻色谱以及离子交换色谱等色谱行为。使用这种毛细管色谱柱成功分离了fmol~pmol水平的转铁蛋白、γ-乳清蛋白、胰岛素以及γ-2巨球蛋白4种蛋白质的混合样品。该毛细管色谱柱的柱效可达1 000 000理论塔板/m。一个完整色谱分析过程产生的废液仅为μL级。

Tsukagoshi研究团队^{[21, 22, 23, 24, 25, 26]}在毛细管液相色谱的基础上提出了管径向分布色谱(TRDC)的概念。TRDC中通常使用表面涂覆聚乙烯、聚四氟乙烯或苯基硼酸等的内径为50~250 μm的开管毛细管色谱柱或直接使用石英毛细管。其分离原理是根据三元洗脱液(水-亲水/疏水-有机溶剂)在毛细管内部径向分布性质的不同,使混合物得到分离。通过调整三元洗脱液的组成,成功分离了铜(Ⅱ)和血红素^[21]、1-萘酚和2,6-萘二磺酸^{[22, 23]}。在生物大分子(氨基酸、肽段、蛋白质)的分离中也有应用^{[24, 25]}。但该系统在使用过程中,流动相在毛细管色谱柱中会形成抛物线形的流速分布,从而导致条带展宽以及分离度降低。由于TRDC操作简单,整个系统价廉易构建,只需要改变三元洗脱液就可以达到理想的分离效果,因此可以作为已知样本常规分析的一种廉价的分离工具。

化学键合法是通过共价键的方式将固定相连接到毛细管内壁上的方法。用这种方法制备的OT-LC柱从结构上可以分为两种类型:多孔层开管毛细管(PLOT)色谱柱和非多孔层开管毛细管色谱柱。与物理涂覆固定相相比,化学键合固定相具有更高的稳定性及更长的使用寿命。由于非多孔层开管毛细管色谱柱固定相的孔隙率及负载量都比较低,难以取得很好的分离效果,因此在毛细管液相色谱中的应用受到了很大限制。本文主要对多孔层开管毛细管色谱柱进行综述。

硅胶基质制作整体柱的制备方法较为成熟,有多篇文章^{[27, 28]}对其进展进行了综述,但目前该方法用于开管毛细管色谱柱制备的研究还不多,实际应用也较少。硅胶的多孔层结构具有很多优势,如表面积大、机械强度高以及在溶剂中表现出优越的抗溶胀和收缩的性质等,硅胶多孔层开管毛细管色谱柱可以达到较高的柱效,但其适用的流动相pH范围较窄(通常为pH 2~8)。Tock等^[29]使用乙氧基硅烷预凝胶制备了硅胶多孔层OT-LC柱,但合成的固定相孔隙率较低,色谱柱的负载量很低。Colón等^{[30, 31, 32, 33]}通过溶胶-凝胶法制备了反相C8开管毛细管色谱柱,在液相色谱及毛细管电色谱的应用中都取得了很好的效果,0.5 m×13 μm是OT-LC柱的柱效达到了204 000~285 000理论塔板/m。

近年来,Forster等^[34]考察了溶胶-凝胶法制备开管毛细管色谱柱的过程中毛细管内径大小对制备结果的影响。对比了内径为15、50和100 μm的毛细管制备的硅胶多孔层开管毛细管色谱柱内多聚层的均匀性。通过扫描电子显微镜观察发现:由于重力的影响,内径50和100 μm的毛细管制备的开管柱内大部分聚合反应物都聚集在毛细管的下侧,不能形成均匀的多聚层;内径为15 μm的毛细管制备的开管毛细管色谱柱的多聚层厚度约为500 nm,能均匀分布在毛细管内壁上。将制备的3 m×15 μm OT-LC柱用于苯甲醚同分异构体的分离,取得了很好的分离效果,柱效达到了170 000理论塔板/m。

在毛细管液相色谱中,聚合物多孔层开管毛细管色谱柱在化学键合型开管毛细管色谱柱中占了很大的比重。这种类型的开管毛细管色谱柱结构类似于聚合物整体柱,因此其制备的化学原理及操作条件都比较成熟。可通过调整多聚层的厚度、孔径大小及表面键合基团的化学性质制作用于不同类型色谱分析的开管毛细管色谱柱。聚合物固定相的化学稳定性很好,适用的pH范围较宽,可用于高温条件下的分离。

开管毛细管色谱柱制备过程中,毛细管的内径大小对开管柱制备的成功率有很大的影响,随着毛细管内径的增加,其多孔层的结构越来越难以形成。然而若毛细管内径减小,保持开管毛细管色谱柱内多聚层具有一定的孔隙率又成了一大难题。Nischang等^[35]阐述了毛细管内径对聚合作用的影响。实验发现,表面积/体积比大的毛细管(如内径较大的毛细管)易于多聚物在其密闭的空间中聚合,制备成多聚物整体柱;而内径较小的毛细管,多聚物则易在毛细管内壁形成一层多聚物层。这与Forster等^[34]的研究结果相符合。因此,在制作聚合物多孔层开管毛细管色谱柱时,通常采用较小内径的石英毛细管。

Karger团队^{[36, 37, 38, 39, 40, 41]}在超痕量蛋白质分离分析中开管毛细管色谱柱的研究方面做出了很大的贡献,制备了一种聚合物开管毛细管色谱柱并用于蛋白质的液相色谱和质谱联用分析^{[36, 37]}。选择内径为10 μm的石英毛细管,采用热引发的原位聚合法在毛细管内壁键合了聚(苯乙烯-二乙烯基苯)(PS-DVB)的聚合物多聚层。经扫描电子显微镜检测,多聚层厚度为0.5~1 μm。色谱柱表现为反相色谱分离机制,并且具有较高的负载量,在4.2 m长的PLOT中可以负载约100 fmol的血管紧张素I或约50 fmol的胰岛素。具有很高的检测灵敏度,可以分离800 amol的牛血清白蛋白(BSA)酶切肽段样本,在分析人表皮生长因子受体时可以达到25 fmol的检测水平。将PS-DVB多孔层开管毛细管色谱柱应用于乙酸甲烷八叠球菌提取蛋白质的液相色谱-质谱联用分析中,可以检测到3 046条肽段,覆盖566个蛋白质,达到了很好的分析效果^[36]。该团队^[37]更换聚合物层为聚(氯甲基乙烯基苯-二乙烯基苯),通过乙二胺与氯的反应,制备了氨基键合的亲水作用多孔层开管毛细管色谱柱(HILIC-PLOT)。使用右旋糖酐阶梯标准品评价2.5 m×10 μm HILIC-PLOT柱,从50 fmol的样品中可以检测到22个单体聚合的葡聚糖。从3 ng PNGase F (peptide-N-glycosidase F)酶切的卵清蛋白中鉴定到了28个N-糖,说明该开管毛细管色谱柱具有很高的分离度^[37]。

另外,Karger团队^{[38, 39, 40, 41]}研制的PS-DVB开管毛细管色谱柱,不仅在单独应用时表现出了很好的性能,在与其他色谱联用时也表现出了很好的性能。将3.2 m×10 μm PS-DVB开管柱应用于宫颈癌细胞(SiHa细胞)的在线一维和二维PLOT/LC-MS蛋白质分析中,从45 ng蛋白质样品中鉴定到638个肽段,归属于343个蛋白质^[38]。而传统的15 cm×75 μm填充柱用于约750 ng蛋白质样品鉴定时只鉴定到了338个肽段,归属于231个蛋白质^[38]。这些结果表明该开管毛细管色谱柱分离效果好且灵敏度高。他们^[39]还将3.2 m×10 μm PS-DVB开管毛细管色谱柱与在线脱盐三相系统(反相/强阳离子交换/固相微萃取)联用,大大减少了样品预处理的步骤,缩短了样品分析时间,达到了快速分析的目的。Rogeberg等^[42]进一步将PS-DVB开管毛细管色谱柱用于完整蛋白质的分离分析中。将3 m×10 μm PS-DVB开管毛细管色谱柱连到LC-MS系统中,采用梯度洗脱分离标准蛋白质,得到了对称性良好的色谱峰,并且有很好的重复性,同一色谱柱不同分析次数及不同色谱柱分析同一样品间保留时间的相对标准偏差分别低于0.6%和2.5%。这种开管毛细管色谱柱在脱脂牛奶蛋白质的分析中也取得了良好的分离效果。但PS-DVB开管毛细管色谱柱使用时反向压力高,流速仅为20 nL/min时压力即高达2×10⁷ Pa。

光引发自由基聚合也是常用的制作开管毛细管色谱柱的方法。Paull团队^{[43, 44, 45]}通过光引发的聚合反应分别制备了0.27 m×50 μm甲基丙烯酸缩水甘油酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚(GMA-co-EDMA)开管毛细管色谱柱和0.3 m×100 μm甲基丙烯酸丁酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚(BuMA-co-EDMA)开管毛细管色谱柱。使用365 nm紫外发光二极管(LED)灯,采用渐逝光波技术,在外壁涂有聚四氟乙烯涂层的毛细管内壁引发了均匀的聚合反应,克服了由于入射光差异造成的聚合物不均匀的缺点,其多聚层厚度的RSD值小于5%。这种开管毛细管色谱柱在蛋白质混合物的液相色谱分离分析中取得了很好的分离效果。值得注意的是,这项研究表明在低压条件下使用内径较大(50~100 μm)的开管毛细管色谱柱在液相色谱分离中同样可以取得很好的分离效率。在使用这种毛细管色谱柱进行分离时,流速为400 nL/min,压力小于1.5 MPa。

Hearn等^[46]制备了一种以分子印迹聚合物为多孔层的开管毛细管(MIP-PLOT)色谱柱,将其用于毛细管液相色谱中手性化合物的分离。作者以非甾体抗炎药S-酮洛芬为模板,以4-乙烯基吡啶为单体,以乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,在385 nm紫外光引发下进行多聚物合成,制作了0.6 m×50 μm MIP-PLOT色谱柱。这种开管毛细管色谱柱通过分子自组装方式以非手性聚合物前体建立了一个对对映异构体具有选择性的纳米腔,使其适用于手性分离,在复杂的或外消旋的化学及生物样本手性物质分离中更具优势。

Kubo等^[47]通过将C₆₀-富勒烯以共价键方式结合在毛细管内壁上制备了一种新型的OT-LC柱。这种开管毛细管色谱柱的分离机制是基于C₆₀-富勒烯的π-π堆叠,对多环芳烃有很好的分离效果。制备的0.2 m×25 μm液相色谱柱可以在3 min内将菲、苯并菲、苯并[a]芘完全分离。以上这些工作表明,可以尝试将其他领域成熟的合成技术手段移植到开管毛细管色谱柱的制备中,使开管毛细管色谱柱得到全面的发展。

随着“蛋白质组”概念的提出,各国科学家纷纷致力于通过研究蛋白质表达谱、修饰谱和动态变化揭示生命活动的规律以及疾病发生的机制,从而为疾病早期诊断治疗提供生物标记物和潜在的药物靶标^[48]。适用于微量样本分析的毛细管液相色谱在蛋白质组学研究中起到了关键作用。

近年来,毛细管液相色谱被广泛用于蛋白质组学的研究中。由于开管毛细管色谱柱具有较低的反向压力,可采用更长的色谱柱对复杂生物样本进行高效分离,因而开管毛细管色谱柱被越来越多地应用到了这一领域中。Luo等^{[36, 37]}将PS-DVB开管毛细管色谱柱用于蛋白质酶切肽段和糖蛋白的液相色谱和质谱联用的分离鉴定中,实现了蛋白质的超痕量分析,最低可以分离800 amol BSA酶切肽段。他们还将PS-DVB开管毛细管色谱柱用于在线一维和二维的PLOT/LC-MS蛋白质分析中,提高了分离效率^[38];进一步将PS-DVB开管毛细管色谱柱与在线脱盐三相系统(反相-强阳离子交换-固相微萃取)联用,大大减少了样品预处理的步骤,缩短了样品分析时间,从而达到了快速分析的目的^[39]。这些应用结果表明开管毛细管色谱柱在实现微量样本分离分析的同时,还可以简化样品前处理的过程,为实现蛋白质组学大规模高通量的分析提供了技术支持。

另外,如前所述,Wang等^[20]制备了一种极细(1.5 μm)混合模式开管毛细管色谱柱，具有流体动力色谱、分子排阻色谱以及离子交换色谱三种色谱分离模式，在整体蛋白的液相色谱分离中表现出优良的分离效果，成功分离了4种整体蛋白混合物。Paull等^[44]还将制备的GMA-co-EDMA开管毛细管色谱柱用于蛋白质混合物的分离,成功分离了胰岛素、胰蛋白酶、核糖核酸酶、细胞色素C、碳酸酐酶等10种蛋白质混合物。Rogeberg等^[42]进一步将PS-DVB开管毛细管色谱柱用于完整蛋白质的分离分析中,分离得到了脱脂牛奶中的低丰度蛋白质。这些研究表明了开管毛细管色谱柱在整体蛋白质组学研究中有着巨大的应用潜力。

生物医学领域对分析微量样本的需求越来越强烈,随着质谱检测灵敏度的不断提高,适用于微量样本分析的液相色谱系统显得越发重要。毛细管色谱柱作为毛细管液相色谱系统的核心受到更多关注,而开管毛细管色谱柱以其独特的优势,得到更多研究人员的重视。虽然不同材料、不同内径的开管毛细管色谱柱研究的报道不断出现,但遗憾的是目前的研究大多停留在实验室中,没有更多商品化的开管毛细管色谱柱问世,限制了其在很多领域的应用。目前液相色谱中的应用很难达到在气相色谱及毛细管电色谱中的发展水平,其中最主要的问题是洗脱液在毛细管中呈抛物线形流动,通常的解决方案是使用极细内径的毛细管制作开管柱,可获得出色的分离效果和峰容量。但由此也造成制备过程中毛细管堵塞及使用中反向压力过大的问题。尽管如此,研究人员将多孔层开管毛细管柱用于蛋白质样品的LC-MS或LC-MS/MS分析,仍取得了出色的分离效果。因此有理由相信,通过不断创新和改善制作方法,开管毛细管色谱柱的研发必将使微量液相色谱在生命科学等领域的研究中发挥更大的作用。