在筛选适配体的SELEX过程中,高效、快速地分离与靶标结合的单链核酸是提高筛选效率的关键一步。其分离过程通常需要预先固定靶标或单链核酸库,也有非固定的直接分离法。

可将靶标通过物理吸附、化学共价交联以及生物素-亲和素特异性相互作用等方式固定在微珠/磁珠、微孔板及亲和层析柱等固相基质上。与核酸库孵育后,去除未结合核酸,再通过淋洗溶液洗脱固相基质上的结合核酸,实现靶标核酸复合物与未结合或弱结合核酸的分离。

微珠/磁珠是应用最广泛的固定靶标的固相基质。根据靶标性质,可选择不同的亲和标签、亲和树脂以及耦合化学反应使其固定在基质上。通过孵育条件、洗脱条件优化获得与靶标高亲和力结合的核酸。该方法的局限性是固定相上靶标的密度影响核酸结合。高密度固定的靶标分子间存在的多重弱相互作用将产生协同效应,使靶标之间产生结合作用,故会降低每轮筛选中适配体的富集效率,使后续的筛选不能达到满意的效果^[16]。Huang等^[17]在筛选C反应蛋白(CRP)的核酸适配体时,将CRP与直径为4.5 nm的聚苯乙烯磁珠共同孵育,使磁珠表面吸附CRP分子。这种方法操作简单,但可能会封闭靶标的某些结合位点。鉴于此,又发展了通过化学反应共价交联固定靶标的方法。Gong等^[18]为了筛选能够识别同一蛋白质上不同结合位点的核酸适配体,同时采用了化学共价交联和亲和素-生物素特异性结合两种固定方法。在亲和结合部分,以整合蛋白αVβ3为靶标,在交联剂EDC和NHS的作用下将其通过化学反应共价交联在羧基化的磁珠表面进行筛选。在特异性结合部分,选取一种与αVβ3同样有一个β3位点的αⅡbβ3蛋白作为“诱饵”蛋白质,通过生物素化处理,使其与链霉亲和素修饰的磁珠通过亲和作用固定在磁珠上。另一种模式是靶标与随机库孵育后,通过亲和树脂捕获靶标核酸复合物,此法需要高容量的亲和树脂以保证捕获效率。但该筛选模式也会因核酸与亲和树脂的非特异性结合使筛选效率降低^[19]。

将靶标直接固定在微柱内,或将交联了靶标的琼脂糖凝胶或亲和层析树脂填充在微柱中,制成含有靶标的亲和层析柱。该亲和柱可吸附靶标结合的核酸,与未结合或弱结合的核酸分离。微柱SELEX法可将亲和树脂及核酸库用量最小化,使非特异性结合分离的死体积达到最小值^[18]。目前的96通道微型柱装置(micro-platebased enrichment device used for the selection of aptamers,MEDUS),可与96孔板匹配,进行高通量的样品处理^[20]。常规固定法中高密度的靶标拥挤会阻碍适配体与其作用,而微柱法则降低了靶标在柱中的密度,更易获得高亲和力的适配体。应用该方法筛选了解离常数为nmol/L级的热休克因子1、2(HSF1、HSF2)^[19],及转录延伸因子E(NELF-E)的适配体^[21]。

RAPID SELEX方法结合了Non-SELEX原理^[22]和微柱固定靶标方法。直接进行连续两轮的微柱分离,中间不进行次级库的逆转录、PCR扩增与转录。常规的SELEX,蛋白酶体磷酸酶UBLCP1与细胞周期检查点激酶2(CHK2)两种靶标的RNA适配体筛选需进行6轮,每次分离后都需进行次级库的扩增。而运用RAPID方法,6轮筛选过程中仅需进行3次扩增步骤,整体筛选周期从355 h降低到84 h。且两种方法筛选出的5条性能最好的适配体,其序列具有一致性。

在芯片微流通道中填充磁珠介质,通过微流控芯片进行靶标-核酸复合物与未结合或弱结合核酸的分离。将磁珠法与微流控筛选(M-SELEX)结合,即微磁性分离法(MMS),可将磁力捕获装置微型化,使整个分离过程在微流通道中进行。目前,已经通过微磁性分离法,筛选获得K_d为纳摩尔级的A型肉毒菌神经毒素与血小板衍生生长因子(PDGF-BB)核酸适配体^{[23, 24, 25]},以及解离常数分别为0.028与0.33 nmol/L的高亲和力的PDGF-BB与凝血酶适配体^[26]。也有报道将C反应蛋白(CRP)^[17]与甲胎蛋白(AFP)^[27]靶标偶联在磁珠上,利用微流控芯片的连续流体和磁性分离进行适配体筛选。这种微型化组合集成了磁分离、微泵、微混合器以及酶促反应扩增温度控制系统,还成功用于复合靶标流感病毒A/H1N1的适配体筛选^[28]。通过有效处理磁珠及控制流体流动,可对肉毒神经毒素A轻链^[29]、链霉亲和素^[30]、PDGF-BB、凝血酶、与载脂蛋白E3^[26]等多种靶标进行1～3轮的快速筛选,获得解离常数为低纳摩尔级的适配体。

也可将经过特殊加工的具有纳米孔结构的溶胶-凝胶材料作为分离介质。由于溶胶-凝胶能保持生物分子的活性并能提高生物分子的稳定性,与磁珠和亲和层析柱固定法相比,它也不需要任何修饰,因此这种包埋固定靶标的方法更为简单。利用其固定靶标,结合芯片快速分离,可有效提高筛选效率,减少筛选轮数。Ahn等^[31]利用纳米孔溶胶-凝胶阵列芯片固定酵母TATA结合蛋白及其同源蛋白质,实现了多靶标RNA核酸适配体的同时筛选。该芯片由5个六边形小室和通道组成,分别在芯片的每个小室的溶胶-凝胶液滴内固定不同的靶标,当RNA随机库通入芯片时,能与靶标结合的RNA会进入该溶胶-凝胶液滴内,而未与靶标结合的RNA则流出通道,借此直接分离靶标核酸复合物与未结合核酸。

金纳米颗粒(AuNPs)具有优良的电子和化学特性,其物理特性与其尺寸和形态相关,且容易修饰上小分子或生物大分子,成为功能化金纳米颗粒。目前它广泛应用于化学生物传感、诊断成像及癌症诊断与治疗等领域^[32]。AuNPs的生物功能化是通过巯基、磷酸基及氨基修饰来实现,利用金-巯键是最常用的功能化方式。Takahashi等^[33]为了筛选出能抑制β淀粉样蛋白(Aβ)聚集的RNA核酸适配体,利用AuNPs与半胱氨酸形成的金巯键将靶标Aβ固定在AuNPs的表面,筛选获得N2-Flu(K_d=21.6 μmol/L)与E2-Flu(K_d=10.9 μmol/L)两条适配体。

将靶标固定在膜(如硝酸纤维素膜)上,可分离核酸的结合链与未结合链。Tsukakoshi等^[34]发展了一种基于硝酸纤维素膜固定靶标竞争筛选核酸适配体的方法。先在同一块硝酸纤维素膜的3个不同区域固定3种蛋白质,同时达到反筛的目的。将同时固定了核突触蛋白(α-syn)的单体、低聚物及纤维3种形态的硝酸纤维素膜与随机库一起孵育。然后将固定了α-syn低聚物的硝酸纤维素膜部分裁剪下来,从膜上分离提取出与α-syn低聚物结合的DNA链。Liu等^[35]选用聚偏氟乙烯膜(PVDF),通过电镀印迹法在一张PVDF膜上固定人乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcAg)作为正筛单元,而在另一块PVDF膜上固定血清蛋白作为反筛单元。将随机库与两块PVDF膜同时孵育,多次冲洗并移除反筛的PVDF膜,可直接除去不与HBcAg结合的链;然后,再结合DNase I降解以及浓度梯度的尿素缓冲液冲洗,可有效除去与HBcAg不结合或结合较弱的链,使结合在正筛的PVDF膜上的DNA分子数从10¹⁶降到10⁴。这样只经过一轮筛选就获得K_d值为pmol/L级的核酸适配体。

在碱性条件下,硼酸基团能与邻二羟基结构作用,生成稳定的五元环络合物,酸性条件下络合被打开,这一特性赋予了硼酸类亲和色谱材料富集提取含有顺二羟基结构的各类生物分子的能力。将硼酸作为亲和色谱配基固定在毛细管上,形成硼酸亲和毛细管整体柱,可通过调节pH,控制可逆的共价结合,捕获或释放含有cis-diol官能团的组分^[36],实现分析、分离、鉴定核苷、核苷酸、糖、糖蛋白、酶以及小分子混合物的功能。Nie等^[37]提出基于硼酸亲和毛细管整体柱固定糖蛋白筛选核酸适配体的方法。以糖蛋白辣根过氧化物酶(HRP)作为模式蛋白质,调节pH＞7,将HPR共价结合在硼酸亲和毛细管内壁上。随机库通过毛细管后,与HPR结合较强的DNA链被捕获到毛细管内,此时再调节pH＜3,使HRP-DNA复合物从毛细管中释放,并在出样口端收集,得到复合物。

因固定靶标分子会改变其天然的分子构象,故也发展了固定核酸库的分离方法。固相基质(如琼脂糖凝胶、微珠或磁珠)表面修饰了链霉亲和素,将修饰了生物素的单链DNA(ssDNA)序列作为捕获探针,探针上的核酸序列可与核酸库的局部序列互补。当核酸库通过碱基互补与捕获探针杂交后,再通过生物素-链霉亲和反应固定在基质上。在筛选过程中,用含靶标的溶液洗脱固相基质,可将核酸库中与靶标结合强的ssDNA洗脱下来,故洗脱液中含有与靶标结合的ssDNA,进而得到靶蛋白质-核酸复合物。

亲和层析柱固定核酸库的方法被用于以核酸为靶分子的适配体筛选过程中,Raiendran等^[38]以含有链霉亲和素修饰的琼脂糖凝胶作为填料,制成亲和层析柱后用于固定核酸库,发展了一种通用的直接筛选核酸适配体分子信标的方法。所用的捕获探针上标记了猝灭基团,当荧光标记的核酸库通过捕获探针固定在亲和柱上,荧光发生猝灭。用核酸作为靶分子对固定的核酸库进行洗脱,使捕获探针释放出与靶分子结合的荧光标记DNA,因此检测到荧光强度明显增加。他们通过9轮筛选得到了与靶分子相互作用的适配体,进而也可将此种方法推广到非核酸靶分子筛选中。

将微珠进行链霉亲和素修饰,修饰后的微珠与带有生物素化基团的捕获探针特异性结合,核酸库通过与捕获探针互补固定在微珠或磁珠上,与靶标结合后就可通过离心或磁分离的方法快速分离未与靶标结合的DNA链。Nutiu等^[39]将巧妙设计的核酸库固定在亲和素包被的微珠上。与常规筛选所用的核酸库不同,该核酸库总长为91 nt,其中,两端分别是21 nt的引物序列,中间是一段19 nt的固定序列,在两端的引物序列与中间的固定序列之间还分别设计了10 nt和20 nt的随机序列区。总长19 nt的固定序列包含4 nt的延长序列和15 nt的与捕获探针互补的序列。生物素化的捕获探针能够与微珠或磁珠上的亲和素特异性结合。加入靶标神经生长刺激肽(NTPs)与磁珠固定的核酸库孵育,与NTPs结合较强的序列由双链结构转变为NTPs-DNA复合物结构,从微珠上脱落;而结合较弱或不结合的DNA链则保留在微珠上,实现结合与未结合DNA链的分离。因在引物和互补短链上分别标记了荧光基团和猝灭基团,因此该筛选方法还可作为检测方法,无需再对筛选的核酸适配体进行后续的序列设计和优化。Oh等^[40]以凝血酶为靶标,将在两段随机序列间的固定序列设计成一段可形成G-四链体结构的序列。凝血酶存在时,将随机库的DNA链从磁珠上竞争下来,此时中间的固定序列会形成可以嵌入NMOL/LM染料的G-四链体结构,并在波长614 nmol/L处产生极强的荧光,从而将凝血酶与DNA链的结合转化为因结构变化引起的荧光信号变化,形成自报告探针。

微粒展示法多用于同源蛋白质的多重靶分子交替筛选。SELEX过程中需结合微乳液PCR技术及流式细胞仪进行筛选^[41]。首先需将固定于微球上的核酸库(固定方法同1.2.2节)与荧光标记的蛋白质靶标共孵育,然后利用流式细胞仪分选与荧光标记蛋白质结合的随机序列微球。再通过微乳液PCR技术对每个微球的随机序列扩增(扩增倍数为10⁵)。利用此方法,3个循环筛选得到凝血酶^[42]、载脂蛋白E (ApoE)、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)^[43]及肿瘤坏死因子受体4-1BB的高亲和力适配体^[44]。另外一种方法是通过微流体系统将随机库在琼脂糖液滴中富集,再用流式细胞仪使寡核苷酸逐个与靶分子相互作用^[45]。Zhang等^[46]通过该方法筛选出K_d=25 nmol/L的络氨酸蛋白磷酸化酶(Shp2 protein)的适配体。因该方法中需通过流式细胞仪逐个筛选与靶分子相互作用的ssDNA,再通过微乳液PCR逐个扩增结合在靶蛋白质上的ssDNA,所以核酸库容量越大(序列越多)时,对流式细胞仪与微流体系统的性能要求越高。所以这种筛选因受现有流式细胞仪分选能力的局限,很难实现大容量核酸库中每个ssDNA的分选。微乳液PCR也很难实现单滴微乳中每个ssDNA的扩增或流式细胞仪分选,进而导致核酸库不能被全部利用。目前方法还未用于RNA适配体的筛选。如果可在微乳液中进行体外转录,则也可为RNA适配体筛选所用^[47]。

无论固定靶标或核酸库都会影响分子的天然构象。而且,固定基质自身还会参与相互作用,产生非特异性吸附。因此,在筛选过程中不需要固定靶标或者DNA/RNA核酸库的非固定筛选方法更有优势。非固定方法通过靶标与核酸库在溶液中的自然结合,可在溶液相直接分离复合物。因靶标与核酸库的结合、分离过程完全在溶液中进行,故可避免固定靶标或核酸库时发生的分子构象变化,以及被固定分子、基质与核酸结合时的空间位阻影响。

根据靶标分子大小,选择合适孔径的硝酸纤维素膜。利用分子量差异,对靶标的核酸复合物进行超滤分离,通过4～18轮筛选获得适配体。但因硝酸纤维素膜对蛋白质和核酸均有一定的非特异性吸附,故筛选的适配体特异性较差。Gopinath等^[48]对此法进行改进,在每轮筛选前,使RNA随机库通过预先润湿的滤膜,以除去与滤膜非特异性结合的RNA链,筛选出能区别人甲型流感病毒亚型的RNA核酸适配体。这种分离方法使用了超滤膜及离心机,设备简单,分离过程快。但靶蛋白质与随机库耗费量大,而且超滤分离过程容易破坏复合物,导致潜在适配体的丢失。

凝胶电泳是常用的蛋白质和核酸分离方法。因形成的靶标-核酸复合物与游离核酸的分子大小和荷电量相差较大,也可采用凝胶电泳分离。Smith等^[49]利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离法筛选了人嗜中性粒细胞胰蛋白酶E的RNA核酸适配体。Tsukakoshi等^[34]在竞争筛选α-syn低聚物的核酸适配体时,第一轮和第二轮筛选均采用3%的琼脂糖凝胶电泳分离结合α-syn低聚物的DNA链,使结合α-syn低聚物的序列有一定程度的浓缩和富集。

毛细管电泳(CE)也是在自由溶液中分离靶标-核酸复合物,它又是快速、高效筛选核酸适配体的方法之一。因靶标和核酸库分子完全在自由溶液中相互作用,故可保持二者的天然结构,也可以模拟生物分子相互作用的溶液环境。毛细管电泳过程中,未与靶标结合的核酸分子与结合靶标的核酸复合物的迁移速率有明显差异,二者可完全分离,并可在毛细管出口端定时收集复合物。通常,CE-SELEX只需要1～4轮筛选就可获得蛋白质的适配体。有报道通过CE-SELEX方法筛选了蛋白质靶标Ig E^[50]、神经肽Y^[51]、人类免疫缺陷病毒逆转录酶^[52]、蓖麻毒素蛋白^[53]、蛋白激酶C^[54]以及炭疽杆菌保护性抗原^[55]等适配体。CE-SELEX方法可进一步改进为平衡混合物的非平衡毛细管电泳(NECEEM)、平衡混合物的平衡毛细管电泳(ECEEM)及Non-SELEX等系列筛选方法^{[56, 57, 58]}。Non-SELEX方法通过3轮NECEEM分离,但中间不需进行次级库的扩增,就可将随机库与靶蛋白质的亲和力增加4个数量级。用Non-SELEX方法筛选的蛋白质有人原癌基因蛋白、牛过氧化氢酶^[59]、信号转导蛋白如Cdc42-GTP、PAK1、MRCK^[57]等。需注意的是,靶标-适配体复合物与游离核酸的电泳淌度差异还受电泳溶液性质的影响。Non-SELEX方法对离子强度与pH要求严格,而这些条件可能会与SELEX其他步骤的溶液条件发生冲突。此外,由于CE分离的进样体积很小,单次进样的混合物样品量很少,将导致可有效利用的随机库的序列数很少,因此分离的复合物不完全,存在核酸序列缺失的可能,故在每次筛选的重复性上可能会有差异,影响对筛选效果的判断。分离复合物时因受到溶液盐浓度和温度的影响,可能还会因复合物与蛋白质或者游离核酸迁移时间差异太小而难以互相分离。因此,适配体与靶分子的结合条件和复合物与核酸的分离条件可能难以统一,即最优的结合条件与最优的复合物分离条件不一致,导致最终的适配体结合条件较难界定。

氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是新型纳米材料,具有良好的水溶性且表面易修饰。研究发现GO对ssDNA具有较强的吸附能力,而对双链DNA(dsDNA)或结合了靶标的核酸适配体的吸附能力则较弱。Park等^[60]利用GO这一特点成功实现了Nampt蛋白的适配体筛选。将随机核酸随机库与Nampt蛋白孵育后,加入适量的GO吸附未结合Nampt蛋白的游离ssDNA,通过离心可弃去GO-ssDNA沉淀。溶液中则保留了与目标蛋白质结合的ssDNA,它们因构象发生变化不能被GO吸附。经过GO吸附和离心分离,得到Nampt蛋白-核酸复合物。他们通过4轮筛选,获得G35、G40与G55共3条亲和力较高的适配体。

利用微流控芯片上的自由流电泳模式也可实现无固相介质存在下的蛋白质-核酸复合物分离。由于自由流电泳可连续进样,与CE-SELEX方法相比,μFFE能够实现300倍的初始库容量(约10¹⁴个序列)连续进样,所有与核酸序列结合的复合物全部得到分离。仅一轮筛选就可获得解离常数为nmol/L级的Ig E的DNA适配体。尽管μFFE的分辨率明显低于CE-SELEX,但收集蛋白质-核酸复合物时,样品被稀释的程度也远低于CE-SELEX。通常利用μFFE分离时,样品被稀释100倍。而利用CE-SELEX分离,则可能稀释高达6 000倍。故μFFE分离获得的复合物浓度明显高于CE法,CE-SELEX过程中分离的复合物被高倍稀释后,浓度很低^[61]。

随机核酸库通常由化学合成获得,也可以通过基因组DNA设计以及体外转录等途径获得。筛选适配体时需设计合理的核酸库。常规的随机核酸库设计为,序列两端含引物序列,中间一般由20至60个碱基组成。如增加随机序列的长度,将使随机库中核酸分子的结构多样性呈指数级(4n,n为随机序列中的碱基个数)增长。目前,核酸库的设计优化策略主要包括以下4种:(1)对核酸库序列中核糖或碱基部分进行修饰,增加随机序列二级结构多样性、ssDNA的稳定性以及对靶分子的识别能力;(2)减少引物序列,避免引物序列对适配体二级结构形成的干扰,减少引物区域与靶分子的非特异性结合;(3)通过高通量测序分析次级库的序列特征,改变核酸库的合成方案,以增加与靶分子结合的序列或基序;(4)选择镜像核酸库等替代核酸库,避免核酸酶对其降解。

应用最多的核酸库修饰是对核糖和碱基进行基团替换。如核糖2′位进行氟代(2′-fluoro)、氨基化(2′-amino)或者甲基化(2′-omethyl)等修饰。Bompiani等^[62]在2′位氟化的胞嘧啶与尿嘧啶随机库中,通过纤维素膜过滤-SELEX方法筛选获得凝血素即凝血酶前体的高亲和性RNA适配体(R9D-14),通过表面等离子体共振(SPR)方法测定K_d=1.4 nmol/L。Sakai等^[63]对人受磷蛋白(PLN,跨膜蛋白)筛选RNA适配体时,将RNA适配体5′端引物序列中的腺苷在氨基位进行硫代磷酸化修饰,通过Ni³⁺-NTA微球固定靶分子,经13轮筛选获得K_d=11 nmol/L的适配体。

低解离率修饰适配体(slow off-rate modified aptamers,SOMAmers)来自于一种特殊核酸库。将核酸中的胸腺嘧啶或尿嘧啶碱基的5′位用苄基、萘基、色胺基或异丁基等基团取代,以增加随机库的化学多样性和对靶分子的结合能力。目前,已经有上千种蛋白质的SOMAmers被筛选出来用于高通量蛋白质组分析^[64]。

锁核酸(locked nucleic acids,LNAs)含有特殊的核糖-磷酸骨架。因β-D-呋喃核糖的2′-O、4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥而连接成环形。这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型,降低了核糖结构的柔韧性,却增加了磷酸骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸骨架,故其对DNA、RNA有很好的识别能力和亲和力,能够在适配体中形成稳定的茎环结构。且LNA-RNA或LNA-DNA杂交双链结构具有更强的热稳定性以及抑制3′脱氧核苷酸酶的降解作用^[65]。Föster等^[66]将蓖麻毒素A链适配体(RA80.1. d1)二级结构中的茎干区域用连续的LNA代替,形成7个碱基对的双链区域,发现此种LNA修饰的适配体比原适配体对靶分子结合能力更强,同时表现出更高的热稳定性,且可防止核糖核酸酶的降解作用。Ida等^[67]以重组的组氨酸标记的CD73为靶分子进行6轮筛选。筛选应用了限定的预颈环结构库(pre-defined stem-loop library)。该随机库在引物区域前段包含了LNA。在第一、三、六轮筛选后扩增,通过新一代测序技术得到筛选序列的信息,用生物信息学软件进行序列统一,聚类分析,丰富序列对比后获得3个适配体。其中两个具有序列相似性,通过SPR法测得K_d值分别为10 nmol/L与3.5 nmol/L。如将LNA部位去除,则适配体与靶分子的亲和力降低。说明增加引物区域的LNA设计对适配体稳定的二级结构的形成有促进作用,也说明引物区域参与了适配体二级结构的形成。

目前用于筛选的常规核酸库的核酸序列全长为60～100 nt,引物序列为30～32 nt,引物序列约占核酸序列长度的一半。这些引物序列中的碱基可能与随机序列区域或另一端的引物序列中的碱基配对,破坏了序列的天然二级结构,也降低了随机库序列的结构多样性,即降低了核酸库的容量。核酸库容量的降低则可能导致筛选效率的降低。同时,较长的引物序列也可能与靶标产生较强的非特异性结合。而且,较长的引物序列也明显增加核酸库的合成成本,造成浪费。因此,可通过缩短引物序列或取消引物序列对核酸库进行优化。在双RNA库筛选方法中,设计的核酸库的引物序列可自身折叠互补,在引物区形成双链结构,从而使引物序列与靶分子的非特异性结合可能性大大降低。但是,为完成引物序列双链结构的剪切,双RNA库仍需保留7～10个核碱基的保守序列^[68]。而Pan等^[69]报道了无需引物的SELEX方法(primer-free SELEX)。将无引物的单链核酸库用于S100B靶蛋白质的适配体筛选,获得的适配体解离常数介于10^-7～10^-8 mol/L之间。该方法对双RNA库进一步优化,在引物序列与自身的互补序列形成双链结构之后,用内切酶切除双链DNA。使用不同的内切酶可以使随机库在3′末端保留两个C残基,或者不保留核苷酸残基,而在完成一轮筛选之后通过自身桥接寡核苷酸的杂交将次级库再次连接上引物,用于进行PCR扩增。尽管该方法所涉及的酶反应更加复杂,但是为无需引物的SELEX步骤的设计提供了新的途径。该方法已被用于人类免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶适配体的筛选^[70]。

通过对逐轮筛选的次级库进行高通量测序,可获得每轮次级库的序列信息。通过生物信息学分析可分析出次级库中的重复序列,重复序列成为适配体序列的可能性更大。利用测序分析获得的随机序列区域的核苷酸碱基分布规律信息,可以指导核酸库的设计合成,优化随机核酸库序列的组成,增加能与靶分子结合的序列或基序的分布。

此外,初始核酸库应该提供筛选的最佳的起始点。目前常用的初始核酸库的4种碱基处于随机的均衡分布状态。适配体序列中短的基序通常能与靶分子结合,而平均分配的基序增加了序列空间多样性,增加了产生具有结合能力适配体出现的几率。合成的核酸库在实际库容量与结构多样性方面不能达到筛选的需求,高通量测序技术与生物信息学分析能够紧密地监控与优化库的合成。Rachel等^[71]运用CE-SELEX方法结合高通量测序技术,以卵巢癌生物标记物HE4为靶分子通过5轮筛选获得解离常数为390 nmol/L的适配体。分别对每轮筛选所获得的次级库进行高通量测序,通过生物信息学分析发现重复序列的比值从11.8%增至37.7%,验证了SELEX过程中每轮的筛选效率有所增加。

核酸酶可导致核酸适配体序列被降解,修饰核酸适配体可增加其稳定性,但不能完全消除其降解现象。而选择镜像适配体(spiegelmers)库则可避免核酸酶的降解。镜像适配体序列是天然核酸的对映体,由L-核糖核酸或L-2′脱氧核糖核酸构成,spiegelmers具备了适配体的特性但对核酸酶不敏感。利用spiegelmers库筛选适配体时,也需要靶蛋白质的对映异构体。由于合成蛋白质的D-对映体难以实现,因此,利用spiegelmers核酸库筛选的主要是细胞因子与肽类激素等小分子的适配体。如促性腺激素释放激素^[72]以及胃饥饿素^[73]已经筛选出spiegelmers。无论适配体还是spiegelmers,都是通过对靶分子中特定结构域的识别产生相互作用。故可将蛋白质分子的抗原表位作为靶位点,筛选spiegelmers。Purschke等^[74]以葡萄球菌肠毒素B(28 kDa)抗原表位的25个D-氨基酸组成的多肽作为作用区域,筛选出的spiegelmers与D-氨基酸构成的多肽的解离常数为K_d=200 nmol/L,而与完整蛋白质的解离常数为K_d=420 nmol/L; Szeitner等^[75]以肌钙蛋白I的N端扩展区中的多肽分子(含9个氨基酸)的对映体为靶分子,筛选获得解离K_d=3.5 nmol/L与K_d=10.7 nmol/L的spiegelmers。

此外,其他类型的核酸库也可用于性质不同的靶分子的适配体筛选。Feng等^[76]针对乙肝病毒聚合酶筛选适配体。靶标为删节后的重组蛋白mini P,通过Ni²⁺NTA琼脂糖微球固定重组蛋白mini P方法,经3轮筛获得到S6与S9两条适配体。他们所用的随机库为两种上颈环随机序列RNA库(upper stem-randomized RNA pools),其随机序列位于RNA上部茎环结构处。

适配体筛选中将分离得到大量不同的蛋白质-核酸复合物。说明可与蛋白质结合的核酸通常是具有不同碱基序列的一组核酸,该核酸组的序列都对靶蛋白质具有一定的亲和力。而多轮筛选后可获得的核酸序列数大大减少,但这些序列对靶标则具有更高的亲和力和特异性识别。经过多轮筛选后获得的核酸序列需要进行特征分析,以及亲和力和特异性分析,以确定优选的适配体序列及二级/三级结构。对适配体的特征分析通常包括:

(1)适配体序列的同源性分析。利用DNAman等分析软件对测序结果进行同源性比对分析,得到各序列的拷贝数,根据序列的拷贝数选择核酸适配体候选序列。重复数越多的序列,极有可能是与靶标结合较强的序列,说明它们经过多轮反复筛选后仍然得以保留。

(2)适配体的二级结构分析。目前,有多种软件可用于适配体二级结构分析,如MFOLD(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)、Quikfold Web server(http://unafold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Quickfold)以及RNA Structure v3.5/4.6/5.2(http://www.bio-soft.net/rna/RNAstructure.htm)等可进行核酸二级结构与功能的预测。

(3)确定可与蛋白质靶标作用的最短序列的适配体。通过适配体二级结构分析,可合成各种保持了结合功能的更短序列,并检测其与蛋白质靶标的结合能力。选择亲和力和特异性最优的最短核酸序列,以节约合成成本。

核酸适配体通常以一定的空间构象及二级/三级结构与靶标作用。一般认为在核酸序列中没有形成碱基互补配对的位点是与靶分子特异性相互作用的关键位点,而适配体中形成的稳定二级结构的区域则是与蛋白质靶标的空间结构相互作用的识别性元件^[77,78]。一些筛选的适配体自身呈现出无二级结构的自由形态,但与蛋白质靶标结合后则能够形成稳定的二级结构^{[77, 79, 80]}。蛋白质靶标的单个适配体中,一般仅有一种或两种结构区域,出现频率最高的为发夹结构、假结(pseudoknots)以及G-四链体。其中,发夹结构是最普遍的适配体识别的结构元件。而假结通过发夹环序列左右两侧的配对作用产生,是RNA适配体的典型特征,在DNA适配体中也有发现^{[78, 80, 81]}。G-四链体比前述两种单一的二级结构具有更强的稳定性,是典型的DNA适配体结构,在RNA适配体中也有发现^{[82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90]}。G-四链体中不同核苷酸形成的环结结构是蛋白质靶分子识别的基础。

由于蛋白质靶能为适配体提供更大的相互作用区域,其与适配体结合的亲和力明显高于与小分子的作用,蛋白质结合适配体的解离常数为10^-11～10^-9 mol/L,高出小分子的解离常数(通常为10^-5～10^-7 mol/L^[91])2～4个数量级。

具有一定亲和力的适配体与蛋白质靶标结合时还需考虑结合的特异性。适配体与靶蛋白质的作用强弱取决于二者的结合位点。因不同蛋白质具有的空间结构的可变区不同,若适配体结合在蛋白质的空间结构可变区域,其特异性将比其结合在保守区域更强。适配体的特异性还与其亲和力相关,亲和力越高的适配体,其与蛋白质靶标的结合能力越强,蛋白质分子表面的空间构象的改变都可能影响适配体的特异性,使特异性降低。此外,蛋白质的同源程度也对适配体特异性也有一定影响,这种影响还因蛋白质而异。如HIV-1病毒的马达蛋白的适配体能够识别HIV-2病毒的马达蛋白,亲和力是HIV-1病毒的马达蛋白的65%^[92]。而蛋白激酶C的适配体与其同源蛋白质的亲和力仅为蛋白激酶C的4%^[93]。经过定点突变的凝血酶^[94]、HIV-1病毒逆转录酶^[64]、丙型肝炎病毒复制酶^[23],这些突变蛋白质与适配体的复合物的解离常数较未突变蛋白相比,均提高了1～2个数量级。

不同靶蛋白质的同源蛋白质与其适配体的亲和力有较大差异。据此可推测这些适配体可能通过与蛋白质靶上的某些单个氨基酸的相互作用进行蛋白质的识别。而这个与适配体相互作用的氨基酸可能存在于蛋白质的同源区域也可能存在于蛋白质的非同源区域。而且,适配体对靶蛋白质的同源蛋白质的亲和性还与适配体的筛选方法有关。因此,在适配体筛选过程中,可根据特异性需要对筛选步骤进行优化。不同蛋白质适配体筛选的需求和目的不同。有时,并非一个蛋白质对应一个适配体。行使相同功能的蛋白质家族(仅有一个或者几个氨基酸的差异,这种差异可能与蛋白质功能无关),如要筛选的适配体是能够作用于其功能结构域的,即同一家族蛋白质的功能一样,功能结构域也相同,则所筛选的适配体不需要对这一家族蛋白质逐个进行区分。然而,如果仅需要筛选其中某种蛋白质的适配体,目的是将这种蛋白质与其同源蛋白质区分开,则需要通过反筛等手段筛选出该蛋白质的高特异性的适配体。因此,如果需要区别靶蛋白质与其相关蛋白质,则需选择对某种蛋白质具有高特异性结合的适配体。反之,如果需要对几种相关蛋白质同时进行适配体筛选,如筛选不同物种中的直系同源蛋白质的适配体,则可同时将几种蛋白质作为靶标进行SELEX^[95]。

从随机核酸库中筛选与靶蛋白质具有高亲和性和特异性的核酸序列是适配体筛选的最终目的。多轮筛选过程中,靶标与不同次级库的亲和力应逐渐增加,明显强于与初始核酸库的作用。多轮筛选过程中,对强结合核酸序列的筛选可通过靶标-次级库复合物的解离常数的测定进行定量评价。筛选轮次越多,解离常数越低。靶标与核酸序列以及次级库亲和力的表征通常需通过“靶标”、“靶标-核酸复合物”与“未结合核酸”的完全分离,依据其平衡浓度求算解离常数。测定方法有透析法、超滤法、凝胶电泳法、毛细管电泳法、液相色谱法等。也可不需分离,直接测定含有“靶标”、“靶标-核酸复合物”与“未结合核酸”的混合溶液。这类方法有荧光各向异性/偏振、紫外光谱法、表面等离子共振和等温滴定热量测定法等。因测定方法和条件不同,测得的解离常数也会存在差异。但解离常数可用于亲和力强弱的定性比较。

表 1列举了常用的解离常数测定方法和实验条件。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 亲和力表征方法及条件 Table 1 Affinity characterization methods and conditions Method Sample amount Period and conditions Limit of Kd/ (mol/L) Equipment Reference Dialysis 100 μL 48 h 10-8 micro balance membrane dialyzer with fluorescence detector [96, 97, 98] Nitrocellulose filter binding 200-500 μL separation procedure: 5min; radioactive marker and scintillation counting needed 10-13-10-12 centrifuge and filter membrane,or microporous membrane filter with the vacuum device,scintillation counter [99, 100] Gel electrophoresis 10-50 μL separation procedure: 3 h; gel casting,radioactive labeling,radiation self-developing and rubber cutting counting needed 10-13 gel electrophoresis power equipment and autoradiography [101, 102] CE 10 μL 10 min 10-9 CEsysterm and LIF detector [103] HPLC 100 μL-18 mL 10-30 min 10-6 HPLCsysterm and UV detector [104, 105] Fluorescence intensity 150 μL 10 min,waiting after titration 10-10 fluorescence spectrometer and colorimetric dish [106, 107] Fluorescence anisotropy/ polarization 15-25 μL 150 μL 10 min 10-9 polarizer,quartz color dish and ELIASA [106, 108, 109] UV-vis absorption 15-25 μL 10 min 10-6 spectrophotometer and quartz color dish [110] 2.5 mL Surface plasmon resonance 10-20 μL 20 min,aptamer immobilization needed 10-12 SPR and sensor chip [110] Isothermal titration calorimetry 1.5 mL (sample cell) 200-500 μL (total injection volume) 1.5-3 h 10-8-10-9 ITC calorimeter [110, 111]

表1 亲和力表征方法及条件 Table 1 Affinity characterization methods and conditions

近年来,针对适配体高效筛选方法的研究报道主要涉及核酸库的优化、复合物分离、次级核酸库的富集与单链拆分、适配体与靶分子亲和力表征、适配体结构优化等方面。当前,随着高通量测序和计算机辅助设计等多种新技术的快速发展,随机库序列的生物信息学分析为适配体的高效筛选提供了新的思路和方法。但自动化、标准化的适配体筛选程序和方法尚未出现,适配体筛依然面临着很多困难,至今有效可用的适配体还十分有限,远远还不能满足实际需求。

由于蛋白质种类繁多、分子量大且结构复杂、性质差异大,其与核酸序列和随机库相互作用的机理也不尽相同。目前,还少有从靶分子性质与相互作用机理的角度进行筛选研究的报道。适配体筛选应考虑的核心问题是提高亲和力与特异性,而蛋白质靶的带电性、构象、组成序列等性质对其与ssDNA亲和力的影响不容忽视。本课题组正在进行针对蛋白质靶的筛选策略研究,针对不同蛋白质有必要设计不同的筛选策略。从蛋白质靶的性质出发,探讨蛋白质靶的适配体筛选的本质将有助于提高蛋白质靶的适配体筛选效率。