核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)体外筛选的能与靶标高亲和性和高特异性结合的核糖核酸(RNA)和单链脱氧核糖核酸(ssDNA)^[1]。它通常由几十个核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体组成,通过碱基的分子内氢键作用,形成复杂的二级或三级结构,如发卡、茎环、G-四连体等。筛选适配体的主要步骤包括建立随机寡核苷酸库(简称“核酸库”)、表征核酸库与靶标的相互作用、分离靶标核酸复合物,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增可与靶标结合的核酸形成新的次级库。多次重复以上筛选步骤(一般需要4～20轮)以获得亲和力高、特异性好的适配体。筛选的最后步骤还包括核酸序列测序并计算它与靶标形成的复合物的平衡解离常数(K_d)等。人工构建的核酸库一般包括正向引物序列、20～60个随机核苷酸序列、反向引物序列3部分。如筛选RNA适配体则需使用RNA库,首先要将RNA分子逆转录为互补DNA(cDNA)后再进行扩增。由于RNA容易降解,故在筛选过程及应用时需要采取保护措施,如使用2-氟-2-脱氧胞苷三磷酸和2-氟-2-脱氧尿苷三磷酸合成RNA^[2]。筛选ssDNA适配体则相对简单,因ssDNA库可直接合成无需逆转录步骤,且DNA的稳定性优于RNA,合成和纯化步骤较简单。

适配体作用的靶标范围很广,包括小分子、生物大分子(蛋白质和酶)、细菌及细胞等。因细菌广泛存在于空气、水、土壤以及各种生活环境中,故在食品、环境、医药等领域的细菌分析检测必不可少。传统的细菌检测需要通过细菌培养、生化鉴定、抗体识别、PCR等分析手段完成。这些检测方法耗时长、成本高、不够便利。而使用适配体则无需对细菌进行大量培养,也无需裂解提取DNA,有望实现原位在线检测。相比抗体,适配体的化学结构更稳定、相对分子质量更小,完全通过人工合成方法大量制备,无需实验动物,故制备周期短并且成本低。理论上,任何细菌都有可能通过SELEX方法筛选得到其适配体。

多篇综述总结了细菌的适配体应用研究。Maureen等^[3]统计了1990～2013年的492篇适配体筛选文献,其中有6%的文献是以细菌或真核细胞为靶标。Torres-Chavolla等^[4]总结了2009年前的全细胞靶标的适配体筛选,其中应用于细菌检测的有5篇。Hamula等^[5]总结了2011年前致病菌适配体的筛选与应用,其中有12篇文献报道了以全细胞方式筛选的适配体,涵盖了8属9种病原菌。另有20篇文献以菌体分子为靶标,涉及11种细菌。针对适配体的应用,Amaya-González等^[6]介绍了2004～2013年适配体在食品细菌检测领域的应用,这些应用基于适配体分析、适配体传感器和适配体芯片3个层次。Gedi等^[7]总结了2014年前有关适配体与纳米颗粒结合的应用技术,介绍了针对8属10种病原菌的13篇文献。McKeague等^[8]总结了2011年前发表的适配体传感器在食品细菌检测领域的应用研究,包括了8属11种细菌的13个适配体传感器,其中RNA适配体4个,ssDNA适配体9个。Ozalp等^[9]总结了2013年前具有抗菌活性的适配体,这些适配体可以抑制细菌代谢、促进人体免疫反应或者阻碍细菌侵染人体。2011～2015年报道的细菌的适配体筛选,ssDNA适配体有15篇,RNA适配体为2篇(见表 1)^{[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26]}。相比大量的应用需求,实际可用的细菌适配体还极其有限,细菌适配体的筛选以及使用还面临很大的困难。目前,细菌的适配体还远远不能满足实际应用需要,其中适配体的有效筛选是关键,也是瓶颈问题。本文总结了2011～2015年基于细菌全细胞的适配体筛选方法、适配体的亲和力和特异性表征方法以及适配体在细菌分析检测中的最新进展。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 细菌全细胞的核酸适配体序列及其平衡解离常数(Kd) Table 1 Sequences and equilibrium dissociation constants (Kd) of aptamers against bacteria Type Target(s) Control Sequence of aptamers (5′-3′) * K d/(nmol/L) Assay method Ref. DNA Bacillus anthracis Shigalla and tularemia (ACCCCTGCATCCTTTGCTGG)AGAGGAATGTATAAGGATGTTCCGGGCGTGTGGGTAAGTC(AGTCTAGAGGGCCCCAGAAT) NA DCE [10] DNA E. coli K. pneumonia,Citrobacterfreundii,E. aerogenes,S. epidermidis,and B. subtilis (GCAATGGTACGGTACTTCC)ACTTAGGTCGAGGTTAGTTTGTCTTGCTGGCGCATCCACTGAGCG(CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA) 12.4 FS [11] RNA E. coli O157: H7 E. coli K12 strain (ATCC 29425) (GGGAUACCAGCUUAUUCAAUU)UGAUUCCAUCUUCCUGGACUGUCGAAAAUUCAGUAUCGGGAGGUUACGUAUUUGGUUUAU(AGAUAGUAAGUGCAAUCU) NA ELASA [12] DNA E. coli NA (GCAATGGTACGGTACTTCC)GTTGCACTGTGCGGCCGAGCTGCCCCCTGGTTTGTGAATACCCTGGG(CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA) NA FS [13] DNA ETEC K88 fimbriae protein bovine serum albumin (BSA) (CGTACGGTCGACGCTAGC)GGAGACCGTACCATCTGTTCGTGGAAGCGCTTTGCTCGTCCATTAGCCTTGTGCTCGTGC(CACGTGGAGCTCGGATCC) 25±4 FS [14] DNA L. acidophilus S. bovis,E. coli K12 and S. cerevisiae (AGCAGCACAGAGGTCAGATG)TAGCCCTTCAACATAGTAATATCTCTGCATTCTGTGTG(CCTATGCGTGCTACCGTGAA) 13±3 FC [15] DNA Listeria E. coli O157: H7, B. cereus,S. Enteritidis,S. aureus,P. aeruginosa,S. flexneri,B. thermosphacta,and L. lactis (AGTATACGTATTACCTGCAGC)TCTGTGTTCCGTTTTCGATTCTTACTGTGTTTTCGGGTGC(CGATATCTCGGAGATCTTGC) 74.4±52.69 FC [16] DNA L. monocytogenes B. subtilis,E. coli (ATACCAGCTTATTCAATT)CCAAAAGCGCACCCATATATGTTCTATGTCCCCCACCTCG(AGATTGCACTTACTATCT) 0.00201 SPR [17] DNA Sal. typhimurium Heated S. typhimurium,S. enteritidis,E. coli,S. aureus,P. aeruginosa,and C. freundii to (CTCCTCTGACTGTAACCACG)GAGTTAATCAATACAAGGCGGGAACATCCTTGGCGGTGC(GCATAGGTAGTCCAGAAGCC) 25 FC [18] RNA Salmonella outer membrane protein C (OmpC) NA (GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCC)UAGUGUGAGAGCCGUGAGUGAAAGGCCGCGACAAAGAUCGGA(CAUAACCCAGAGGUC GAUGGAUCCCC) 27.64 ELASA [19] DNA Salmonella BSA (ATAGGAGTCACGACGACCAGAA)AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGA(TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT) 6.33±0.58 FC [20] DNA Sal. enteritidis S. typhimurium,P. aeruginosa,and E. coli (GCGCGGATCCCGCGC)CACAGATGACGTCTGGCACATAATTAACAC(CGCGCGAA GCTTGCG) 3830±10 FS [21] DNA Sal. typhimurium S. enteritidis, P. aeruginosa,and E. coli (GCGCGGATCCCGCGC)CCGATGTCCGTTAGGGCTCCTCCATAGAT(CGCGCGAA GCTTGCG) 530±10 FS [21] DNA Shigella S. aureus,Sal. typhimurium,E. coli,L. monocytogenes and V. parahaemolyticus (ATAGGAGTCACGACGACCAGAA)CGGAACTAGCGTTTAAATGCCAGGACTGAAGTAGGCAGGG(ATTAGTCAGAGGTAGACGCACATA) 23.47±2.48 FS [22] DNA S. aureus S. typhimurium and E. coli (CGGATGCGAATTCCCTAATACGACTCACTATAGGGCGT)CACACCGCAGCAGTGGGAACGTTTCAGCCATGCAAGCATCACGCCCGT(GGTGGATCCATATTCCTACTCG) 3.49±1.43 FC [23] DNA S. aureus S. epidermidis (TCCCTACGGCGCTAAC)CCCCCCAGTCCGTCCTCCCAGCCTCACACC(GCCACCGTGCTACAAC) 35 FI [24] DNA methicillin-resistant S. aureus E. faecalis (ATCCAGAGTGACGCAGCA)TTATGGGGTGTGGTGGGGGGTTAATGCGTTGGTTATCCG(TGTGGACACGGTGGCTTA) 95±20 FC [25] DNA V. parahemolyticus BSA (ATAGGAGTCACGACGACCAGAA)TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACT(TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT) 16.9±1.9 FC [26] * Primers are marked with brackets. Show only favored (with lowest K d or suggested by author) sequences. FC,flow cytometry; FI,fluorescent imaging; FS,fluorescence spectrometry; DCE, DNA capture element; SPR,surface plasmon resonance; ELASA,enzyme linked aptamer sorbent assay. NA,not mentioned.

表1 细菌全细胞的核酸适配体序列及其平衡解离常数(Kd) Table 1 Sequences and equilibrium dissociation constants (Kd) of aptamers against bacteria

针对细菌靶标的适配体筛选,一般是以菌体表面分子为靶标或以全细胞为靶标。基于菌体表面分子的筛选,通常需将靶标细菌灭活,再分离纯化菌体表面的蛋白质、多糖等分子,并以这些大分子作为靶标^{[23, 27]}。此种针对表面分子的筛选方法与蛋白质、小分子等靶标的适配体筛选方法类似^[5]。由于对菌体表面分子的分离纯化改变了其处于菌体表面时的空间构型和环境状态,与其在细菌表面时的天然结构存在差异^[16],因而基于表面分子筛选的适配体在全细胞检测中应用时,显然与针对表面分子检测时不一致,这种针对表面分子筛选的适配体通常并不完全适用于全细胞检测。所以直接使用完整的菌体细胞(灭活或活体)作为靶标,将最大限度地保持菌体的天然状态和表面分子的天然结构,有利于对实际菌体样品的检测。而且直接利用全细胞菌体为靶标,还无需分离和提纯菌体表面分子,大大简化筛选步骤和复杂过程。特别值得一提的是,以单一来源的细菌为靶标筛选得到的适配体,往往可以与同种细菌的不同来源的菌株结合。如由大肠杆菌(E. coli)(KCTC 2571)筛选得到的4条适配体E1、E2、E10和E12均可与E. coli KCTC 1681、KCTC 2617和KCTC 2618有较强的结合,但与不同种属的K. pneumonia、C. freundii、E. aerogenes或S. epidermidis的结合很弱^[11],表明该适配体同时具有种内识别的通用性和种间识别的特异性,可以用于种水平上的细菌检测与鉴定,但是不能用于菌株鉴定。

然而,由于细菌存在细胞壁以及部分细菌荚膜结构,适配体很难直接与菌体表面特异性的蛋白质或多糖接触。而且不同温度和不同培养基等条件下培养的细菌,其菌体状态也会存在差异。因此全细胞的适配体筛选的确存在更多困难。目前的全细胞适配体筛选,所用的菌体靶标既有灭活的菌体(如乙醇或甲醛灭活),也有活的细菌^{[22, 24, 28]},对菌体细胞表面的不同处理方式肯定影响筛选的适配体的亲和力。本课题组的研究表明，使用E. coli与嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)的原生质体作为靶标可以筛选到亲和力更强的适配体,用乙醇灭活的大肠杆菌比甲醛灭活的大肠杆菌对核酸库的亲和力更强^[29]。此外,灭活的菌体可以一次大量制备获得,便于满足后续多轮筛选的需要,也有利于菌体的定量、减小实验误差。但是灭活过程也会导致菌体表面蛋白质变性,与实际活菌检测的表面状态不同。而以活菌为靶标时,虽不存在表面蛋白质的变性问题,但不同批次以及不同测定时间的活菌的数量和生长状态存在一定差异,故需先对活菌定量(菌落计数或测定吸光度),并检测和表征其生长状态,减少活菌靶标的性状差异,提高活菌检测的重现性。

全细胞菌体的适配体筛选前,需先将人工合成的随机核酸库进行热变性(95 ℃,10 min)以破坏核酸分子间形成的聚合物,然后在冰上迅速降温,避免核酸发生聚合,再与靶标细胞在4～37 ℃下静置或轻柔振荡孵育30～90 min,以形成核酸-菌体复合物。Shamah等^[30]认为4 ℃孵育可以减少DNA降解,有利于适配体的筛选。另一方面,如考虑到适配体应用于细菌检测时的环境温度,室温或37 ℃孵育与实际应用条件更接近。

孵育完成后,可通过离心去除上清液中游离的核酸,并多次洗涤菌体沉淀,再将核酸-菌体复合物加热变性,使菌体细胞与核酸分离。离心回收上清液。对上清液中的核酸进行PCR扩增,再通过核酸的单链制备,得到次级单链核酸库。核酸库与初始核酸库相比,对靶标结合的亲和力有所提高。重复以上孵育-分离-扩增的筛选过程,经过多轮筛选直到获得对靶标具有高亲和力(nmol/L数量级)的核酸。对核酸进行测序,并测定其与靶标结合的K_d值。进一步检测其特异性,选出兼具高特异性与高亲和力的核酸序列作为该种细菌的适配体。全细胞菌体的适配体筛选过程中,离心法是高效分离游离核酸与靶标-核酸复合物的主要方法。

目前全细胞的适配体筛选主要使用离心法分离菌体与游离的核酸。本课题组也使用了毛细管电泳(CE)进行适配体筛选。因ssDNA与靶标细菌形成复合物后,其质荷比变化导致在CE中的迁移率改变。CE过程中,ssDNA、靶标、靶标-核酸复合物具有不同的迁移速率,故可通过CE分离并收集靶标-核酸复合物,同时还可对核酸库与靶标的亲和作用进行比较^[29]。因此,毛细管电泳是高效筛选适配体的有效方法之一,可在一次CE过程中完成复合物的收集和亲和作用的比较。

为了提高筛选的适配体的特异性,筛选过程中通常需要使用反向筛选。即使用高浓度的非靶标细胞与核酸库共同孵育,以除去非特异性结合的核酸。反向筛选常在第2轮及之后的轮次进行,所选非靶标细胞可以是其他种属的细菌,对活细胞靶标也可以使用灭活的靶细胞作为反向筛选的靶标细胞^[18]。Lee等^[2]筛选E. coli O157的适配体时选用了同属不同种的E. coli K12作为反向筛选的靶标。Park等^[21]使用铜绿假单胞菌与大肠杆菌作为反向筛选的靶标用于Sal. typhimurium和Sal. enteritidis的适配体筛选。Labib等^[18]筛选Sal. typhimurium的适配体时使用的是热变性的靶细胞以及混合的S. enteritidis、E. coli、S. aureus、P. aeruginosa和C. freundii作为反向筛选的靶标,筛选到的适配体能区分死细胞与活细胞。需要注意的是,Duan等^[22]在筛选S. dysenteriae的适配体时选择了不同属的S. aureus、Sal. typhimurium、E. coli、L. monocytogenes和V. parahaemolyticus 4种菌作为反向筛选靶标,当进行适配体的特异性验证时,其对靶标的亲和力显著高于同属的S. boydii、S. sonnei和S. flexneri,这表明即使使用不同属的菌株作为反向筛选的靶标,筛选的适配体也能对同属不同种的细菌进行区分。同时也说明依据细菌的生化反应、形态特征划分的细菌种属,不能很好地反应细菌表面特征分子的差异。S. dysenteriae的表面特征分子与同属的S. boydii、S. sonnei和S. flexneri间存在差异,应该足以通过适配体进行鉴别,甚至不需要特别设置反向筛选的靶标。另一方面,由于属内细菌的表面特征分子也存在较大差异,当难以直接筛选属内通用的适配体时,可以优化筛选方法,或者将一组针对属内不同种细菌的适配体联合使用。

细菌靶标与核酸结合的亲和力和特异性是评价所筛选的适配体的重要参数。通常用靶标-核酸复合物的K_d表征相互作用。K_d值越小表明两者相互作用越强。当使用梯度浓度的核酸与靶标共同孵育后,检测核酸-靶标复合物的浓度,按公式(1)可求算K_d^{[24, 25, 31]}。

将荧光标记的核酸与靶标的孵育混合物经离心去除和清洗未结合的适配体后,置于荧光显微镜下观测,直接对带有荧光的成像菌体计数,可求出Y值^[11]。

将核酸与靶标的孵育混合物通过离心等方法分离后,使用荧光光谱仪测定核酸-靶标复合物的荧光强度,可作为Y值^[22]。

将孵育混合物通过流式细胞仪,测定带有荧光标记的核酸-靶标复合物的数量^[16]。流式细胞仪可以对复合物进行绝对定量,同时将核酸-靶标复合物与游离的核酸或靶标分离。

表面等离子共振(SPR)技术将50 μ mol/L 核酸固定在亲和素芯片上,再通入10⁹ CFU/mL 的靶标细菌孵育10 min,然后用Biacore 3000测定^[17]。结果经软件分析后可求得K_d值。由于SPR可以直接检测适配体与靶标的结合状态,因此无需额外对适配体进行修饰,最大限度地保持了适配体的空间结构。

使用3′端带有量子点或荧光基团标记的适配体及5′端带有猝灭基团的适配体的互补序列形成双链DNA。加入靶标后,因靶标与适配体序列结合将释放出5′端携带的猝灭基团的互补序列,而使适配体上的量子点或荧光基团发光。检测荧光强度可定量检测适配体-靶标复合物的量。由于未与靶标结合的适配体的荧光被猝灭,因而此方法的背景荧光低,具有较高的灵敏度^[10]。

将5′端标记有巯基的RNA适配体固定在银膜上,经磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱未固定的适配体后,加入靶标细菌。孵育15 min后靶标被银膜上的适配体捕获固定,用PBS冲洗后,再加入带有6-羟基荧光素(FAM)标记的适配体继续孵育,使其与靶标形成适配体-细菌-适配体夹心型复合物,洗脱未结合的适配体后,通过荧光成像即可观察到带有荧光的复合物,从而对靶标细菌进行定量分析^[12]。

依据ssDNA、靶标和ssDNA-靶标复合物质荷比的差异将3组分分离,并通过测定各组分的峰面积,根据公式(2)计算K_d值^[29]。

在测定K_d值的同时,CE能够将ssDNA-靶标复合物分离富集,简化了SELEX筛选的步骤。

筛选完成后,除了表征适配体的亲和力,还需考察适配体对靶标的特异性。特异性验证可利用同种不同来源的菌株,也可用不同种属的其他细菌。用单一菌种作为靶标筛选的适配体,对同一种细菌不同来源的菌株系有结合作用,但无法识别不同种、不同属的其他细菌,或对其他细菌的亲和力很弱^{[24, 28]}。例如Chang等^[24]用金黄色葡萄球菌筛选得到的适配体对6株不同来源的金黄色葡萄球菌均有较强的结合,与11株不同属的细菌没有结合,而与2株同为葡萄球菌属但不同种的细菌有较弱的结合。

食品、医药、环境等领域中细菌的检测非常普遍,具有重要的实用意义。基于抗体的细菌检测技术,因其速度快、特异性高而倍受青睐。近年来筛选的适配体已经可以部分替代抗体用于细菌的分析检测。目前筛选的适配体的K_d值在10～10³ nmol/L,对不同细菌的检出限因所用分析方法不同差别较大,其范围在10²～10⁶ CFU/mL 之间。适配体的高特异性与高亲和力的特点,使其可以很好地用于识别和捕获靶标细菌,基于此可设计多种细菌分析方法。目前用于细菌检测的适配体方法有酶联免疫、同位素标记、荧光标记、核酸染料、电化学传感器、纳米金颗粒、夹心法以及多适配体联合等。

为了从S. aureus和E. coli O157: H7的混合菌液中检测Sal. typhimurium,将5′端标记生物素的RNA适配体固定在包被有亲和素的96孔板上,再将细菌样品在96孔板上室温孵育1 h,洗脱未结合的细菌后,加入该细菌特异性的抗体(一抗),再孵育、洗脱后,加入带有辣根过氧化物酶标记的二抗,再加入过氧化物酶底物溶液,在酶标仪中检测425 nm处的吸光值。利用酶联免疫吸附测定(ELISA)原理,以适配体取代抗体固定抗原,可定量分析Sal. typhimurium,而不受其他细菌干扰^[19]。

使用带有同位素标记的适配体,则可以免除后续一抗、二抗的使用,直接进行检测。如在小牛肠磷酸酶作用下将RNA适配体5′端脱磷酸后,用[γ -³²P]ATP(腺苷三磷酸)在T4多聚核苷酸激酶作用下磷酸化,得到5′端有³²P标记的适配体。将待测的Sal. typhimurium包被在96孔板上,与带有³²P标记的RNA适配体在室温下共同孵育1 h,冲洗后用液体闪烁计数器测定与靶标细胞结合的带有同位素标记的适配体,从而对靶标进行定量,但是这种方法检出限较高(10⁶ CFU/mL)^[19]。

除了同位素标记,也可以在适配体上修饰荧光基团,用双适配体夹心法进行细菌分析。如将生物素修饰的适配体包被在96孔板上,与靶标志贺氏菌在室温下共同孵育1 h,冲洗去除未结合的志贺氏菌后,加入带有FAM荧光标记的适配体在室温下孵育1 h,冲洗2次后测定荧光强度,检出限可达50 CFU/mL,并且在10²～10⁷ CFU/mL 范围内都有良好的线性关系(R²=0.995 4)^[22]。

与使用荧光基团标记类似,在适配体上可以修饰量子点标记。Duan等^[32]将带有量子点标记的适配体与靶细胞V. parahaemolyticus或Sal. typhimurium在37 ℃下共同孵育1 h后,于 3 000 r/min 下离心除去未结合的适配体。使用流式细胞仪对适配体-细菌复合物进行分离计数。此外,用于针对两种不同细菌的适配体上分别修饰了535 nm和585 nm两种不同的量子点标记,在流式细胞分选时可以同时检测两种细菌。相对于荧光基团标记,量子点荧光的发射波长有更多的选择,有利于多通道检测,能够实现同时检测多种细菌。

上转换荧光纳米颗粒(upconversion nanoparticles,UCNP)利用反-斯托克斯发光(anti-Stokes)产生长寿命荧光,可以有效排除背景中细菌自发短寿命荧光的干扰,提高荧光信号的信噪比。Wu等^[33]使用多色UCNP分别标记了针对S. aureus、V. parahaemolyticus和S. typhimurium的适配体,结合磁分离技术,在牛奶、对虾样品中同时检测这3种致病菌,结果与传统平板计数法一致。

AccuBlue染料可以与双链DNA(dsDNA)结合产生较强的荧光,但它单独存在时或与ssDNA结合后产生的荧光较弱。将AccBlue染料、适配体、与适配体互补的ssDNA结合使用,可以用于细菌的定量检测^[34]。检测方法分为两种模式:(1)“signal on”模式。将靶标细菌与一定量的适配体共同孵育,形成靶标-适配体复合物,再加入适配体的互补序列与AccBlue染料,体系中游离的适配体与互补序列形成dsDNA,结合染料后产生荧光,测定荧光强度的增加即可知游离的适配体浓度,进而推算靶标浓度。(2)“signal off”模式。将适配体与其互补序列先形成dsDNA与AccBlue染料产生荧光,再加入靶标细菌与互补序列竞争结合适配体,导致荧光强度随着dsDNA的减少而降低。对V. parahaemolyticus和S. typhimurium的检出限分别达到35 CFU/mL 和25 CFU/mL。由于是通过dsDNA间接测定适配体-靶标复合物的浓度,因此针对不同样品需要对核酸染料的用量进行优化,才能得到较显著的荧光强度的变化,以保证检测的特异性和灵敏度。

双适配体夹心法(aptamer-based sandwich assay,ABSA)将适配体固定在96孔板上,加入样品孵育30 min后,冲洗除去未结合的细菌,再加入带有荧光修饰的适配体孵育,冲洗去除游离的适配体后测定荧光强度。Lee等^[17]使用L. monocytogenes的适配体对不同浓度的靶标细菌的菌悬液进行了测定,线性范围为20～200 000 CFU/mL(R²= 0.99)。

细菌表面的蛋白质、多糖以及鞭毛等都有可能成为适配体作用的靶标。故对同一细菌有可能筛选到针对蛋白质、多糖以及鞭毛等多种靶标的不同适配体。将这些适配体联合使用,有助于对全细胞的高特异性结合,可以显著提高检测灵敏度与特异性。如Kim等^[13]使用量子点标记的3组不同适配体与E. coli结合,通过荧光成像发现这3组适配体可以同时非竞争性地与靶标E. coli结合。联合使用这3组适配体相对单独使用一种适配体,对E. coli的检出限从10³ CFU/mL降低到10² CFU/mL。

适配体也可以与电化学检测器联用,从而提高灵敏度,进一步降低检出限。Labib等^[18]将筛选得到的鼠伤寒沙门氏菌的适配体用硫醇修饰后,通过自组装结合到纳米金修饰的碳电极上。通过测定适配体与靶标结合前后阻抗的变化,即可对靶标进行定量、定性分析。该方法可以从30 μ L样品中检出最低18个细胞,且只检测活的鼠伤寒沙门氏菌,对灭活的鼠伤寒沙门氏菌则没有响应。电化学的检测方法有利于便携检测仪器的开发。

先用纳米金颗粒吸附鼠伤寒沙门氏菌或大肠埃希氏菌的适配体。当这些适配体捕获靶标后,纳米金颗粒会聚集沉淀,其溶液颜色由红变紫,通过测定吸光度的变化,可对靶标细菌进行定量。纳米金颗粒对非靶标的其他种属的细菌如S. paratyphi A或金黄色葡萄球菌的吸附较少,故溶液颜色没有变化。该方法的检测特异性较好,但检出限较高(10⁵CFU/mL)^[28]。

细菌全细胞表面的分子组成和结构复杂,具体信息未知。因此,利用全细胞筛选可以不受这些局限,针对其完整状态筛选出可识别全细胞的适配体。提高细菌全细胞适配体筛选的成功率及其亲和力和特异性,使适配体成为高效、稳定的细菌识别分子,将是适配体广泛用于细菌分析检测的基础。目前存在的问题是:(1)为保证适配体的高亲和力,需要重复十几甚至数十轮次的SELEX过程,筛选耗时长、步骤繁琐、人力和财力成本很高。因缺少自动化的筛选方法和仪器,筛选轮次太多将使筛选的效率无法保证。(2)筛选过程中,难以监测每轮次级库的亲和力变化。目前,除了CE方法便于连续监测每轮筛选中次级库的亲和力变化外,其他筛选方法少有关于次级库亲和力变化的报道。(3)适配体的特异性高低在实际应用中非常关键。特异性的提高受反向筛选的靶标的影响。但目前反向筛选的靶标选择具有较大的随意性,也缺少反向筛选靶标对筛选特异性影响的研究。现阶段的主要解决方法是同时使用多种细胞作为反向筛选的靶标以提高特异性。(4)适配体用于细菌检测时的灵敏度还有很大的提升空间。使用荧光、同位素等手段标记适配体,将其与其他传感器、分析系统联合使用,或利用针对同一靶标的一组适配体代替单一适配体都可以降低检出限。因此选择合适的检测方法将有助于改善适配体在细菌检测中的应用效果。通过检测方法的优化,也可以在一定程度上降低对适配体亲和力和特异性的要求。目前,细菌全细胞的适配体筛选方法研究还不充分,适配体在细菌检测中的应用也还有很大的发展空间。