截止到2015年12月31日,以“capillary electrophoresis or capillary isoelectric focusing or micellar electrokinetic chromatography”在“ISI Web of Science”数据库中进行主题检索(排除“microchip capillary electrophoresis,capillary electrochromatography,capillary monolithic column”),共有论文427篇。本年度分析化学学科最有影响的杂志Analytical Chemistry中有24篇CE论文发表,文章数较前3年有所增加。CE的专业期刊之一,Electrophoresis中发表的CE论文65篇,文章数量略减,但仍排名第一。其他的重要分析化学期刊分别为Journal of Chromatography A 39篇、Journal of Separation Science 28篇、Talanta 13篇、Analytica Chimica Acta 12篇、Analyst 9篇。我国《分析化学》发表 5篇,《色谱》发表 6篇,与往年情况持平。本文将从CE-MS联用技术、方法学研究、检测与富集、手性分子拆分以及CE在食品营养与安全、临床样本检测、药物分析及生命科学研究方面的应用等方面进行介绍。

近年来,随着MS技术的应用和普及,CE-MS联用技术的研究和应用报道数量增速很快。本年度CE-MS联用技术的文献有61篇,包括了CE-MS联用方法学研究和CE-MS技术的应用研究。

CE-MS联用中,接口的性能优劣是关键因素。接口技术必须考虑检测的高灵敏和仪器的高稳定性。CE-MS的接口技术研究包括接口设计的数值模拟、第三代电动驱动鞘液纳喷接口、低流速无鞘液纳喷接口、内径小于20 μ m的电喷雾毛细管的使用以及改善非挥发性的正电添加剂导致的信号抑制的水动力流辅助的双结接口。在CE-MS接口中引入在线反应鞘液试剂,可用于筛选植物中具有抗氧化特性的提取物。可实现亚纳升样品高通量分析的100%进样效率的CE-MS以及便携式微型CE-MS的建立大大提高了CE-MS的实时分析速率,扩展了其应用范围。此外,电泳迁移与荷质比的半经验模型可成功用于模拟人红细胞生成素消化液中肽和糖肽在CE-MS中的迁移行为。

CE-MS技术的应用主要针对食品营养与安全分析、药物分析、代谢组学分析及离子分析。如食品营养与安全中涉及的豆类异黄酮、果汁中有机酸、蜂蜜中的氨基糖苷、食用海藻中生物碱、母乳中游离的单磷酸核苷、啤酒和白酒中的生物胺、牛奶中雌激素化合物和多种食品中的除草剂等;药物检测中的兴奋剂、衍生化的卤代烃、干扰素 γ 、曲妥单抗、极亲水性肽、天然产物的生物活性提取物等。针对代谢组学研究,CE-MS用于人尿液、血浆或血清中的疾病如ST段抬高与非ST段抬高急性冠脉综合征、2型糖尿病的相关生物标记物、多种药物代谢物、疾病模型小鼠的血浆代谢物、结肠癌细胞的代谢组学、野生型与突变型利什曼原虫亚马逊株的代谢调控、地理位置与烟草植物叶的初级代谢变化的相关性、亚硝基谷胱甘肽的分解途径、蓖麻毒素的脱氨基作用以及CE-MS与化学计量学数据分析结合用于高通量代谢组学研究等。CE-ESI-MS结合动态光散射等技术可研究L-半胱氨酸包覆的碲化镉量子点与汞离子的相互作用机制,CE结合ICP-MS还可用于铁、镎和钚的氧化还原物、铬类和砷类化合物、锕类元素与草酸复合物形成、金纳米粒子与血浆蛋白的相互作用表征。值得注意的是,CE-MS用于蛋白质、糖及核苷酸的分析在Analytical Chemistry发表的有将磺化硅杂交的强阳离子交换整体柱在线pH梯度洗脱固相萃取与CE-MS结合、反向HPLC与超低流速的CE-MS结合、毛细管区带电泳(CZE)与电子转移解离及离子激活电子转移解离MS偶联用于蛋白质组学研究;CE-MS表征蛋白间的异质性与亲和力、一次CE-MS在100 min内分离鉴定超过 2 300 个磷酸化肽;CE-ESI-MS定量分析多重活性羰基的串联质谱标签标记的多糖;毛细管离子色谱与CE-ESI-MS串联,根据离子态二维分离核苷酸与环化核苷酸。

CE方法学研究报告有38篇,其中28篇发表在分析化学类二区以上期刊。CE的理论和方法研究包括:将时间尺度的电泳图谱转化为更直观的有效迁移率的质量相对分布图用于定量分析;新的峰展宽参数用于表征CE的分离能力;快速有效的通过更改毛细管长度来避免双向进样CE中相反带电离子共同检测的系统方法;CE连续二维扩散进样的理论与实验研究;利用部分填充亲和毛细管电泳(ACE)和吸收能量分布计算载脂蛋白E与蛋白聚糖的相互作用;平衡混合物的非平衡毛细管电泳在测定平衡常数的同时测定结合靶标浓度的方法学研究。CE装置的改进包括:可实现固相萃取与CE在线联用的鞘流控制接口以及可用于样品体积仅300 nL的自动微进样器的设计;利用锥形尖端的短毛细管驱动与电渗流相反的逆流来增加CE分离效果;逐滴喷墨进样及毛细管柱上反应的电泳微分析;光学选通进样-UV检测的CE在线连续酶反应和不考虑样品水溶性、pK_a值的数量以及结构的自动测定pK_a的内标毛细管电泳装置。为控制CE电渗流或防止电泳中的蛋白质吸附问题,针对毛细管涂层的研究有:一步法几丁质物理吸附涂层、树状聚胺类新型涂层、甘油聚合物动态共价涂层、吡咯烷鎓盐Gemini型表面活性剂与六氟异丙醇动态涂层、氟化高聚物涂层、聚多巴胺/聚丙烯酰胺涂层、聚多巴胺/聚乙烯亚胺共沉积涂层、聚电解质多层涂层等,双层的聚乙烯醇涂层管可用于糖分析。CE的应用研究包括:CE测定水溶性量子点表面的有机配体数量、带电性和 ζ 电势,CE结合泰勒分散分析测定金纳米颗粒的水力半径分布和zeta电势,CE在线研究纳米粒子在片段/片段混合胶束相中的迁移现象;CE用于防晒化妆品中的苯甲酮类遮光剂的测定;办公室用纸上的蓝墨水染料的CE分析仅对样品产生微小破坏;在非水CE中采用阳离子表面活性剂可快速分离合成的线性聚合物;CE指纹图谱还可用于部分酸解聚的衍生化硝酸纤维素膜表征,测定硝酸纤维素膜的摩尔质量与其固有黏度的相关性;柱前衍生CZE可直接分析硫二甘醇及其氧化产物;CE-非对称场流分离研究富勒烯在水相中的聚集行为,毛细管胶束电动色谱(MEKC)中磷酸盐和离子液为背景电解质时的胶束聚集现象研究以及MEKC法用于母鸡组织中硫化氢、有机爆炸物和过氧化物爆炸物的测定。此外,CE在抑制剂筛选的研究中也发挥了重要作用:CE部分填充技术用于氨肽酶N抑制剂的快速筛选;CE结合HPLC-MS可从天然产物中筛选雷帕霉素靶蛋白的抑制剂及表皮生长因子受体抑制剂;针对适配体的高效筛选,利用动力学毛细管电泳理论预测蛋白质-DNA复合物的迁移率;CE结合下一代测序技术,使适配体筛选的单轮富集率显著提高;毛细管电泳-指数富集系统配体进化(CE-SELEX)中采用区段收集高效筛选链霉亲和素的适配体;乳液聚合酶链式反应(PCR)及平衡混合物的非平衡毛细管电泳相结合用于非修饰的ABH2蛋白的适配体的快速筛选。

由于CE检测的柱光程短,提高检测灵敏度的解决方法一是将CE与高灵敏度的检测器联用,二是对样品进行离线(固相萃取等)或在线富集。利用高灵敏检测器的方法包括直接及间接激光诱导荧光检测器、非接触式电导检测器、安培检测器、化学发光检测器、电化学检测器及电化学发光检测器等。代表性研究有新型绿色激光诱导荧光检测器、聚二甲基硅氧烷鞘流池光纤照明的二极管激光诱导荧光检测器及2个激光笔、Y型光纤和4个分支光纤组成的简易压缩型荧光检测器的搭建;新型水溶性荧光试剂在单个细胞中测定NO的释放与保留;CE-非接触式电导检测不同呼吸道疾病的呼出气冷凝液中离子含量以及胚胎存活率的潜在生物标记物;量子点修饰的适配体探针及适配体/氧化石墨烯结构采用化学放光法检测癌胚抗原,金纳米粒子/适配体结合电化学发光定量检测IgE; CE耦合改进的电热原子吸收光谱检测从发酵豆腐废水和果汁中提取的硒形态。

也可以通过样品预处理及离线富集,提高目标物的检测灵敏度。可通过不使用有机溶剂的浊点萃取法、多壁碳纳米管-分散固相萃取、分子印迹固相萃取、固相支撑液液萃取、聚合物包容膜在线微萃取、双分散剂辅助-离子液体分散液液微萃取、离子液超声辅助萃取、单滴液液液微萃取、酶辅助的氮吹盐诱导漂浮固化有机液滴微萃取及水相微波萃取等与CE联用,以及光点击化学合成的适配体微型化整体亲和浓缩柱、多重转换逐步进样的自动化萃取CE、选择性富集材料双氨部分功能化的二氧化硅纳米粒子、Fe₃O₄磁性纳米颗粒及3-氨基苯硼酸功能化氧化石墨烯的使用,还有绿色环保的、优于传统固相萃取的、借助电浓缩及分离同时制备阴离子和阳离子的方法。

还可以直接利用CE进行在线富集。如非水CE中酸不稳定扫集及场增强的样品进样、毛细管凝胶电泳中基质场放大和柱头场放大堆积、动态pH界面堆积、反向电极极性堆积、场放大的样品堆积MEKC、胶束坍塌MEKC、电泳浓缩及在线扫集MEKC、阳离子选择性耗尽进样在线扫集MEKC和针对连续样品流的样品堆积。在线富集常与离线富集联用,如在线扫集MEKC与中空纤维液液液微萃取相结合、支撑液膜提取法与瞬态等速电泳和直接大电动进样偶联等,无接口的中心切割二维毛细管电泳可用于阴离子型和中性分析物的堆积与分离。

手性分子拆分是难点和热点问题,采用CE的文献有39篇。拆分对象以手性药物为主,衍生氨基酸、糖和生物碱的手性拆分也略有涉及。CE用于手性拆分的核心是新型手性拆分剂的合成与使用以及手性拆分的机理研究。其中单一手性拆分试剂的开发包括:高度硫酸化的 γ -环糊精、硫酸化麦芽糊精、2,3-O-二苄基-6-O-磺丁基- α 和 β -环糊精、新型阳离子 β -环糊精衍生物、点击化学合成的腺苷酸环化酶结构异构甲氧基丙胺- β -环糊精、新型四甲基铵-乳糖盐离子液和金纳米材料动态涂层。双手性拆分试剂包括:聚二烯丙基二甲基氯化铵与羟丙基- γ -环糊精、乳糖酸克拉霉素与中性环糊精、手型离子液与磷酸克林霉素、增加手性筛分剂吸附面积的氨基功能化的硅纳米粒子与羧甲基- β -环糊精、手性配体交换CE中采用的Mn(Ⅱ)-L-丙氨酸衍生的离子液复合物与 β -环糊精以及多种双环糊精系统的组合,其中,手性衍生试剂及苯硼酸复合物可用于分离D/L-醛糖。手性拆分的机理研究包括:理论模型辅助研究华法林及其衍生物的手性及非手性分析;CE结合分子模拟研究羟丙基- β -环糊精对氧氟沙星对映体的分离机制;CE结合分子模拟、NMR研究硫酸化及甲基化双环糊精系统中舒必利药的拆分及配合;人血白蛋白(HSA)对抑霉唑的拆分及配合;美托咪定与活性体右旋美托咪定在体外克他命去甲基化测定中的作用;理论结合CE全面研究环糊精对手性药物的拆分。此外,采用CE速差模式可测定药物对映体过量百分数;毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)结合场放大样品进样可超灵敏地分析头发中麦角酸二乙胺及其C-8异构体。

CE技术在食品营养与安全、临床样本检测、药物分析、生命科学研究的应用是CE应用研究的重要内容,本小节将从以上4个小类对2015年CE技术应用的文献进行简述。

CE在食品领域的应用分为食品营养分析和食品质量与安全检测。食品的营养分析有:糖类、维生素C、非蛋白质氨基酸、麦角生物碱、海藻中的碘、法兰地中的Fe和Cu、橄榄油中抗炎症的辛辣酚醛复合物、降压功能食品中的降压成分、蜂胶和植物提取物中的酚类、花生壳中的药物活性成分、发酵产物中的有机酸、糖醇、啤酒发酵过程中氨基酸消耗量的测定等。食品质量与安全检测则包括:食源性肠道病毒、食源性病原菌、抗生素、邻苯二甲酸酯激素、生长素、双酚A、丙烯酰胺、水中的卤乙酸和脂肪醛、奶制品中三聚氰胺、烟草中的尼古丁、初榨橄榄油中的无机离子与甲酸盐、不同储存条件下牡蛎中的生物胺等测定;以及赤砂糖中的孟加拉红、饮料中的着色剂、鱼和虾肌肉中的聚磷酸盐、磺胺类的人工甜味素、食品防腐剂等添加剂的表征。毛细管凝胶电泳(CGE)-PCR法还可用来检测金枪鱼罐头中是否掺假,CE中基于旋转磁场结合金纳米粒子信号富集的在线夹心免疫法、辣根过氧化物酶与抗体标记的金纳米颗粒探针放大免疫法痕量测定鱼类中的雪卡毒素。

CE以其快速高效、样品需求量小的特点,在临床样本检测中体现出重要优势。CE进行的临床样本检测包括:HbA1c糖化血红蛋白、Hb CS蛋白、血浆蛋白、谷胱甘肽、血清缺糖转铁蛋白、 α 2-球蛋白、血小板源性生长因子-BB蛋白、肝细胞癌相关的氨基酸生物标记物、 α -、 β -地中海贫血患者中的人球蛋白链、尿卟啉与粪卟啉、氰化物以及某些致病菌的检测等。此外,样本中的药物检测也是临床样本检测的重要内容。包括:血浆中抗心律不齐药如异搏定、抗菌药如哌拉西林、三唑巴坦、头孢吡肟、乳腺癌药他莫昔芬、精神类药物帕利哌酮、加巴喷丁、烟碱,血液中的右甲吗喃、眼泪中的牛磺酸、唾液中的大麻类、尿液中的奥昔布宁和去乙基奥昔布宁、苯二氮卓类药物、直肠癌化学治疗药以及体液中的第二代抗抑郁药、5-硝基咪唑、霍奇金病抗癌药物、干血点和干尿点样品中 γ -羟基丁酸盐等检测。

CE在天然产物与中药、化学药物制剂及生物药的表征、质量及过程监测中发挥越来越重要的作用。天然产物与中药的表征包括:莨菪、地骨皮、黄连与麻黄中的生物碱、甜叶菊糖苷、天冬中的糖、葛根中的异黄酮、植物中香豆素类、褪黑素、药草中的木犀草素与芹黄素、岩白菜中的熊果苷和岩白菜素、红枝悬钩子及黑桑叶提取物中黄酮类、川西獐牙菜中的手性五环三萜和黄酮苷类、蓝蓟和淡红蓝蓟中的紫草素和迷迭香酸、复方大黄灌肠液中的蒽醌类、中药注射剂中的核苷以及丹参中的亲水、亲脂性活性成分。

化学药物制剂的质量控制包括:佐米曲坦、甲磺酸奈非那韦与格列本脲杂质分析;咖啡因、扑热息痛和布洛芬的同时检测;胃必治片的质量一致性;药物制剂中二价Fe和三价Fe的鉴别、顺苯磺阿曲库铵及其降解产物,甲磺酸曲氟沙星、阿奇霉素及注射用 β -碳青霉烯多利培南的稳定性研究;胰岛素及其类似物,疟疾药的奎宁活性成分及其衍生物、联合抗糖尿病药、抗肿瘤药替莫唑胺、粘菌素、来氟米特、肝素的表征。CE也可用于测定常用药的热力学酸解离常数、皮肤病药物的亲油性、S-亚硝基硫醇的分解和反应性、阿霉素经载药纳米粒子处理后在MCF-7细胞中的分布、药物-聚合物偶联物的在线酶解。药物与蛋白的相互作用如降压药酒石酸美托洛尔片和富马酸比索洛尔片、卡托普利、吡咯并喹啉苯醌钠盐与HSA、盐酸托莫西汀与血浆蛋白的相互作用、受体定向固定化预测药物活性也可以采用CE表征。

生物药的研究包括:单克隆抗体的带电异质性、西妥昔单抗变体的糖型表征、血清多克隆抗体IgG的Fc和Fab端糖基化检测、90%序列同源的登革热候选疫苗的剂量分析、流感疫苗中的病毒蛋白、超氧化物歧化酶中金属含量、ERK1/2酶中单磷酸化的苏氨酸和酪氨酸测定、治疗贫血的重组人促红细胞生成素的氨基酸分析、重组治疗性单克隆抗体等电点的测定、高度糖基化与涎化的重组蛋白的亚型分离,以及重组的抗凝血酶与细胞培养上清液中肝素的亲和力、单克隆抗体与HSA的结合常数的测定。

CE在生命科学领域的分析对象以蛋白质、多肽、氨基酸、糖、核酸和微生物为主。涉及的氨基酸有:人血浆中的芳香族氨基酸与分支氨基酸、半胱氨酸与同型半胱氨酸、血清Glu和Asp、胰岛氨基酸分泌物测定;糖分析包括纤维糊精寡糖表征、HIV gp120包膜糖蛋白免疫原的糖分析、糖类光化学反应;核酸分析有:含硫醚基团的C-8共聚脱氧腺苷和寡核苷酸、氧化的DNA碱基、DNA单链构象多态性、双链小干扰RNA分离、单细胞RNA总量分析、RNA结构探针的条带标识、紫外线b引起的DNA损伤产物、DNA和Pb(Ⅱ)结合位点与结合常数的测定,CRISPR/Cas9介导的突变体高通量基因分型及一种艰难梭菌的国际标准化CGE-PCR核糖分型方法的建立和验证。蛋白质与多肽研究包括人、牛、猪胰岛素的分离、 β 发夹结构蛋白激酶C的酶解产物、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性测定、 β ₂微球蛋白变体的错误折叠和稳定性研究、脂肪细胞分化蛋白质组学、聚乙二醇化的血管内皮生长因子受体2脂肽与胶团分子的相互作用、球形蛋白与金属离子的相互作用、蛋白质与量子点的毛细管内自组装、体外糖原合成激酶-3 β 对tau蛋白的磷酸化、细胞生长基质壳聚糖膜上的肽嫁接反应。微生物的表征中CE可快速检测抗粘菌素的格兰仕阴性菌中的异源群体和枯草芽孢杆菌磷脂酶促反应产生的磷酸盐等;基于CE的多位点可变数目串联重复序列分析用于菌种的分子亚分型;前沿分析CE借助电场诱发的细菌聚集研究细菌与大分子的相互作用。

2015年与CE相关的国际会议有6个,国内会议有2个,各会议的研究报道情况见表 1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 CE相关的国内外会议 Table 1 Domestic and international conferences related to CE 序号 会议名称 简称 时间 地点 主办方 会议类型 和CE相关 口头报告/个 墙报/篇 1 22nd International Symposium on Electro- and Liquid Phase-Separation Techniques(ITP2015) and the 8th Nordic Separation Science(NoSSS) Symposium ITP 2015/NoSSS2015 08.30-09.03 Helsinkl, Finland The University of Helsinkl 基础/应用 35 33 2 17th Symposium on the Practical Applications for the Analysis of Proteins, Nucleotides and Small Molecules CE Pharm 2015 09.20-09.24 Brooklyn, NY, USA CASSS 应用 20 26 3 43rd International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques HPLC 2015 09.21-09.25 Beijing, CHN Reasearch Center for Eco-Environment Sciences, Chinese Academy of Sciences 基础/应用 9 18 4 31st International Symposium on MicroScale Bioseparations MSB 2015 04.26-04.29 Shanghai, CHN MicroScale Bioseparation 基础/应用 21 20 5 15th Asia Pacific International Symposium on Microscale Separations and Analysis APCE 2015 11.15-11.18 Tainan, Taiwan, CHN “National Cheng Kung University” 基础/应用 3 3 6 16th Beijing Conference and Exhibition on International Analysis BCEIA 2015 10.26-11.30 Beijing, CHN China Association for Instrumental Analysis 基础 5 2 7 中国化学会第十二届全国分析化学年会 05.08-05.11 武汉,中国 中国化学会、国家自然科学基金委员会 基础/应用 9 13 8 第二十届全国色谱学术报告会以及仪器展览 04.19-04.21 西安,中国 中国化学会色谱专业委员会、中国色谱学会 基础/应用 2 20

表1 CE相关的国内外会议 Table 1 Domestic and international conferences related to CE

会议报告中CE-MS联用技术在生物分析领域的研究较多,包括单细胞代谢组学研究、蛋白质修饰作用的鉴定、临床样本中肽类药物的痕量检测、通过CE-MS检测目标分子研究果蝇的行为等。也有少数提高CE-MS接口技术的报告,如应用大气压离子透镜提高CE-MS接口性能、应用毛细管电泳电喷雾离子化(CESI)-MS提高糖肽的分析灵敏度。

CE方法学研究内容广泛,其中CE表征肽核酸与单链DNA、蛋白质相互作用特点颇具新意。还有细胞及生物体内小分子的检测与分析:如细胞内痕量变价铜离子的检测、CE-LIF和CESI-MS分析铁调素及相关复合物。提高CE分析灵敏度的方法有:通过控制流动性使CE和LC/电喷射离子化MS信号增强;用二极管阵列检测器和280 nm高通滤波器降低毛细管等电聚焦的基线噪声。除此之外,还有应用CZE进行环状抗菌肽的分离和结构与迁移率关系研究以及CE-SELEX筛选适配体的方法研究。

CE在医药方面的应用主要包括临床样本、药物分析及代谢组学的研究。临床检测包括:在临床早期及治疗过程中对蛋白标志物的检测;用于治疗和美容的酶活性的测定;通过检测手指针干血斑对酒精性瘾者的筛选分析等。代谢组学的研究包括:CE-MS在转基因小鼠偏头痛模型中研究大脑皮层扩散性抑制后的血浆代谢分析;应用变性毛细管电泳进行癌症监测;基于CE-MS的肝癌代谢组学研究等。

CE在生命科学领域的研究包括对蛋白质、核酸、细菌及细胞代谢物的检测。代表性的研究有:动力学毛细管电泳-紫外-离子迁移谱联用(CE-UV-IMS)检测酶结构、酶活性及抑制程度;新型毛细管电泳间断分析混合物用以改良血清脂蛋白谱;甲状腺素和家族性淀粉样多发性神经病型的鉴别;自动序列进样毛细管电泳酶分析等。

标准是重要的技术语言和依据,在保障产品质量、提高市场信任度、促进商品流通、维护公平竞争等方面起着话语权的重要作用。标准分为国家标准、行业标准、地方标准和企业标准,级别依次降低。按照专业性质,又分为技术标准、管理标准和工作标准。此处介绍不同国家和不同行业中毛细管电泳方法作为技术标准的情况。

毛细管电泳法具有分辨率高、分析速度快、分离模式多、样品用量少、实验成本低等优势,在药物分析尤其是单克隆抗体分析中发挥了重要作用。自《美国药典》第24版的第二增补本(2000年5月1日颁布,同年7月1日正式实施)中收录毛细管电泳方法后,其相继被国际上主要的药典收录,成为抗体药物行业的重要方法标准。目前,在生物制药领域,毛细管电泳已经成为必不可少的方法标准,其用于单抗药的纯度分析、电荷异质性/等电点分析等已经被多国药典所采纳。我国2005年版和2010年版《中国药典》一部、二部附录收载了毛细管电泳的分离模式、仪器条件和系统适用性试验等相同内容。2015年版《中国药典》的生物制品(三部)部分对收录的毛细管电泳方法做了重要增修,拓展了毛细管电泳的使用范围。在通则部分:“毛细管电泳法(0542)”中,在2010年版基础上又增加了毛细管阵列电泳(CAE)和芯片式毛细管电泳(Chip CE)两种非单一通道的毛细管电泳法;新增的“单抗分子大小变异体测定法——CE-SDS法(3127)”中,指明了采用十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)紫外检测方法,在还原和非还原条件下,依据相对分子质量大小,按毛细管电泳法(通则0542),定量测定重组单克隆抗体产品的纯度。在总论部分:新增“人用重组单克隆抗体制品总论”中,规定了单克隆抗体的鉴别(CZE、cIEF)、糖基化修饰分析(CE)、分子大小变异体(CE-SDS)、电荷变异体(cIEF)均采用了多模式的毛细管电泳方法。在个论部分:在本版药典(三部)新增的“尼妥珠单抗注射液”中,规定了CE-SDS还原和非还原电泳法对免疫球蛋白纯度的表征。近年来,毛细管电泳法在各国药典中的使用,有利于推进此项技术在药物分析尤其是单克隆抗体及相关药物分析中的应用。

毛细管电泳方法标准的推广与毛细管电泳仪的产销关系密切。美国(Beckman、Agilent)和俄罗斯(Lumex)生产的毛细管电泳仪占据国内外市场主要份额。就目前我们掌握的数据看,俄罗斯及联邦国家的毛细管电泳方法标准最多,达20条,远远多于其他国家。他们的方法标准主要用于饮用水(4条)、饲料(6条)、食品(6条)和酒(4条)行业的相关产品及副产物的检测。他们的标准更新速度也很快(2015年的标准就有3条),预计5年内可使全部标准更新。我国自主生产的毛细管电泳仪数量少,性能低,普及、推广和使用程度不足,导致了我国毛细管电泳方法标准的数量不多、更新速度慢的现状。目前,我国只有抗体药尼妥珠单抗及进出口蜂蜜产品中有机酸和对苯二甲酸的质量监测的方法标准。未来应大力发展国产毛细管电泳仪,普及、推广和应用毛细管电泳方法标准。

当前毛细管电泳方法标准的总体情况是:1.因发展历史短,毛细管电泳方法标准目前仅有42条,远低于液相色谱法、气相色谱法等经典色谱技术的方法标准。2.目前颁布了毛细管电泳方法标准的国家和组织有美国(5条)、中国(3条)、乌克兰(3条)、斯洛伐克(2条)、法国(1条)、俄罗斯及联邦国家(20条)、其他国家(4条)、国际葡萄及葡萄酒组织(International Organization of Vine and Wine,简称OIV)(4条)。3.这些方法标准的分析对象主要是无机阴阳离子(10条)、氨基酸(5条)、有机酸(11条)、蛋白质(7条)。

特别值得关注的是,行业标准的制定是国家标准的重要参考。如:OIV建立了葡萄酒及其相关产品中的有机酸的毛细管电泳方法标准，美国、法国、俄罗斯及联邦国家在此基础上均制定了本国的葡萄酒及相关产品中有机酸的分析方法,并形成了国家标准。

综上所述,目前毛细管电泳技术的方法标准数量相对较少,应用领域较为集中。通过制定国际公认的行业标准,有助于推动毛细管电泳方法标准发展进程。

表 2列举了毛细管电泳法的相关标准。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 毛细管电泳法的相关标准 Table 2 Standards of capillary electrophoresis method Country No. Standard number Name Substrate Analytes USA 1 ASTM D7881-13 Test method for determination of 4-caraboxybenzaldehyde and p-toluic acid in purified terephthalic acid by high performance capillary electrophoresis with reverse voltage mode terephthalic acid 4-caraboxybenzaldehyde and p-toluic acid 2 ASTM D7882-13 Test method for determination of 4-caraboxybenzaldehyde and p-toluic acid in purified terephthalic acid by high performance capillary electrophoresis with normal voltage mode 3 ASTM D6508-10 Standard test method for determination of dissolved inorganic anions in aqueous matrices using capillary ion electrophoresis and chromate electrolyte aqueous matrices inorganic anions 4 USP Trastuzumab trastuzumab monoclonal 5 USP Rituximab rituximab antibody FRA 1 Accréditationn° 1-0769 Determination of malic acid, tartaric acid, citric acid, acetic acid and lactic acid in vins by capillary electrophoresis vins organic acid CHN 1 SN/T 1405-2004 Import and export of bee products in 10-hydroxy-alpha-decanoic acid test method of capillary electrophoresis method bee product 10-hydroxy-alpha-decanoic acid 2 SH/T 1687-2000 The determination of carboxybenzaldehyde and p-toluylic acid content in industrial purified terephthalic acid (PTA) by high performance capillary electrophoresis (HPCE) purified terephthalic acid carboxybenzaldehyde, p-toluylic acid 3 CP Nimotuzumab injection nimotuzumab monoclonal antibody RUS 1 ГОСТ Р 52756-2007 Rectified ethanol from food raw material. Determination of volatile nitrogen bases content by method of capillary electrophoresis food raw material volatile nitrogen bases 2 ГОСТ Р 52841-2007 Wine production. Determination of organic acids by capillary electrophoresis method wine organic acid 3 ГОСТ Р 52995-2008 Milk powder. Determination of soy and pea proteins using capillary electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-CE). Screening method milk powder soy and pea proteins 4 ГОСТ Р 53193-2008 Alcoholic and non-alcoholic drinks and beverages. Determination of caffeine, ascorbic acid and its salts, preservatives and sweeteners using capillary electrophoresis method alcoholic and non-alcoholic drinks and beverages inorganic small molecule 5 ГОСТ Р 31475-2012 Meat and meat products. Electrophoretic method of determination of soy proteins meat products soy proteins 6 ГОСТ 31941-2012 Drinking water. Methods for determination of 2,4-D drinking water 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 7 ГОСТ 31480-2012 Mixed fodders, raw mixed fodders. Determination of amino acids (lysine, methionine, threonine, cystine and triptophane) content by method of capillary electrophoresis mixed fodders, raw mixed fodders amino acids 8 ГОСТ 31483-2012 Premixes. Determination of vitamins: B1 (thiaminchloride), B2 (riboflavin), B3 (pantothenic acid), B5 (nicotinic acid and nicotinamide), B6 (pyridoxine), Bc (folic acid), C (ascorbic acid) content by method of capillary electrophoresis premixes vitamins 9 ГОСТ 31724-2012 Vodkas, special vodkas and water for their production. Determination of cations, amines, anions of non-organic and organic acids content by capillary electrophoresis method vodkas, special vodkas and water for their production cations, amines and anions 10 ГОСТ 31765-2012 Wines and wine materials. Determination of synthetic dyes by capillary electrophoresis method wines and wine materials synthetic dyes 11 ГОСТ 31867-2012 Drinking water. The determination of anions content by chromatography and capillary electrophoresis method drinking water anions 12 ГОСТ 31869-2012 Water. Methods for the determination of cations (ammonium, barium, potassium, calcium, lithium, magnesium, sodium, strontium) content using capillary electrophoresis water cations 13 ГОСТ 32050-2013 Food products. Methods for identification and determination of the mass fraction of synthetic dyes in candy food products synthetic dyes 14 ГОСТ 55569-2013 Feedstuffs, compound feeds, feed raw materials. Determination of proteinogenic amino acids using capillary electrophoresis feedstuffs, compound feeds, feed proteinogenic amino acids 15 ГОСТ 56374-2015 Feedstuffs, compound feeds, feed raw materials. Determination of mass fraction of ammonium, potassium, sodium, magnesium and calcium cations using capillary electrophoresis raw materials cations 16 ГОСТ 56375-2015 Feedstuffs, compound feeds, feed raw materials. Determination of mass fraction of chloride, sulfate, nitrate and phosphate ions using capillary electrophoresis anions 17 ГОСТ 56373-2015 Feedstuffs and fodder additives. Determination of mass fraction organic acids using capillary electrophoresis feedstuffs and fod-der additives organic acids 18 ГОСТ 32050-2013 Food products. Methods for identification and determination of the mass fraction of synthetic dyes in candy food products synthetic dyes 19 GOST31480-2012 Determination of lysine, methionine, threonine, cystine and tryptophan in mixed feed and feed ingredients by capillary electrophoresis feed amino acids 20 GOST R 55569-2013 Determination of amino acids in feed, compound feed and feed ingredients by capillary electrophoresis feed amino acids Slovak 1 STN 75 7430 Water quality. Isotachophoretic determination of chlorides nitrates, sulphates, nitrites, fluorides and phosphates in water water chlorides nitrates, sulphates, nitrites, fluorides and phosphates 2 STN 75 7431 Water quality. Isotachophoretic determination of ammonium, sodium, potassium, calcium and magnesium in water water ammonium, sodium, potassium, calcium and magnesium Ukraine 1 ДСТУ 4801:2007 Spirits and alcohol products. Determination of mass concentration of ammonium, potassium, sodium, magnesium and calcium with capillary electrophoresis spirits and alcohol products ammonium, potassium, sodium, mag-nesium and calcium 2 ДСТУ 4931:2008 Alcoholic beverages. Determination of mass concentration of caffeine and sorbic, ascorbic, benzoic acids with capillary electrophoresis alcoholic beverages caffeine and sorbic, ascorbic, benzoic acids 3 ДСТУ 4932:2008 Spirits and alcohol products. Determination of mass concentration of fluoride, chloride, nitrites, nitrates, phosphates, sulphates with capillary electrophoresis spirits and alcohol products fluoride, chloride, nitrites, nitrates, phosphates, sul-phates OIV 1 OIV-MA-AS313-18 Sorbic acid (capillary electrophoresis) (Oeno 4/2006) wine sorbic acid 2 OIV-MA-AS313-19 Organic acids and sulphates (capillary electrophoresis) (Oeno 5/2006 extended by Oeno 407-2011) organic acids and sulphates 3 OIV-MA-AS315-19 Glutathione content (Oeno 345/2009) glutathione 4 OIV-MA-AS315-24 Determination of lysozyme in wine using high-performance capillary electrophoresis (Oeno 385/2012) lysozyme Other international methods 1 ISO 17129∶2006 Milk powder. Determination of soy and pea proteins using capillary electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-CE)Screening method (2012) milk powder soy and pea pro-teins 2 EPA 6500 Dissolved inorganic anions in aqueous matrices by capillary ion electrophoresis aqueous matrices inorganic anions 3 Standardmethod 4140 Standard methods for the examination of water and wastewater water and waste-water water and waste-water 4 D6508-10 Standard test method for determination of dissolved inorganic anions in aqueous matrices using capillary ion electrophoresis and chromate electrolyte aqueous matrices inorganic anions

表2 毛细管电泳法的相关标准 Table 2 Standards of capillary electrophoresis method

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