色谱  2016, Vol. 34 Issue (7): 692-696   PDF (867 KB)    
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郑熠斌
黄百芬
任一平
正相高效液相色谱法测定食物中8种维生素E异构体及维生素A
郑熠斌2, 黄百芬1, 任一平1     
1. 浙江省疾病预防控制中心, 浙江 杭州 310051;
2. 浙江工业大学化学工程学院, 浙江 杭州 310014
收稿日期：2016-02-17
摘要：建立了正相高效液相色谱测定食物中8种维生素E异构体及维生素A的方法。样品中的维生素E异构体和维生素A经皂化和液液萃取,Waters ACQUITYTM UPLC BEH Amide色谱柱(150 mm×3.0 mm, 1.7 μm)分离,体积比为90 : 10的正己烷与叔丁基甲基醚-四氢呋喃-甲醇(20:10:1, v/v/v)为流动相,荧光检测器和紫外检测器串联检测。4种生育酚在5.0~60.0 mg/L(r2≥0.9999)、维生素A和4种三烯生育酚在0.5~6.0 mg/L(r2≥0.9996)范围内具有良好的线性,各基质中目标物的检出限在20~60 μg/kg之间;9个组分在各基质中的加标回收率为79.2%~114.2%,相对标准偏差(RSD)为1%~12%。该方法简便、灵敏、可靠、环保,可用于食物中8种维生素E异构体以及维生素A含量的同时测定。
关键词： 高效液相色谱法     维生素E异构体     维生素A     食品    
Simultaneous determination of eight vitamin E isomers and vitamin A in foods by normal-phase high performance liquid chromatography
ZHENG Yibin2, HUANG Baifen1, REN Yiping1     
1. Zhejiang Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310051, China ;
2. School of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China
Received: 2016-02-17
Abstract: A synchronous detection method was established by normal-phase (NP)-HPLC to separate and determine eight vitamin E isomers and vitamin A in foods. The sample was pretreated and then separated on a Waters ACQUITYTM UPLC BEH Amide column (150 mm×3.0 mm, 1.7 μm). The mobile phase consisted of hexane (A, 90%) and tert-butyl methyl ether-tetrahydrofuran-methanol (20 : 10 : 1, v/v/v) (B, 10%). The analytes were detected by UV and fluorescence detectors, identified and quantified with external standards. The linear ranges of tocopherols were from 5.0 mg/L to 60.0 mg/L (r2≥0.9999), and those of tocotrienols and vitamin A were from 0.5 mg/L to 6.0 mg/L (r2≥0.9996), while the LODs of vitamin E isomers and vitamin A were from 20 μg/kg to 60 μg/kg. The method is of high precision, stability and repeatability, and the recoveries were from 79.2% to 114.2%. This method is simple, accurate and suitable for the analysis of vitamin E isomers and vitamin A in foods.
Key words: high performance liquid chromatography (HPLC)     vitamin E (VE) isomers     vitamin A (VA)     foods    

维生素E(VE)与维生素A(VA)皆为脂溶性维生素,是人类与动物的基本营养素[1]。天然存在的维生素E,根据其色环上的甲基数目及位置的不同,可分为4种生育酚(α-T、β-T、γ-T、δ-T)以及相对应的4种不饱和形式的三烯生育酚(α-T3、β-T3、γ-T3、δ-T3)[2]。因此,维生素E包括8种异构体,不同的维生素E异构体的极性、生物学活性以及生理学作用也有所不同[3],如β-T和γ-T,后者的生物学活性只有前者的1/5,而新近的研究表明三烯生育酚具有特殊的生物学作用[4],但由于难分离常常被一起定量,因此分别定量各维生素E异构体具有重要意义。通常所说的维生素A[5]包括动物性食物来源的维生素A1、A2两种,是一类具有视黄醇生物活性的物质,VA视黄醇是目前主要的检测目标。维生素A与维生素E是机体的生长代谢不可或缺的营养元素[6]。而食品是人们日常生活中维生素A、E的主要来源[7]。

目前,食品中维生素A和维生素E的测定方法主要有高效液相色谱法[8]、气相色谱法[9]和液相色谱-质谱联用法[10]。气相色谱法的样品前处理过程复杂[11]，仪器测定温度高,准确度较差;液相色谱-质谱联用法设备昂贵,测定过程中需要加入同位素内标校正,因此不易推广。高效液相色谱法是检测维生素A、E的主流方法[12]。但现有的标准检测方法尚不能解决8种维生素E异构体的彻底分离问题,如β-T、γ-T会在同一保留时间出峰[13]。本研究发挥正相色谱法在分离异构体方面的优势[14],应用皂化法[4]对样品进行前处理,用Waters ACQUITYTM UPLC BEH Amide色谱柱(150 mm×3.0 mm,1.7 μm)代替常用的硅胶柱[15]进行正相分离,可同时分离8种维生素E异构体和维生素A。通过荧光检测器检测维生素E,紫外检测器检测维生素A,既提高了维生素A、E检测的选择性、灵敏度与准确性,又大大节省了流动相的使用量。与此同时,对样品前处理方法的优化明显减少了样品前处理所需的提取溶剂的使用量。本方法简便、灵敏、可靠、环保,可用于食物中8种维生素E异构体以及维生素A含量的同时测定。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Agilent 1290高效液相色谱仪,配荧光检测器/二极管阵列检测器(美国Agilent公司);正己烷(C6H14),色谱纯;叔丁基甲基醚(CH3OC(CH3)3),色谱纯;四氢呋喃(C4H8O),色谱纯;甲醇(CH3OH),色谱纯;乙醚(CH3OCH3),分析纯;石油醚,分析纯;Na2SO4、KOH、抗坏血酸、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT,分析纯,国药集团杭州化学试剂有限公司); Waters BEH Amide酰氨基柱(150 mm×3.0 mm,1.7 μm)。维生素A标准品(Sigma公司,纯度≥95%),维生素E标准品选用4种生育酚和4种三烯生育酚(北京振翔科技有限公司,纯度≥95%),奶粉质量控制样品NIST-SRM 1849a(Sigma公司)。本实验所用辣椒、猪肝、冰鲜水产品、坚果样品均购于当地超市。

50% KOH溶液的配制:将50 g KOH加入到50 mL水中,制得质量分数为50%的KOH溶液。待测样品制备:将样品缩分后均质,得均匀的待测样。

1.2 实验方法

准确称取2.0 g(精确至0. 01 g)样品于50 mL离心管中,加入5 mL纯水以及10 mL乙醇、0.5 g抗坏血酸、0.1 g BHT,混合均匀后加入5 mL 50% KOH溶液。避光下于80 ℃水浴中振荡皂化反应30 min。皂化后立即放入冷水浴中冷却,加入20 mL混合醚液(乙醚-石油醚(1∶1,v/v))提取溶剂,涡旋振荡6 min,转移混合提取液至150 mL分液漏斗中,再次用20 mL提取溶剂提取下层皂化液,合并提取溶液,用纯水水洗提取溶液至中性。提取溶液过无水硫酸钠,用100 mL旋蒸瓶接收,旋蒸至近干后用氮气吹干,用流动相转移并定容至5 mL容量瓶中,过0.22 μm滤膜,待色谱分析。

1.3 色谱条件

色谱柱:Waters BEH Amide酰氨基柱(150 mm×3.0 mm,1.7 μm);进样量:5 μL;流速:0.8 mL/min;柱温:30 ℃;荧光激发波长:294 nm,荧光发射波长:328 nm;紫外波长:325 nm。流动相:A相为正己烷,B相为叔丁基甲基醚-四氢呋喃-甲醇(20∶10∶1,v/v)混合溶液,以10%B等度洗脱。

1.4 标准溶液的配制

准确称取维生素A 10.0 mg、生育酚50.0 mg、生育三烯酚10.0 mg,用乙醇溶解并定容于100 mL的容量瓶中,得到标准储备液。将维生素A和E的混合标准储备液用流动相稀释成6个不同浓度的标准溶液:维生素A及4种三烯生育酚的质量浓度为0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 mg/L,4种生育酚的质量浓度为5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 mg/L。

2 结果与讨论
2.1 皂化条件的优化

在进行食品中的脂溶性维生素检测时经常会存在共存类脂化合物的干扰[16],皂化处理食品样品可较为有效地排除这些干扰。参考国家标准[17],当碱液质量分数为50%时,可以满足大部分样品完全皂化的要求。高温及延长皂化时间都有利于皂化反应完全[18],但温度过高不安全,皂化时间过长影响实验效率。在皂化前加入易溶于水的抗坏血酸和易溶于非极性试剂的BHT能够有效减少脂溶性维生素在操作过程中的损失[19]。最后选择5 mL 50% KOH溶液,在80 ℃恒温水浴中振荡反应30 min。皂化使维生素A、E以游离态存在,易在光照下氧化[20],因此实验在避光条件下进行。

2.2 提取溶剂的优化

本研究对液液萃取的提取溶剂进行了优化,结果如图 1所示。实验过程中发现,虽然纯乙醚也有较高的提取效率,但容易出现乳化现象,使后续的处理更为繁琐,且得到的回收率不稳定。所以本研究选用对维生素A和维生素E异构体都有较好提取效果的乙醚-石油醚(1∶1,v/v)为提取溶剂。

图 1 不同提取溶剂对目标物回收率的影响 Fig. 1 Influence of extraction solvent on the recoveries of the analytes
2.3 色谱条件的优化

对8种异构体进行完全分离是本文需要解决的关键问题之一。Kamal-Eldin等[21]尝试用硅胶柱、氨基键合硅胶柱、二醇键合硅胶柱在正相色谱条件下分离8种维生素E异构体。本研究尝试用酰氨基柱分离8种维生素E异构体,并做了条件优化,结果发现使用Waters BEH Amide色谱柱(150 mm×3.0 mm,1.7 μm)能很好地分离8种维生素E异构体,且峰形较好(维生素A都在δ-T3前出峰,且不对维生素E的分离产生干扰,见图 2)。所以选用Waters BEH Amide酰氨基柱作为色谱分离柱。

图 2 维生素A和维生素E混合标准溶液的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of the mixture standards of vitamin A and vitamin E isomers 1. α-T; 2. α-T3; 3. β-T; 4. γ-T; 5. β-T3; 6. γ-T3; 7. δ-T; 8. VA; 9. δ-T3.
2.4 线性范围

按1.4节要求配制8种维生素E异构体和维生素A的混合标准溶液系列。从低浓度到高浓度依次进样,所得标准曲线以及相关系数如表 1所示。生育三烯酚与维生素A在0.5～6.0 mg/L范围内、生育酚在5.0～60.0 mg/L范围内都具有良好的线性关系,相关系数(r2)在0.9996以上。

表 1 维生素A和维生素E异构体的线性方程和相关系数 Table 1 Linear equations and correlation coefficients (r2) of vitamin A and vitamin E isomers
2.5 方法的准确度、精密度和检出限

选择辣椒粉、猪肝粉、鲜鳗鱼、杏仁作基质样品,进行3个水平的加标回收试验,每个水平重复测定6次,计算8种维生素E异构体及维生素A的平均加标回收率。辣椒粉中的加标回收率为81.2%～103.6%,RSD为3%～7%;猪肝粉中的加标回收率为87.4%～106.5%,RSD为2%～6%;鳗鱼中的加标回收率为79.2%～104.3%,RSD为3%～11%;杏仁中的加标回收率为80.8%～114.2%,RSD为1%～12%。其中鳗鱼的加标试验结果如表 2所示。

表 2 鳗鱼样品中的加标回收率(n=6) Table 2 Spiked recoveries in sea eel samples (n=6)

选择奶粉标准物质(NIST-SRM 1849a),按新建立的方法进行6次重复测定,结果见表 3。维生素A和维生素E的测定结果在参考值范围内,相对标准偏差为1.7%～2.3%。

表 3 NIST-SRM 1849a奶粉质控样品中维生素A和维生素E的测定结果(n=6) Table 3 Contents of vitamin E isomers and vitamin A in NIST-SRM 1849a (n=6)

取6份2.0 g各基质样品,分别加入维生素A、E标准品0.25 μg,按本方法对样品进行前处理和测定,计算基质中的检出限、定量限。按S/N=3确定目标物的检出限,S/N=10确定目标物的定量限,结果见表 4。

表 4 维生素E异构体和维生素A的检出限与定量限 Table 4 LODs and LOQs of vitamin E isomers and vitamin A
2.6 样品的测定

选择辣椒粉、猪肝粉、冰鲜水产品、坚果等不同基质的代表性天然食物样品进行方法适用性验证,测定结果见表 5。

表 5 天然食物中维生素E异构体及维生素A的含量(n=6) Table 5 Contents of vitamin E isomers and vitamin A in various foods(n=6)

由表 5可见,生育酚与三烯生育酚在食物中分布广泛,特别是生育酚异构体的分布广且含量较高;三烯生育酚异构体的分布范围较窄,且含量较低,尤其是δ-三烯生育酚,仅在开心果样品中痕量检出。另一方面,坚果样品中的维生素E异构体的含量较动物源性食品中的种类更为丰富,是维生素E的优质来源。维生素A在食品中的分布也很广泛,在猪肝、鳗鱼等动物性样品中有着较高的含量。贻贝和辣椒粉样品的色谱图见图 3。

图 3 (a)贻贝和(b)辣椒粉样品的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of (a) mussel and (b) paprika samples Peak identifications are the same as in Fig. 2.
3 结论

本研究建立了正相HPLC同时检测8种维生素E异构体和维生素A的方法,分别用荧光检测器和紫外检测器检测维生素E异构体和维生素A,方法具有高灵敏度和高选择性。优化了前处理方法,减少了有机溶剂的使用量,实验废液明显减少,检测效率得到进一步提高。新建方法的重复性、准确度、精密度符合检测要求。本研究为研究食品中各类维生素E异构体以及维生素A提供了新的检测方法,为准确衡量居民日常膳食中的维生素E以及维生素A的有效摄入量提供了新手段。

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