我国中医药理论具有悠久历史,中医药文化博大精深。中药组方就是在中医理论指导下,根据病情需要,运用一定配伍方法将治疗某种病证的不同性能和功效的药物有机组合起来的过程[1]。作为中医药理论的精髓,中药组方以其独特的配伍规律与优越的药理疗效,在数千年的临床治疗中起到了关键作用。然而,由于中药成分复杂,中药组方更因不同药物之间的拮抗或协同、剂量差异、四气五味、升降沉浮等复杂作用而表现出特殊的复杂性,使其在揭示配伍原理及作用机制上存在很多困难,缺乏整体定量监控技术。这大大限制了中药走向世界的进程[2]。
中药组方指纹图谱是借助于色谱或光谱等现代分离分析手段,获得能够定性定量地揭示中药组方药效变化规律的整体化学成分的光谱图或色谱图。它对复杂中药成分体系进行整体的宏观量化分析,同时对组方入血的药效成分进行定性和定量监测,也同样对组方网络药理学进行预测,因此组方指纹图谱的首要任务是负责对方剂的量-效-毒相互关系的定量预测。通过中药组方指纹图谱分析方法与理论对中药组方进行研究不仅可以阐明组方的科学内涵及化学成分归属,更能改进方剂疗效,寻找最佳组方,这对于增加中医药的科技含量,增强中医可信度,推动中医药走向世界具有重大意义[3]。
近年指纹图谱技术得到了快速发展,中药指纹图谱能很好地体现中药成分的复杂性和相关性并做出一致与稳定的评价[4]。而中药组方指纹图谱技术则可以对组方中化学成分进行整体定量描述,通过比较配伍变化产生指纹图谱的差异来解释配伍规律,可以辅助并指导对于中药组方的研究。中药组方研究有以下特点: ①药效非加和性,即中药组方整体功效不等于方内各药及每药内各成分功效或其相加之和,存在药效协同或拮抗;②化学成分非加和性,即组方化学成分不是单味药化学成分的简单相加,水煎煮液存在溶液四大平衡作用(包括服用后与生命体间的该类作用); ③可归属性,即在各组分不能完全定性的情况下,利用色谱及光谱方法建立组方指纹图谱,可直接判断中药组方与单味药色谱指纹间的化学物质的归属分析[5];④定量可控性,可利用定量指纹图谱对中药组方进行整体质量控制和监控其变化规律;⑤组方指纹可预测性,即依据化学指纹的稳定性,根据固定色谱条件下采集的单味药指纹图谱可预测中药组方指纹图谱,孙国祥课题组系统地研发了组方指纹预测软件;⑥组方权重可预测性,中药组方指纹图谱分别能从定性和定量相似度两个方面计算各单味药对组方的贡献大小;⑦组方药效规律与化学指纹的相关性,中药组方指纹图谱规律能够解释中医方剂配伍的科学内涵;⑧组方质量的可控性,控制好组方指纹图谱能达到对组方药效的全面控制;⑨中药组方三平衡性,描述中药组方规律的组方指纹图谱存在质量平衡(物质流)、能量平衡(能量流)和药效平衡(信息流); ⑩中药组方的动态开放性,中药组方系统是一个动态开放系统,中药组方指纹图谱紧随方剂的量变而呈动态变化。中药组方有其独特规律,而揭示该规律的中药组方指纹图谱意义更为重要。
中药方剂与西药制剂的作用方式不同。西药强调特定分子结构产生特定的生物效应,即使不同化合物彼此相加,也能通过化学反应来分析,属于定量构效关系。而中药组方则强调不同配伍(包括药性、药味和剂量改变)将引起化合物群的变化,是起药效的化合物群在发挥整体作用。通过对中药组方指纹图谱研究可以整体表达这种变化,而不是单独表达某种化学成分。组方指纹图谱中包含整体信息,即控制某张组方指纹图谱就可以达到对组方药效的全面控制[6]。
对中药组方指纹图谱的研究就是以中药合理组方为目标,定性定量地揭示中药组方规律和药效变化规律,用以控制中药组方质量的一致性,以及中药组方制剂工艺优化和配伍药效的最优化。
通过定量指纹图谱技术控制单味药材、饮片和提取物及配方颗粒的质量已经成为一种常见方法。它可以用来鉴别中药材真伪,对质量优劣进行评价,可对相同药材不同产区、不同采收时间、不同炮制方法、不同用药部位进行区分辨别[7]。虽然指纹图谱在中药组方中的应用不及在中药原料质量控制中应用多,但近年来,指纹图谱用于中药组方质量评价、组方化学成分归属、组方配伍研究等目的的相关研究已经取得很大进展。中药组方指纹图谱研究目标主要表现在以下三方面。
中药成分的复杂性与多样性是其发挥特异疗效的基础,这对中药组方的质量控制提出了很高要求。指纹图谱作为评价多维组分复杂样品整体质量的有效控制方法,不但可以用于中药鉴定、炮制方法研究、药材采收季节研究等,还可以用于中药制剂、中药组方相关提取工艺、化学成分等研究。它对于评价成分复杂的中药组方及对其质量稳定性、均衡性等进行控制均较为有利[8, 9]。
中药临床组方和其质量涉及原料药材质量基础,以及对成方的工业化生产的过程控制,其中保证药效的最重要的环节就是组方化学成分归属分析、鉴别分析以及组方质量的定量相关性控制,这3点为中药组方指纹图谱研究的基本目标。目前,指纹图谱在中药真伪鉴定和整体含量测定控制方面已有很大进展,加强用计算机软件对组方分析的实验设计和组方指纹数据处理与预测,提升中药组方质量控制研究水平和节约全社会实验资源是可行且必要的。
由于组方配伍之后会改变原有化学成分,产生新化学物质,因此需要对化学成分进行归属。通过比较组方中不同中药配伍的指纹图谱,能够清晰地发现组方配伍后的色谱及光谱图中的有效成分来自于哪些中药材,以及产生了哪些新物质,这对于质量控制以及配伍规律的研究都是很有意义的。定量指纹图谱技术能有效监控化学物质归属的量值大小。同时,将中药组方化学指纹成分追溯到中药原料的化学成分信息,也就间接规定了中药原料的质量标准。
色谱指纹图谱能够清晰地反映中药组方中所含主要成分情况,具有特征性和指纹性[10]。任艳玲等[11]建立了逍遥散的HPLC指纹图谱,通过对各组方药材进行HPLC检测,以色谱峰相对保留时间为考察指标,对逍遥散抗抑郁有效部位指纹图谱中27个共有色谱峰进行归属,为其新药研发奠定基础。窦志华等[12]建立了茵陈蒿汤指纹图谱,对72个共有峰进行了标定,并通过保留时间和紫外光谱图与对照品相比对,对所有共有峰进行了组方药味归属分析,指认了其中15个成分,推测了42个成分的可能结构类别,为该方剂质量控制提供了依据。杨小秋等[13]通过对厚朴四君子汤颗粒的HPLC指纹图谱进行相似度评价,同时通过直观比对法对指纹图谱上的色谱峰进行归属,将其溯源到厚朴、人参、白术、茯苓和甘草五味药材。指纹峰中有4个可明确化学成分的归属,体现了厚朴四君子汤颗粒的整体特征。石钺等[14]利用HPLC及LC-MS/MS提供的色谱及离子碎片信息,对相同实验条件下的银翘散及其组方中各单味药色谱指纹图谱进行对比,实现了银翘散与其单味药中各组分归属分析。
中药组方将中药进行配伍组合,其形态及成分与中药材或中药饮片有所差异,因此不同于中药鉴定,对于组方鉴别必须是全面的。目前较多采用气相色谱(GC)、HPLC、毛细管电泳(CE)技术建立组方指纹图谱并用于鉴别研究[15],除此之外，HPLC-MS技术以及许多光谱技术也多用于指纹图谱对组方成分的鉴别。
朱求方[16]建立了复方阿胶浆的HPLC-MS指纹图谱。对于组方分析的色谱条件、质谱条件以及样品预处理条件进行了考察优化及方法学验证,同时对指纹图谱中各共有峰进行了归属与鉴别,系统地表征了各药材中的特征成分。董自亮等[17]建立华盖散制剂的HPLC指纹图谱并进行了制剂-药材谱峰匹配研究。共指认出盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、绿原酸、甘草苷、甘草酸等7个共有峰。建立的华盖散指纹图谱为其鉴别与质量控制提供了科学的评价方法。
指纹图谱质量控制模式能综合反映药材中各主要成分的相对含量[18],通过中药组方色谱图的整体面貌(如出峰时间、峰数、峰位以及各峰之间的比例等信息)对中药组方进行质量评价,比测定一种或几种成分所提供的信息更加丰富全面,是保证中药组方功效、实现中药现代化的关键技术之一。
胡玥珊等[19]测定了15批牛黄解毒片的高效毛细管电泳(HPCE)指纹图谱,按系统指纹定量法评价其质量,鉴别出9批质量合格,结果真实可靠。孙国祥等[20]采用线性指纹定量法建立了人参归脾丸的三波长HPLC指纹图谱,评价得出10批样品质量均为良好以上,制备工艺稳定。严慕贤等[21]建立了参芪降糖片多糖HPLC指纹图谱,10批样品相似度均在0.98以上,表明样品质量全部合格。车磊等[22]建立了桂附地黄丸毛细管区带电泳指纹图谱,以没食子酸峰为参照物峰,用系统指纹定量法鉴别了12批桂附地黄丸质量,得出7批质量合格,2批含量明显偏低,3批含量明显偏高。
中药组方配伍理论是历代医家在临床遣方用药的经验凝结,为中医药独特的理论。古代医家采用理论思辨与临床验证相结合的方法,探索组方配伍规律,从而指导临床实践[23]。然而,五千年来我们祖先苦心钻研、代代相传的国粹中医药,在国际化进程中却不断碰壁。基于中药组方配伍原则的中药制剂难以被西方国家所接受,归根到底是外国人无法理解并认同这些复杂的理论。对于中药不良事件,除了中药材本身问题,更源于中医药理论缺乏,未对症下药,从而造成严重后果。
运用现代实验方法将组方配伍理论科学地、客观地展现在人们面前,使配伍原则不再玄妙深奥、难以捉摸,是中药组方迈向世界的第一步。因此,运用定量指纹图谱技术对组方配伍规律进行研究是中医药现代化研究的重要组成部分,对于继承和发展中药配伍理论具有重要理论意义,同时也为更有效地指导临床和中药新产品研制提供依据,对于医药行业进步与发展意义重大。而使配伍理论科学化归根到底就是要阐明组方配伍与化学成分的定量关系以及中药组方药效物质基础。
对中药组方的研究离不开对化学成分的研究,组方中药味配伍后化学成分产生质与量的变化导致其药理学效应及体内代谢过程的改变,同单体有所区别[24]。方剂配伍包括君臣佐使、七情、十八反、十九畏、四气五味、升降沉浮、归经等理论。君臣佐使是组方配伍的基本原则。生化汤方中当归为君药,川芎、桃仁为臣药,炮姜为佐药,炙甘草为使药。陈永刚等[25]按照“君臣佐使”中医组方原理对生化汤不同配伍组方的药效与其化学成分指纹图谱间的关系进行了研究,通过对急性血瘀大鼠进行药效学观察得出生化汤活血化瘀的药效是使药炙甘草、臣药川芎中的化学成分与组方中其他成分协同作用的效果。高源等[26]对戊己丸药味配伍的特征图谱及其化学成分的变化规律进行了研究,从整体和局部上考察了不同配伍情况下方剂中化学成分的整体变化与含量差异。Liu等[27]建立了四君子汤的指纹图谱并利用质谱数据鉴定了其中3类主要活性成分,通过对比单味药与四君子汤全方指纹图谱的差异来解读主要活性成分的改变,发现四君子汤在配伍过程中会造成主要活性成分含量变化,为四君子汤配伍规律研究提供了依据。
指纹图谱不仅能表达质的特征,还能表达量的大小,由于中药样品化学成分的含量可以在指纹图谱中清晰地表征,因此近年来在中药组方药效物质基础研究中,指纹图谱发挥了越来越重要的作用[28]。
血畅宁组方是临床上治疗高血压及其并发症的一个验方,由龟板、熟地、丹参、田七、钩藤、瓜蒌六味中药配伍而成。林辉等[29]探索了组方中抗高血压有效部位,确定相关药效作用物质可能与皂苷类成分有关,所建立的血畅宁组方总皂苷HPLC指纹图谱能有效控制血畅宁组方有效部位总皂苷的质量。欣脉胶囊由山楂、银杏叶等五味中药组成,是一种安全有效治疗高血脂症的组方。丁银花等[30]通过建立全方、单味药、缺味药的指纹图谱,确定了欣脉胶囊降血脂的主要药效作用部位为单味药大蒜部位,同时采取乙酸乙酯萃取的全方部位也具有较好的药效作用,所建立的指纹图谱测定方法能较好地判别活性部位主要色谱峰与药材化学组分间的相关性。
随着中药现代先进技术、设备和方法的不断发展,传统组方往往不能适应现代医药事业发展的迫切需求。然而,目前中医药领域的创新能力不足,缺少对新组方新剂型研究的有效方法体系。在现代创新中药及饮片的研制中,指纹图谱表现出强大的科学性。这为中药组方传统剂型改进和新剂型研制提供了理论的支撑[31]。借助指纹图谱技术择取最优剂型已经成为目前中药方剂剂型研究的新思路。
通过指纹图谱技术辅助加减组方药材或是改变炮制方法,可以扬合理组方之所长,避缺陷组方之所短,指导组方剂型改进。
潘新等[32]建立了复方二神丸的HPLC指纹图谱,并对该复方的两味组成药物补骨脂和肉豆蔻分别经过盐炙及煨炙后进行比较研究,探讨经过炮制后的药物组成的复方二神丸在化学成分上的变化,以改进二神丸组方中药材炮制方法。尹莲等[33]在二妙丸基础上进行改进方(三妙丸、四妙丸、加味四妙丸)研究。通过建立二妙丸类方有效部位群GC、HPLC 4张指纹图谱进行组方药指纹的归属分析,利用HPLC-MS/MS、GC-MS/MS分析比较二妙丸有效部位共有峰数目、相对峰面积比值在配伍类方前后的变化。研究显示,基本方二妙丸是类方物质基础的主要来源,配伍后药效作用发生变化,各组方在具有共同作用的基础上又有个体差异,针对不同的病症可以有针对性地选择组方,这是对传统二妙丸组方的一次成功改进。
中药有效成分组(effective compound group)是近年来提出的中药药效物质基础研究的新对象,其概念与“组分中药”相当,具有药效化学物质基础基本清楚、质量可控性强、作用机制较明确等特点[34]。相比单一活性成分,其在一定程度上保持了中药多成分、多靶点的基本特点,在理论上能较好地阐明中药物质基础,在一定程度上代替中药组方[35]。
肖小河等[36]提出了基于指纹图谱技术寻找有效成分组的敲除/敲入思想。通过将有效成分组、剩余成分组及原药材组指纹图谱进行对比观察与药效学分析,寻找有效成分起效的浓度范围;最后,将各个有效组分按照最佳浓度或者叠加与协同增效效应模型进行配比,验证其活性,选择优者,形成“组分中药”。李翼飞等[37]对清开灵注射液进行了改进,研制了仅由栀子苷、黄芩苷、胆酸、珍珠母4种高纯度单体化合物组合而成的“精制清开灵注射液”,实现了中药有效成分组的构建。
对于中药组方指纹图谱的研究可从四方面进行:①通过定性定量相似度评价、聚类分析、主成分分析等数据分析方法对组方进行评价,此研究方法常用于组方指纹图谱的质量控制;②对组方进行拆方,通过对全方及缺药组方指纹图谱进行直观分析或是间接比对,分析化学成分有无改变;③在拆方研究基础上,通过血清药理学和血清药化学等研究方法得到血清指纹图谱,研究药物到达体内后,经历吸收、分布、代谢、排泄等生物转化后,中药组方与单一药物或化学成分的药效差异,进行谱效关系研究;④固定色谱参数后采集单味药指纹图谱和入血成分谱,以此为基础,用孙国祥教授正在开发的中药智能组方指纹专家系统4.0能基本预测组方指纹图谱和入血成分谱。
在药学研究中常常用到数学和统计学方法,通过设计或选择最优的程序和实验方法,并通过对化学测量数据的解析,能够获取最大限度的信息[38]。通过利用量化数据,参照化学模型提取特征变量,对数据进行预处理,从整体上对未知样品进行辨别,探究药物活性组分,可对中药原料整体分析,为其质量评价、控制和药效学研究提供参考[39]。
相似度法是目前最常用的对指纹图谱进行评价的方法。定性相似度常表示样本之间是与不是的渐进化状态,可以量化描述指纹图谱之间的相似性,相似度在0.9～1.0的为合格品;定量相似度是以标准指纹谱为比较标准,用来整体描述样品指纹相对于标准指纹图谱的整体标示百分含量,本课题组十多年来系统地建立了定量指纹图谱的多种科学评价方法,其中系统指纹定量法为组方指纹图谱定量化研究奠定了十分重要的基础。通过系统指纹定量法对中药组方化学成分分布比例、数量和化学成分整体含量差异进行评价,将中药样品定量划分为8个质量级别,能够为中药组方整体定量控制提供新的参考[40]。李晓翠等[41]建立了14批复方土荆皮酊指纹图谱,确定了13个共有指纹峰,其相似度均＞0.96。丁国瑜等[42]建立了逍遥丸HPLC数字化指纹图谱,以宏定性相似度Sm和宏定量相似度Pm评价逍遥丸质量,可清晰反映逍遥丸质量差异。程红等[43]对28批市售仙灵骨葆制剂的相似度进行评价,对其指纹图谱中16个主要色谱峰的峰面积数据进行比较,发现制剂中来自君药淫羊藿的成分淫羊藿苷的色谱峰面积有较大差异,定性相似度有小幅波动。指出产生原因可能与药材的产地、采收季节、储存条件等因素有关,为中药组方质量控制提供了参考。程新玮[44]采用HPLC法建立了六味地黄丸的特征指纹图谱,并通过指纹图谱的相似度分析及共有峰峰面积的主成分分析,比较了不同厂家及不同批次样品间指纹图谱的差异。分析结果表明，六味地黄丸的特征指纹图谱在一定程度上能反映出该中药制剂的特征,而且可以定性比较中药制剂中化学成分的差别,进而对不同厂家及批次的样品进行质量控制。
归属度法是对中药组方药效物质差异进行定性定量判别分析研究的方法。孙国祥等[45]提出了用多个指标表示归属度的方法:①归属度pi和逸出度qi; ②双定性相似度及其均值Sm和拟合定性相似度Ssyn; ③Jacard相似度(相似性比)Sb等。在对清热解毒注射液进行评价中发现组方中黄芩药材的贡献度最大,其次是龙胆、金银花、知母和栀子,为中药组方的进一步定量分析奠定了基础。经研究发现,龙胆泻肝丸中药材中贡献最大的同样是黄芩,其次是龙胆,为其生产质量控制提供新的指导方法[46]。
利用色谱方法获取中药组方及各药材的化学指纹图谱,通过指纹图谱中各相应色谱峰的相关性研究,建立组方与药材化学组成之间的联系,有助于提高中药组方质量控制水平,获取组方中化学组成、化合物类型等多种信息[47]。郑露露等[48]比较分析了不同元胡止痛系列口服固体制剂的HPLC指纹图谱,通过规定部分特征峰与其参照峰的相对峰面积最低限度,将各特征峰的峰面积与其参照峰峰面积进行相关性分析评价。胡柳等[49]采用指纹图谱相关性分析方法,以保留时间的相对偏差和紫外光谱信息作为相关性考察指标,对精制血府逐瘀丸指纹图谱进行了相关性研究。该方法能够准确地判别复方有效部位指纹峰的归属并获取有效部位的化学组成、来源和化合物种类等多种信息。
回归分析是研究一个或多个自变量与一个因变量之间是否存在某种线性或非线性关系的一种统计学分析方法。宋宗华等[50]利用SPSS软件的多重线性回归分析中的强迫引入法和逐步回归法处理苓桂术甘汤的指纹图谱,确定臣药桂枝中的桂皮酸、使药甘草中的甘草酸、君药茯苓中的去氢土莫酸为质量控制指标。池婕等[51]采用HPLC建立了7个厂家生产的雷公藤多苷片醋酸乙酯提取物的指纹图谱,并用偏最小二乘回归分析法分析谱效关系。根据不同药效指标下的分析结果定位不同药效峰,从而找出雷公藤多苷片中发挥免疫抑制的主要有效成分。
聚类分析是一种重要的无监督模式识别方法。它是按照不同对象之间的差异,根据距离函数的规律作模式分类,将相似性大的归为一类,相似性小的归到更大的一类,是中药质量评价中较为常用的方法[52]。养阴清肺糖浆作为中药复方制剂常用于治疗咽喉干燥疼痛、干咳少痰、痰中带血等病症。姜珊等[53]以市售11个厂家和同一厂家不同批次生产的养阴清肺糖浆为研究对象,建立HPLC指纹图谱并采用组件均连法,利用夹角余弦作为样品的测度对所得高效液相指纹图谱数据进行聚类分析,发现不同厂家的养阴清肺糖浆样品存在明显质量差异。孙国祥等[54, 55]分别建立了逍遥丸与柏子养心丸的毛细管电泳指纹图谱(CEFP)。对于采用不同优化方法的两种中药组方制剂通过聚类分析与系统指纹定量法评价质量,所建立的CEFP具有较好的精密度和重现性,可以为组方质量控制提供新的参考。
主成分分析是一种通过降维技术,用少数几个具有代表性的综合指标代替多个原始变量,化繁为简的多元统计分析方法;该法能够将有差异的样本进行分类,实现对信息的快速挖掘[56]。方芳等[57]根据复方黄白胶囊的质量标准现状,采用主成分分析法建立其多波长融合指纹图谱,并通过图谱比对和化学计量学分析,确认指纹图谱中共有峰的来源和化学成分的归属,为复方黄白胶囊的制备工艺改进和质量标准提升提供依据。孙国祥等[58]建立了速效救心丸五波长HPLC指纹谱,用均值法和主成分整合法分析五波长下各样品的定性定量信息,以系统指纹定量法鉴定了12批速效救心丸样品的质量。
拆方研究是基于药物作用性质与功效,把处方中的中药减去一味或几味以观察疗效变化的方法,通常被用来寻找有效成分。通过将组方拆成单味药组、阴性药物组或是根据配伍原则(君臣佐使、性味、药对等)进行分组研究,能够阐明其组方作用规律[59]。拆方比对法通过指纹图谱的峰数、峰位、峰形和峰的强度等峰的性质直接或是间接比较待测样品指纹图谱之间的差异来鉴别,可以更清楚地知道中药整体与单味药成分的起效与否,是目前中药组方理论研究最常用的研究方法[1]。
采用单味药拆方的方法对中药组方指纹图谱进行研究,通过比对单味药材色谱峰与全方色谱峰可以对全方中的有效成分进行归属。
姚志红等[60]对消炎利胆片进行拆方,将组方中单味药材(穿心莲、溪黄草和苦木)提取物的HPLC图谱叠加并比对,确定了消炎利胆片HPLC指纹图谱中31个色谱峰的组方中药来源。黄春跃等[61]研究了栀子厚朴汤颗粒的全方指纹图谱与组方中栀子、枳实、厚朴三味药材的单味药指纹图谱的相关性,为栀子厚朴汤颗粒指纹图谱的检测标准提供了依据。周安等[62]通过比对复方定志小丸及各单味药(人参、茯苓、远志、石菖蒲)正丁醇提取部位HPLC图的保留时间确定了部分共有峰和特征峰。黄修燕等[63]运用HPLC-DAD技术建立了“松友饮”颗粒的色谱指纹图谱方法,将“松友饮”颗粒与其组方药材(黄芪、丹参、枸杞子、焦山楂和炙鳖甲)的色谱指纹图谱进行直观比对,发现“松友饮”颗粒的HPLC谱峰主要来自于黄芪、丹参、枸杞子、焦山楂的化学成分,可能含有来自炙鳖甲的化学成分,但未能完全确认。
撤药拆方法就是通过撤除一味或多味药材从而设立阴性药物组对指纹图谱进行分析与研究[59],但撤药研究导致谱图色谱峰所显示的化学成分的差异不是绝对来源于撤除药材的,也有可能是来源于组方配伍产生的新化学成分。
刘曼等[64]采用撤药研究法从骨疏丹方中撤出一味或多味药物得到11个处方,对各处方进行HPLC指纹图谱分析,对主要色谱峰进行指认。研究发现淫羊藿在方中对促成骨样细胞增殖占有主导地位;骨碎补、蛇床子和丹参分别与淫羊藿伍用后,各处方的促细胞增殖作用与空白对照组相比活性有所增强,但无显著性差异;三味药的协同作用强于两味药,四味药伍用时促成骨细胞增殖活性达到最大。冯素香等[65]对由大黄、人参、葛根三味药材组成的脑脉通处方有效部位与各味药材相关性进行了研究。其方法是在同一色谱条件下分析有效部位、药材、部分对照品及阴性对照色谱图,如果某色谱峰在药材色谱图中出现,而在阴性对照色谱图的对应保留时间上缺失,则提示该色谱峰来源于该药材;如果该色谱峰在有效部位色谱图中也同时出现,且来自于有效部位的某色谱峰与某原药材的色谱峰的紫外吸收光谱相似,即表示有效部位中的这个色谱峰就来自于这味药材。
当组方中药材较多时,往往单味药拆方与撤药拆方法需要做很多次实验,费时费力,此时按照一定原则进行分组或是根据配伍原则进行拆方,也能为组方图谱研究提供帮助。
花汝凤[5]选君药、臣药、佐药、使药作为4个因素,以用药和不用药为两个水平,并考虑两两交互作用,采用正交设计进行配伍组合。通过制备全方汤剂,君药、臣药、佐药、使药汤剂,以及不同组合汤剂用于配伍研究,探讨补中益气汤配伍对化学成分的影响。吴昭晖等[66]对麻黄汤进行拆方组合后,从佐药、使药的有效成分苦杏仁苷、甘草酸的变化层面上阐述麻黄汤配伍规律,首次研究麻黄汤不同配伍对使药甘草指纹图谱发生的影响。研究结果为深入研究麻黄汤组方原理奠定了基础,也为方剂配伍规律的现代研究提供一个可借鉴的方法。
当组方中药材较少时,为了更全面地对指纹图谱进行分析,可以采取全面、多方式的拆方方法,这样得到的结果也是最科学、最准确的。
骨疏灵(GSL)是一种预防与治疗骨质疏松症的中药复方制剂,以淫羊藿为君药,牛膝和黄芪为臣药,牡蛎为佐药。桑冉等[67]采用中药特征指纹图谱技术对GSL进行分析,建立其HPLC特征指纹图谱,同时通过拆方对单味药材、缺味组方、全方以及对照品的特征指纹图谱的对比分析确定了20个特征共有峰的归属,为其质量控制标准以及药效物质基础研究奠定了基础。
谱效研究法是在数据分析法与拆方比对法的基础上,将指纹图谱主要色谱峰化学成分的研究与药理药效研究相结合以阐明组方中药药效物质基础的方法,近年来受到广泛关注[68]。中药指纹图谱不仅可以定量定性地反映中药整体化学信息,在将中药指纹图谱与中药药效评价相结合的基础上,中药指纹图谱还能反映相应药效相关成分,进而确定相应的药效物质基础[69]。目前对于谱效关系研究的方法主要有3种:①传统谱效关系研究法,即采用化学分离分析方法将中药组方分离成各个有效部位后进行指纹图谱表征与药效学筛选,进而揭示药效作用和指纹图谱的相关性,确定中药组方的药效物质的方法[70]; ②血清指纹图谱研究法,即用含药血清代替中药组方,采用血清药理学和血清药化学技术得到能够标志该中药组方药效成分特征的指纹图谱研究方法;③数学模型研究法,即运用合理的统计学方法建立数学模型,结合专业知识来分析指纹图谱与药效物质之间关系的研究方法。在不同情况下灵活地应用不同的方法,实现指纹图谱技术和药效评价系统两者的紧密结合,能够形成更有效的中药组方谱效关系研究模式,推动现代中药研究的快速发展。
传统的谱效关系研究方法将组方整体用不同的方式提取得到不同的有效部位,将各个有效部位采用动物实验进行药效学研究与指纹图谱相关性分析,可以在一定程度上揭示中药的药效物质。Liu等[71]对气血并治方的谱效关系进行了研究,通过化学分析和活性筛选,确定了气血并治方的主要活性成分。陈永刚等[25]从整体上考察各配伍组方化学成分指纹图谱间的差异,提出了13种有可能是生化汤药效物质基础的化合物。该谱效关系研究方法虽然简便,但具有很大的局限性,由于中药组方化学成分的复杂性及其与药效作用之间既有正相关性又有负相关性,化学成分之间还存在协同和拮抗作用,加上传统的化学方法所得的各个部位存在成分交叉的情况,因此难以有效揭示中药谱效关系,也无法准确揭示中药药效物质基础。
中药虽成分众多,但只有那些被消化吸收进入血液的成分或其代谢产物才有产生药效的可能[72],分析给药后血清中成分以了解中药及组方的体内直接效用物质,是进行中药组方谱效研究的有效途径。
近年来,对于中药血清中中药指纹图谱的研究逐渐增多,中药组方血清指纹图谱技术正逐步成熟,并在血清药化学、血清药理学和中药药代动力学的辅助下一起推动着中药药效成分及其作用机制向着明确化、清晰化方向发展[72]。窦志华等[73]建立了复方五仁醇胶囊及组方内五味子、三七、柴胡、叶下珠四味药的阴性制剂和单味制剂血清指纹图谱用于保肝作用谱效关系研究。吴环宇等[74]采用UPLC-QTOF/MS技术建立了大鼠口服黑顺片醇提物后的血清指纹图谱,探索指纹峰与药效随时间的变化规律,筛选附子抗心衰药效物质成分群,以期为阐释附子的强心作用以及建立质量评价体系提供实验依据。陈梅等[75]通过建立血清HPLC指纹图谱考察芍药甘草汤伍用的合理性。通过比较单味药与复方水煎液及复方含药血清HPLC指纹图谱的差异,发现白芍、甘草配伍后,两者生物利用度明显提高,存在相互协同作用。中药血清指纹图谱是目前高速发展的一种对中药药效成分、作用机制进行研究的有效方法,其应用前景十分广阔。
利用数学软件和计算机功能,找出指纹图谱色谱峰与药效之间存在的关系,将分离得到的各个部分进行组合(常用正交分析法),建立数学模型找出组合后的组分与药效之间存在的相关性是目前常用的谱效关系研究方法。比较常用的处理指纹图谱数据与药理数据的方法有:回归分析、相关分析、灰色关联度分析、聚类分析、主成分分析、典型相关分析等多种分析方法[76]。
许雯雯等[77]建立了气滞胃痛颗粒全时段多波长融合指纹图谱,采用拉丁超立方法对气滞胃痛颗粒中六味药材随机采样成不同比例组,测定各组药效信息并与各组HPLC指纹图谱化学信息用灰色关联度分析得出各色谱峰对抗炎活性的影响程度,再用基于误差反向传播算法(back propagation,BP)的人工神经网络进行拟合,建立谱效关系,为中药组方的质量控制和药效评价奠定了基础。陈璟等[78]以通塞脉微丸为研究对象,通过不同提取分离工艺制备中间提取物,然后利用色谱技术对不同工艺中间提取物的化学成分进行了初步解析,结合药效学实验数据,运用层次分析法探讨通塞脉微丸谱效相关性,构建了谱效相关性指纹图谱。魏航等[79]建立了基于灰色系统理论的中药色谱指纹图谱模式识别模型进行灰色关联分析,求出各待比较图谱与参照图谱的灰色关联度,应用“最大匹配度”原则的模式识别方法,探索其在色谱指纹图谱模式识别和质量评价中的适应性。
综上所述,中药组方的整体研究思路见图 1。
探讨指纹图谱和中药组方的相关性,并建立相应的关联方程,在此基础上开发相应的软件,可以实现对中药组方的预测。
由于中药组方由很多种药材组成,因此对组方进行分析的相关实验都十分繁琐复杂,从拆方提取到数据处理都涉及很多步骤。运用计算机软件可以减少重复的工作,节约时间,避免不确定性因素,使得对中药组方的分析更简便。Long等[80]建立了一种通过化学物质基础预测组方配伍理论中的寒热属性,并以此预测中药组方最佳配伍的数据库专家系统。目前,孙国祥教授正在开发中药智能组方指纹专家系统4.0软件,通过固定色谱参数后采集单味药指纹图谱和入血成分谱,预测组方指纹图谱和入血成分谱,为中药组方指纹图谱的研究提供便利。以逍遥丸为例,通过组方中八味中药的HPLC指纹图谱对组方全谱进行预测,预测组方指纹图谱(compound synthesize fingerprint,CSF)与逍遥丸对照指纹图谱的宏定性相似度Sm=0.854,宏定量相似度Pm=96.6%,表明所预测组方指纹图谱十分接近真实谱,预测对比图见图 2。
中药组方指纹图谱是近年来发展起来的新技术,其能较好地对中药组方规律和药效变化规律进行整体监测,并在多方面取得了重大应用。长久以来,中药国际化一直是我国长期不懈的追求,中药组方配伍规律和组方指纹图谱控制方法能阐明中药作用机理和规律,是打破国际学术界壁垒的有力武器。只有厘清中药组方作用规律和建立标准化质量控制方法才能跨越国际障碍。组方指纹图谱通过定性定量地比较组方配伍对应的指纹图谱差异来定性定量地揭示组方科学内涵,同时阐明组方药效物质基础与化学有效成分。基于HPLC、GC、MS等仪器设备,通过单一或联用技术手段来拆方研究谱效关系,同时结合化学计量学等方法来建立组方活性指纹图谱,能积极促进中药国际化。综上所述,组方指纹图谱技术在中药组方与配伍的质量控制方面具有广阔的应用前景与研究空间。随着对其方法与原理的深入研究,通过大力拓展新评价方法和药学信息学数据处理方法等,中药组方指纹图谱必将极大地加快中药现代化、规范化和国际化的进程。
2016,
Vol. 34 Issue (7): 715-725
PDF (1079 KB)
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