白藜芦醇(resveratrol,C14H12O3,5-(4-hydroxystyryl)benzene-1,3-diol)自然资源丰富,至少在21个科31个属的72种植物中发现[1],如:蓼科Polygonaceae植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.的干燥根茎和根、葡萄科植物葡萄Vitis vinifera果实的皮和籽、豆科Fabaceae植物花生Arachis hypogaea的种子等。白藜芦醇是一种生物活性很强的天然多酚类化合物,又称为芪三酚,是一种天然的抗氧化剂,可降低血液黏稠度,抑制血小板凝结和血管舒张,保持血液畅通,预防癌症的发生及发展,具有抗动脉粥样硬化和防治冠心病、缺血性心脏病、高血脂的作用[2-6]。植物中主要以反式异构体存在,有报道[7-9]反式异构体在光、热作用下可转化为顺式异构体,并有报道[10]前者的生理活性强于后者,但迄今尚未见报道光致异构化动力学及在不同介质溶液中稳定性的研究。本文以光照后达到平衡的反式异构体对照品溶液作为顺式异构体的对照品溶液,采用HPLC建立同时测定光照溶液中顺、反式异构体含量的方法,以测定室温避光和光照后不同介质中顺、反式异构体的含量,研究稳定性及动力学,以期为白藜芦醇的应用与开发提供研究基础。
Waters Alliance 2695 HPLC,配Waters 2996 PDA检测器(美国Waters公司)、Empower软件。
乙腈为色谱纯;乙醇、高氯酸、浓盐酸、无水枸橼酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠均为分析纯;水为重蒸水。
称取适量反式白藜芦醇(中国生物制品检定所,含量＞98.5%),用50%(v/v)乙醇溶液配制成1 mmol/L的反式对照品储备液,低温避光储存。
pH 1.2溶液:取含量为36%的盐酸8.5 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,调节pH至1.2; pH 4.0缓冲溶液:将0.1 mol/L枸橼酸溶液123 mL与0.5 mol/L磷酸氢二钠溶液77 mL混合,摇匀;pH 7.4缓冲溶液:将0.05 mol/L磷酸氢二钠溶液81 mL与0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液19 mL混合,摇匀。pH 9.0缓冲溶液:将0.002 mol/L的无水碳酸钠10 mL与0.002 mol/L碳酸氢钠90 mL混匀,调节pH至9.0。
异构化实验溶液准备如下。取反式对照品储备液适量,分别以pH 1.2水溶液、10%(v/v)乙醇溶液(pH 4)、50%(v/v)乙醇溶液稀释至30.0 μmol/L,置于无色普通透明玻璃瓶中,25 ℃室内自然光下放置,在0、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7 h分别取样以HPLC法进行测定。
避光稳定性实验溶液准备如下。取反式对照品储备液适量,分别以水溶液(pH 1.2、7.4、9.0)、10%(v/v)乙醇溶液(pH 4)、50%(v/v)乙醇溶液(pH 7.4)和50%(v/v)乙醇溶液稀释成30.0 μmol/L,置于棕色玻璃瓶中,25 ℃避光放置,在0、1、6、12、24、72 h取样以HPLC法进行测定。
低温避光稳定性实验溶液准备如下。取上述异构化实验溶液准备中的50%(v/v)乙醇溶液稀释的异构化溶液再继续在低温(4 ℃)下避光放置,分别在1、3、5、10、15 d取样以HPLC法进行测定,考察顺、反式溶液在低温下的稳定性。
反式异构体标准曲线溶液:取反式对照品储备液,以50%(v/v)乙醇溶液制成1.50、3.00、6.00、15.00、30.00、60.00 μmol/L的溶液,置于棕色玻璃瓶中避光保存。
顺式异构体标准曲线溶液:取上述反式异构体标准曲线溶液适量,置于无色普通透明玻璃瓶中,25 ℃室内自然光下放置5 h,取样以HPLC法进行测定。以初始反式异构体浓度减去相应平衡溶液中反式异构体的浓度,得到顺式异构体浓度依次为1.50、2.77、5.52、13.85、27.70、55.22 μmol/L。
色谱柱Kromasil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱温30 ℃;流速1.0 mL/min,进样体积10 μL。流动相0.05%(v/v) HClO4-乙腈(73∶27,v/v),检测波长285 nm(顺式)与304 nm(反式)。
以1.4节色谱条件测定反式异构体标准曲线溶液,结果显示保留时间为7.4 min的色谱峰对应的紫外吸收曲线在304 nm处吸收最大,以峰面积(y)为纵坐标,浓度(x,μmol/L)为横坐标,回归方程见表 1。结果显示在1.5～60 μmol/L浓度范围内线性关系良好,R2达0.999。测定顺式异构体标准曲线溶液(见图 1),结果显示在7.4 min处的吸收峰面积大幅减小,在11.2 min处产生一个新的色谱峰,所对应的紫外吸收曲线在285 nm处吸收最大,与顺式异构体的紫外吸收曲线一致,经液相色谱-高分辨质谱(超高效液相色谱仪,日本岛津公司;Q-TOF 5600质谱仪,配电喷雾离子源,美国AB公司;PeakView 1.2软件)分析,检索得化学式为C14H12O3。采集30 min色谱图,未检出其他色谱峰,未检出文献[9]报道的其他成分,原因可能是异构化条件有差异。以反式异构体回归方程计算反式异构体的浓度,然后与相应反式异构体的初始浓度相减,作为顺式异构体的浓度,顺式异构体的回归方程见表 1。结果显示在1.5～55 μmol/L浓度范围内线性关系良好。
同一溶液连续重复进样6次,峰面积的RSD小于0.5%,表示仪器性能良好。25 ℃下避光放置,测定0、2、4、8、16、24 h时的30 μmol/L顺、反异构体50%(v/v)乙醇溶液,峰面积的RSD均小于0.5%,说明在25 ℃避光时反式异构体稳定,顺、反平衡液稳定(见图 1)。平行配制6份反式异构体浓度为30.0 μmol/L的50%(v/v)乙醇溶液,分别进样分析,以峰面积代入反式异构体的回归方程计算浓度,反式异构体回收率达98.5%,方法准确性较高。顺、反式标准曲线溶液最低浓度点逐步稀释,以10倍信噪比时的浓度为定量限,以3倍信噪比时的浓度为检出限,结果见表 1。
基于药物分析检查之一的溶出度试验模拟胃酸液的pH、葡萄酒的酸度与酒精度,以及提取分离分析的常用介质,并考虑一般行为所处环境,本实验选择了pH 1.2水溶液、10%(v/v)乙醇溶液(pH 4)、50%(v/v)乙醇溶液作为白藜芦醇光致异构化试验介质,在室内自然光条件下进行异构化实验。
分别测定光致异构化溶液,结果显示:光照使反式转变为顺式的速度与溶液介质有关,pH越高转化速度越快,pH越高顺式比例越大;在测定时间内室温避光放置后顺式与反式达到平衡。测定低温避光稳定性实验溶液,结果显示顺、反式白藜芦醇在50%(v/v)乙醇溶液中低温(4 ℃)避光15 d内稳定,峰面积的RSD均小于0.5%,显示异构化达平衡后溶液稳定。
按转化率=$\frac{{{c}^{o}}-{{c}^{t}}_{trans}}{{{c}^{o}}}\times 100%$(c0:起始浓度,ctranst:某时刻的反式异构体浓度)公式,采用反式异构体浓度计算各时间点的异构化率,以时间为横坐标,转化率为纵坐标作图(见图 2)。
以浓度负对数对时间计算回归方程,结果显示,白藜芦醇在pH 1.2水溶液、10%(v/v)乙醇溶液(pH 4)介质中5 h,在50%(v/v)乙醇溶液介质中4 h线性关系良好,R2均大于0.995(见图 3)。
根据一级反应$\frac{{{c}_{A}}_{_{0}}}{{{c}_{A}}}=kt$(cA0:反应物起始浓度;cA:测定时反应物浓度;k:速率常数;t:时间)公式可得ln cA=ln cA0-kt,说明反式白藜芦醇光致异构化为一级反应,达到平衡前在pH 1.2水溶液、10%(v/v)乙醇溶液(pH 4)和50%(v/v)乙醇溶液中的速率常数依次为0.381、0.333、0.661 h-1。
在光致反式异构化达到平衡后,溶液稳定,采用顺式异构体标准曲线计算顺式异构体浓度,并求顺、反式异构体浓度的比值,以标准曲线制作项及光致异构化达平衡溶液所测定结果计算白藜芦醇在50%(v/v)乙醇溶液中的顺式与反式异构体的平衡常数,结果见表 2。
为进一步考察溶液介质对稳定性的影响,本实验以50%(v/v)乙醇溶液、10%(v/v)乙醇溶液(pH 4)、pH 1.2水溶液、50%(v/v)乙醇溶液(pH 7.4)、pH 7.4水溶液和pH 9.0水溶液为介质,在不同时间点依次分析各溶液,考察反式白藜芦醇溶液的避光稳定性。测定结果显示,不同于在其他介质中产生异构化现象,反式白藜芦醇在pH 9.0水溶液中快速变化并不产生异构化,HPLC检测避光放置1 h的溶液,在反式与顺式异构体保留时间处均未检测到色谱峰。
其他溶液中各时间点浓度的RSD依次为0.24%、0.34%、2.82%、4.25%和18.33%,结果显示反式异构体在50%(v/v)乙醇及10%(v/v)乙醇溶液(pH 4)中室温避光条件下72 h内保持稳定。但在酸性与偏碱性介质中,反式异构体室温避光时仍有转化现象,在pH 1.2水溶液、50%(v/v)乙醇溶液(pH 7.4)和pH 7.4水溶液中,随时间的增长浓度下降,在pH 7.4水溶液中尤为突出。比较不同pH溶液对反式异构体稳定性的影响,结果显示反式异构体在中性、偏酸性溶液条件下稳定,在偏碱性条件下反式异构体易转化;比较反式异构体在pH 7.4水溶液与50%(v/v)乙醇溶液(pH 7.4)中的浓度变化,结果显示反式异构体在乙醇浓度较高的溶液中更稳定。
以时间为横坐标,以浓度的负对数求回归方程,显示线性良好(R2＞0.995),说明反式白藜芦醇在pH 1.2水溶液、50%(v/v)乙醇溶液(pH 7.4)和pH 7.4水溶液中室温避光放置时,异构化仍为一级反应,速率常数依次为4.84×10-4、1.59×10-3、7.36×10-3 h-1,但异构化速率远远小于光照条件。
由于位阻效应,一般反式乙烯结构的稳定性较顺式的高,但白藜芦醇在非碱性溶液中光致异构化,由反式向顺式转化。参考文献[9]探讨了光致异构化的机制,认为在光作用下反式白藜芦醇乙烯双键的两个sp2碳电子沿碳-碳键旋转,至两个苯环在同一边,通过极性溶剂形成分子内氢键(见图 4),结构稳定性增加。通过测定光照反式白藜芦醇粉末实验进行验证,测定结果显示光照前后粉末含量无差异。
在强酸性溶液中,乙烯双键通过形成正碳离子打开,两苯环旋转至同一边,同样通过极性溶剂形成分子内氢键(见图 4),结构稳定性增加。
但在弱碱性溶液中,反式白藜芦醇快速分解,其溶液经HPLC-MS/MS分析尚未得到产物信息,其机理有待探讨。
本论文采用HPLC法进行了白藜芦醇光致异构化动力学研究及平衡常数测定,结果显示反式白藜芦醇光转化为一级反应;介质对白藜芦醇光转化速率及平衡常数均有影响,反式白藜芦醇在室温、避光、pH＜7的溶液中稳定。以光致异构平衡液制作回归方程,克服对照品缺乏的策略,简单方便,具有可操作性,但其合理性仍有待进一步考证。
2016,
Vol. 34 Issue (8): 783-787
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2016,
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