色谱  2016, Vol. 34 Issue (7): 703-707   PDF (1136 KB)    
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曾三妹
徐敦明
魏一婷
钟莉萍
全自动固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定食糖中的雌二醇
曾三妹, 徐敦明, 魏一婷, 钟莉萍     
厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 福建 厦门 361026
收稿日期：2016-03-08
基金项目：福建省自然科学基金项目(2014j01057)
通讯联系人： E-mail:xudm@xmciq.gov.cn.
摘要：建立了全自动固相萃取-高效液相色谱-串联质谱检测食糖中雌二醇含量的方法。食糖样品经水溶解后,用碱化乙腈提取,经HLB固相萃取柱净化,采用高效液相色谱-串联质谱分析,内标法定量。质谱分析采用电喷雾电离(ESI)负离子扫描,多反应监测(MRM)模式。雌二醇定量离子对为271.1/144.8和271.1/183.2,内标D2-雌二醇定量离子对为273.2/147.0。实验表明,经SPE柱净化后基质效应明显降低,样品中添加0.5~10 μg/kg的雌二醇,其回收率为83.9%~95.1%,相对标准偏差(n=6)小于10%。雌二醇的检出限为0.1 μg/kg,定量限为0.5 μg/kg。该方法提取效果好,具有良好的灵敏度、回收率和重复性。
关键词： 全自动固相萃取     高效液相色谱-串联质谱     雌二醇     食糖    
Determination of estradiol in table sugar by auto-solid-phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
ZENG Sanmei, XU Dunming, WEI Yiting, ZHONG Liping     
Technical Center of Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361026, China
Received: 2016-03-08
Foundation Item: Natural Science Foundation of Fujian Province (No. 2014j01057)
* Corresponding author. E-mail:xudm@xmciq.gov.cn.
Abstract: A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method was established for the determination of estradiol in table sugar. Sugar samples were dissolved in water, and extracted by alkaline acetonitrile, then cleaned-up using an HLB column. The resulting samples were detected under negative multiple reactions monitoring (MRM) mode, and quantified by the internal standard method. As the results showed, the matrix effects were depressed obviously after the purification. The limit of determination and the limit of quantification of the method were 0.1 μg/kg and 0.5 μg/kg, respectively. For all the tested samples, the average spiked recoveries ranged from 83.9% to 95.1%, and the relative standard deviations (RSDs, n=6) were lower than 10%. The method is quick, easy, effective, sensitive and accurate, and can meet the requirements of the determination of estradiol in table sugar.
Key words: auto-solid-phase extraction (auto-SPE)     high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)     estradiol     table sugar    

近几年,我国食糖的品种越来越多样化。目前市场上的红糖产品主要有益母红糖、产妇红糖、生姜红糖、大枣红糖等营养糖,因其风味独特且具有保健作用,深受特殊人群特别是女性和老年人的青睐。近日网络、微信等流传红糖中非法添加雌二醇,且含量是正常人体内含量水平的几百倍甚至上千倍[1]。雌二醇作为类固醇激素中活性较高的一种,具有促进性器官发育、排卵,以及促进第二性征发育等功能,大量使用会有皮肤状态改善、新陈代谢加快的作用,让人容光焕发[1]。但由于合成类固醇酷似人体内的激素,因此它可破坏正常的激素平衡,并由此产生一些副作用,例如导致男性女性化、丧失生育能力、肾脏损害、高血压、动脉硬化、肝脏和心脏疾病以及癌症[2]。

近年来,国内外食品分析工作者都十分关注激素的检测技术,发展了一些检出限更低、分辨率和灵敏度更高的测定方法。目前测定食品中激素残留的方法主要有气相色谱-质谱(GC-MS)法[3]、高效液相色谱(HPLC)法[4]和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[5-24]。GC-MS或HPLC分离可以提供待测物的特异性信息。然而,其衍生过程繁琐、费时,增加了数据的不确定性,而且激素是高沸点、低挥发性的物质,一般不适宜采用气相色谱法直接进行测定[6, 23]。LC-MS/MS法可提供待测物的结构信息,具有较高的灵敏度和选择性,因而是检测激素残留的理想方法。HPLC-MS/MS无需衍生步骤,可缩短分析时间,减少试剂成本。目前国内外文献报道用液相色谱-质谱联用方法检测激素主要针对尿液[25]、血浆[7]、动物源性食品[8-15]、饲料[16]、污泥[17]、化妆品[18-20]及水[21-23],而以食糖样品为分析对象的相关研究鲜有报道。

本文通过优化样品前处理及仪器分析条件,建立了食糖中雌二醇的HPLC-MS/MS测定方法。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

API5500质谱仪(美国AB公司)配Agilent 1290液相色谱仪(美国安捷伦公司); Phenomenex Kinetex C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μm)(美国菲罗门公司); HLB固相萃取柱(60 mg,3 mL,美国Waters公司); Reeko Fotector-06自动固相萃取系统(锐科科技有限公司); IKA涡旋振荡器(德国IKA公司);离心机(上海安亭科学仪器厂)。

雌二醇标准品(纯度＞95%,德国Dr. Ehrenstorfer公司),内标D2-雌二醇标准品(纯度＞92%,加拿大CDN公司)。甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色谱纯,Merck公司),其他试剂为分析纯。实验用水为去离子水。

标准溶液的配制:以甲醇为溶剂配制成1 mg/L的标准储备液,保存于4 ℃下。实验中根据需要进行稀释配制。

样品来自厦门市各大超市与厦门出入境检验检疫局日常送检样品。

1.2 样品的前处理

称取食糖样品约2.0 g(精确至0.01 g)于50 mL具塞离心管中,添加100 μL 10 μg/L同位素内标,加入5 mL水溶解,溶解完全后再加入5 mL乙腈与0.5 mL 100 g/L Na2CO3,旋涡5 min,以4 000 r/min的转速离心5 min,将乙腈层转移至20 mL的试管中,用氮吹仪在40 ℃下浓缩近干。加入3 mL体积分数为20%的甲醇水溶液,涡旋溶解后,待净化。净化由Reeko Fotector-06自动固相萃取系统完成。全自动固相萃取操作参数及流程见表 1。净化后的残渣用乙腈-水(1∶1,v/v)溶液定容至1.0 mL,旋涡溶解后,过0.2 μm微孔滤膜,供HPLC-MS/MS测定。

表 1 全自动固相萃取仪操作参数 Table 1 Operating parameters for auto-SPE instrument
1.3 色谱条件

流动相A: 5 mmol/L乙酸铵水溶液;流动相B:乙腈;柱温:35 ℃;进样量:10 μL;流速:0.3 mL/min。洗脱梯度:0～3.5 min,流动相A为70%;在3.6 min时流动相A变化至0,保持2.5 min;在6.1 min时,流动相A变化至70%,保持4 min。

1.4 质谱条件

扫描方式:电喷雾电离(ESI)源负离子扫描;检测方式:多反应监测(MRM)模式;雾化气压力:4.137×105 Pa;干燥气压力:4.137×105 Pa;气帘气压力:2.758×105 Pa;离子源温度:650 ℃;定量和定性离子、碰撞能量等参数见表 2。

表 2 雌二醇的质谱检测参数 Table 2 Parameters of MS/MS for estradiol
2 结果与讨论
2.1 样品前处理

在空白食糖中添加1 μg/kg的雌二醇后,用水溶解,采用不同的试剂(体积分数为80%的乙腈水溶液、体积分数为50%的乙腈水溶液和乙酸乙酯)对雌二醇进行提取试验。通过比较发现,用体积分数为50%的乙腈水溶液提取食糖中雌二醇的回收率可以达到68%以上。

还比较了体积分数为50%的乙腈水溶液作提取剂时,中性条件(不加Na2CO3溶液)和不同的碱性条件(分别加入0.5 mL 100 g/L Na2CO3溶液、1 mL 100 g/L Na2CO3溶液)对回收率的影响。结果显示,加入0.5 mL 100 g/L Na2CO3溶液碱性条件下的回收率较好,可达到87%以上。

以甲醇水溶液作为淋洗溶剂,能有效去除不保留和保留弱的杂质。对HLB固相萃取柱淋洗溶剂进行了优化,分别以体积分数为40%、50%、60%、70%和80%的甲醇水溶液作为淋洗溶液,结果表明,当以体积分数为70%的甲醇水溶液淋洗时,雌二醇被洗出约2%左右,而以体积分数为60%的甲醇水溶液淋洗时,待分析物质均未被洗出,此时可以很好地去除杂质,因此最终选择体积分数为60%的甲醇水溶液作为淋洗试剂。

2.2 固相萃取净化
2.2.1 固相萃取技术

提取净化技术如SPE、固相微萃取(SPME)、基质固相分散萃取(MSPDE)、微波辅助萃取(MAE)、超临界流体萃取(SFE)等不断应用于食品残留的分析。当前,SPE技术在残留分析中应用较为广泛。HLB固相萃取柱填料是由亲脂性的二乙烯基苯和亲水性的N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按照特定比例聚合成的大孔共聚物,为反相色谱填料,通过二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮来增加对极性物质的保留并提供很好的水浸润性。HLB固相萃取柱与普通C18反相萃取柱相比,具有更好的稳定性和广泛的pH适用性,操作性能更加稳定。因此,本文选用HLB固相萃取柱进行净化。

2.2.2 全自动固相萃取技术的应用

全自动固相萃取技术可以真正在无人值守的情况下完成固相萃取方法的应用,节约人工时间,同时能将实验中的人为误差降至最低,相对传统的固相萃取技术具有操作方便、稳定性强、环保等优点。本实验中全自动固相萃取的参数及流程见表 1。

2.3 色谱-质谱分析

在电喷雾电离源负离子模式下对雌二醇、D2-雌二醇进行一级质谱全扫描,得到雌二醇、D2-雌二醇分子离子,即母离子(见图 1);对分析化合物的母离子进行二级质谱分析(子离子扫描),得到碎片离子信息,即子离子(见图 2)。按照二级质谱图提供的子离子信息,选择雌二醇的定量离子对(m/z 271.1/144.8和271.1/183.2)和D2-雌二醇的定量离子对(m/z 273.2/147.0);然后优化雌二醇和D2-雌二醇二级质谱的锥孔电压(DP)、碰撞气能量(CE)等参数,使得母离子与子离子产生的离子对强度达到最大,得到分析物的二级质谱图。雌二醇、D2-雌二醇的多反应监测谱图见图 3。

图 1 雌二醇及D2-雌二醇的母离子Q1扫描图 Fig. 1 Mass spectra of estradiol and D2-estradiol with Q1 scan
图 2 雌二醇及D2-雌二醇碎片离子的二级质谱图 Fig. 2 MS/MS spectra of the product ions of estradiol and D2-estradiol
图 3 雌二醇及D2-雌二醇(0.5 μg/kg)的MRM色谱图 Fig. 3 Chromatograms of estradiol and D2-estradiol (0.5 μg/kg) in MRM mode
2.4 标准曲线与线性范围

用雌二醇标准溶液配制成质量浓度为0.1、0.5、1、10和50 μg/L的系列标准溶液。在本文所确定的实验条件下,进样10 μL,以目标化合物与内标化合物的浓度比为横坐标、目标化合物与内标化合物的峰面积比为纵坐标绘制标准曲线,得到线性方程Y=4.61X+0.77,相关系数为0.999 8,表明目标化合物在质量浓度0.1～50 μg/L内有较好的线性关系,且无背景干扰。如检测样品中雌二醇质量浓度超过50 μg/L,可做相应稀释后检测。

2.5 检出限与定量限

检出限(LOD)和定量限(LOQ)采用逐级稀释空白加标样品的方法来确定。以3倍信噪比(S/N=3)对应的目标化合物浓度作为检出限,以S/N=10对应的目标化合物浓度作为定量限。使用本方法检测雌二醇的LOD为0.1 μg/kg,LOQ为0.5 μg/kg。

2.6 回收率与精密度

取不同基质空白食糖样品2.0 g(精确到0.01 g)进行回收率试验,每种基质添加浓度分别为0.5、1和10 μg/kg,每个浓度平行测定6次,按照本方法进行检测。由图 4可知,目标化合物与基质杂质分离很好,不受基质杂质干扰。回收率和精密度结果见表 3。6种基质中雌二醇的回收率为83.9%～95.1%,相对标准偏差均小于10%。该方法的回收率和相对标准偏差均符合残留检测标准要求。

图 4 红糖样品的LC-MS/MS图 Fig. 4 LC-MS/MS chromatograms of a brown sugar sample
表 3 不同基质中雌二醇的加标回收率和精密度(n=6) Table 3 Spiked recoveries and RSDs of estradiol in different matrices (n=6)
2.7 实际样品检测

按照本方法对市场上购买的86个食糖样品进行了检测,未检测出雌二醇。

3 结论

本文建立了全自动固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定食糖中的雌二醇,用HLB固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱测定。利用建立的方法对实际样品进行了分析。方法的灵敏度高、回收率良好、操作简便、定量准确,能满足日常食糖样品中雌二醇含量的测定要求。

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