色谱  2016, Vol. 34 Issue (8): 788-794   PDF    
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正交设计试验优化高速逆流色谱分离制备玛咖中芥子油苷的条件
王亚钦1, 吴迪2, 赵学志1, 朱尘琪2, 郭爽2, 高杨亚雅2, 邱百灵2, 宋宇2, 韩南银2, 何洪巨1     
1. 北京市农林科学院蔬菜研究中心, 北京 100097;
2. 北京大学药学院, 北京 100191
收稿日期：2016-03-16
基金项目：农业部公益性行业专项项目（20130309）；北京市农林科学院科技创新能力建设专项（KJCX20140111）
通讯联系人： E-mail:nanyin.han@pku.edu.cn(韩南银) E-mail:hehongju@nercv.org(何洪巨)
摘要：基于高速逆流色谱（HSCCC）技术从玛咖中分离制备出两种芥子油苷，苄基芥子油苷（glucotropaeolin, GTL）和甲氧基苄基芥子油苷（glucolimnanthin, GLI）。使用正交设计试验对分离条件进行优化，采用高分辨质谱对制备的组分进行鉴定，采用高效液相色谱法（HPLC）对组分进行定量分析。确定了两个组分GTL与GLI的HSCCC最佳分离条件：溶剂系统为正丁醇-乙腈-200 g/L硫酸铵溶液（1:0.5:2.4, v/v/v），上相为固定相，下相为流动相，流动相流速2 mL/min，主机转速900 r/min，从玛咖根粗提物中一次性分离得到157.72 mg/kg纯度为97.9%的苄基芥子油苷和31.93 mg/kg的甲氧基苄基芥子油苷，固定相保留率达57.6%。该方法成本低，简便易行，样品损失量小，可大量循环进样制备。
关键词： 高速逆流色谱     正交设计试验     芥子油苷     玛咖    
Optimization of conditions for the isolation and preparation of glucosinolates from Maca by high-speed counter-current chromatography with orthogonal experiments
WANG Yaqin1, WU Di2, ZHAO Xuezhi1, ZHU Chenqi2, GUO Shuang2, GAOYANG Yaya2, QIU Bailing2, SONG Yu2, HAN Nanyin2, HE Hongju1     
1. Vegetable Research Center, Beijing Municipal Academy of Agriculture and Forestry, Beijing 100097, China ;
2. School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China
Received: 2016-03-16
Foundation Item: Research Projects of Agricultural Public Welfare Industry in China (No. 20130309); Innovation and Capacity-building Projects by Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences (No. KJCX20140111)
* Corresponding author. E-mail:nanyin.han@pku.edu.cn(韩南银) E-mail:hehongju@nercv.org(何洪巨)
Abstract: Glucosinolate is an important bioactive substance in Maca. In our study, two glucosinolates named glucotropaelin (GTL) and glucolimnanthin (GLI) were successfully separated from Maca with semi-preparative high-speed counter-current chromatography (HSCCC). For a best separation and better stationary phase retention, orthogonal experiments were carried out with the flow-rate of the mobile phase, ammonium sulfate concentration of biphasic solvent system, injection volume of crude extracts and the centrifugal speed of the apparatus as the four main factors. The separation was performed with the biphasic solvent system composed of normal butanol-acetonitrile-200 g/L ammonium sulfate solution (1:0.5:2.4, v/v/v) and the upper phase was used as the stationary phase and the lower phase as the mobile phase. The detection wavelength was set at 229 nm. The obtained optimum preparation conditions were that the mobile phase flow-rate was 2 mL/min, 500.00 mg crude extract was dissolved in 15 mL mobile phase, the ammonium sulfate concentration was 200 g/L and the centrifugal speed of the apparatus was 900 r/min. Under these conditions, a high efficiency separation of HSCCC was achieved, and 157.72 mg/kg of GTL and 31.93 mg/kg of GLI were obtained from the crude sample with a high stationary phase retention of 57.6%. The high performance liquid chromatography (HPLC) analysis showed that the purity of GTL was 97.9%. The identification and quantification of glucosinolates were completed by HPLC and mass spectrometry (MS). The established separation method is simple, less adsorption loss, lower cost and suitable for large scale separation of glucosinolates from Maca.
Key words: high-speed counter-current chromatography (HSCCC)     orthogonal experiments     glucosinolates     Lepidium meyenii Walp    

玛咖(Lepidium meyenii Walp,Maca)属十字花科独行菜属,生长于海拔3 000～4 500m的高原,是秘鲁中部安第斯山脉地区的传统作物,具有长期的种植和食用历史。玛咖中含有生物碱、芥子油苷、甾醇、玛咖酰胺、玛咖烯等多种营养成分[1],许多研究证明玛咖具有抗疲劳[2]、抗压力、抗抑郁、缓解更年期综合征、平衡血糖水平等作用[3]。

我国于2002年开始在云南丽江进行育种和种植实验,2011年我国卫生部批准玛咖粉为新资源食品[4]。近年来国人健康意识日益增强,玛咖产业规模与种类进一步发展。

近年来对玛咖的研究工作中,多数学者认为玛咖酰胺、玛咖烯、咪唑类生物碱、苄基芥子油苷及其分解产物异硫氰酸苄酯为其主要活性成分及特征物质[5, 6],其中,玛咖中芥子油苷的含量约为1%,高于其他十字花科植物。芥子油苷又称硫代葡萄糖苷,是十字花科植物中重要的次生代谢产物,其降解产物萝卜硫素是迄今为止发现的最强烈的Phase Ⅱ酶诱导剂,能使致癌基因失去作用[7]。艾中等[8]对国内主要产区玛咖中的芥子油苷进行检测,结果显示不同玛咖中主要芥子油苷组分相同,均含有苄基芥子油苷(glucotropaelin,GTL)和甲氧基苄基芥子油苷(glucolimnanthin,GLI)这两种芳香族芥子油苷(化学结构见图 1);甘谨等[9]采用高效液相色谱(HPLC)及液相色谱-电喷雾质谱(LC-ESI/MS)联用技术对云南产3种色型玛咖中芥子油苷的组成及含量进行了分析,结果也同样都含有GTL和GLI。

图 1 GTL和GLI的化学结构 Fig. 1 Chemical structures of GTL and GLI

高速逆流色谱(high-speed counter-current chromatography,HSCCC)是一种不使用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术,基于流体动力学原理,通过公转、自转(同步行星式运动)产生的二维力场,在高速旋转过程中提高两相溶剂的萃取频率和效率。将逆流色谱柱中的固定相所占体积和逆流色谱柱体积的比值定义为固定相的体积保留率,即Sf=Vf/Vc,溶剂系统的性质、流动相的流速、进样量、主机转速、实验条件的温度、公转半径、自转半径、螺旋管的直径与材质等都会影响到固定相的体积保留率。固定相体积保留率大于50%是最理想的,对于分配系数(K)值较高的样品来说,30%的保留率也可以得到一个满意的分离。由于高速逆流色谱不会对样品产生固相载体的吸附损失和变性影响,且分离量大,与HPLC相比,普通HSCCC进样量最多可达克级水平,是HPLC的数百倍,近年来在植物有效成分的分离与制备方面有广泛应用[10-17]。

本研究使用半制备型HSCCC对玛咖中芥子硫苷进行分离,采用正交设计试验对分离条件进行优化,采用高效液相色谱及高分辨质谱进行鉴定,最终优化得到的分离条件为玛咖中芥子油苷的大量分离制备及进一步开发利用建立了理论依据。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

TBE-300A半制备型高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司),配有TBP-5002泵、UV2000D逆流色谱专用紫外检测器(上海三为科学仪器有限公司)、聚四氟乙烯(PTFE)管分离柱(内径1.6 mm,分离体积280 mL),EasyChrom-1000色谱工作站(江苏汉邦科技有限公司); Shimadzu-LC-20AD高效液相色谱系统,配有LC-20AD型梯度洗脱泵、SIL-20A型自动进样器(10 μL)、SPD-20A型紫外检测器、LCsolution工作站、CTO-20A柱温箱;DIONEX Ultimate 3000型UHPLC (Thermo Fisher Scientific); Q Exactive Quadrupole-Orbitrap高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific,德国)。

黄玛咖根采集于云南丽江南溪基地。GTL对照品购自美国Sigma公司,提取及HSCCC分离用的试剂石油醚(60～90 ℃)、甲醇、正丁醇、乙腈、硫酸铵均为分析纯(北京化工厂),HSCCC分离用水为蒸馏水(18.2 MΩ·cm),HPLC分析用乙腈为色谱纯(Thermo Fisher Scientific,德国),实验用水为自制超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理

将黄玛咖根粉碎并过100目筛,按5 mL/g液料比投料,于超声功率600 W条件下使用石油醚超声脱脂2次,每次30 min,3 000 r/min离心15 min。取下层沉淀按5 mL/g液料比,于超声功率600 W条件下使用甲醇超声提取两次,每次30 min,3 000 r/min离心15 min;合并两次提取液,旋转蒸发浓缩至无醇味,加入适量蒸馏水溶解浸膏,将浸膏的水溶液置于冷冻干燥机中冻干成粉末,合并粉末并研磨均匀,得到粗提物,作为HSCCC待分离样品,置于-20 ℃冰箱内保存,备用。

1.2.2 样品溶液的制备

溶剂体系参考沈莲清等[18]分离芝麻菜种子中芥子油苷的溶剂体系,即正丁醇-乙腈-150 g/L硫酸铵溶液(1∶0.5∶2.4,v/v/v),通过实验进行调整优化。在分液漏斗中配制两相溶剂系统(正丁醇-乙腈-200 g/L硫酸铵溶液(1∶0.5∶2.4,v/v/v)),充分振摇后静置过夜,以上相为固定相,下相为流动相,使用前分别超声脱气15 min。将500.00 mg待分离样品粉末溶解于5、10、15 mL下相溶液中,超声加速溶解脱气5 min,备用。

1.2.3 正交设计试验优化法

在单因素实验的操作和分析基础上,参考相关文献[19, 20],本研究采取各因素相互独立的正交设计试验进一步优化各参数,最终得到更好的HSCCC分离条件。其中流速水平根据仪器自身特点及单因素考察结果进行相应调整确定,为提高分离度同时避免造成溶剂的浪费,选取了2、3、4 mL/min 3个水平;进样量大是高速逆流色谱的优点之一,但是样品浓度过高,形成“样品栓”的概率较大,且进样量体积过大,会使峰带变宽,固定相会出现流失,因此在单因素考察的结果上本研究中选取了较为居中的5、10、15 mL 3个水平;硫酸铵盐溶液的浓度对分离效果影响较为明显,主要起到盐析的作用,盐浓度越高,样品分离度越高,但是盐浓度过高不仅仪器本身难以承受,而且影响后续的实验进行,根据文献进行相应调整,确定了100、150、200 g/L 3个水平;主机转速主要受到仪器本身的限制,对于实验而言,转速越高,对固定相保留效果越好,因此选取了700、800、900 r/min 3个水平。

实验过程中将紫外检测波长调至229 nm处连续检测。以40 mL/min将溶剂系统上相泵入主机充满分离螺旋管线,待流出液检测峰形平稳后,开启循环水浴并将温度设置为25 ℃,打开主机电源,设置正向旋转及固定转速,主机开始转动的同时泵入流动相,并在管柱出口处用量筒收集流出液用于计算固定相保留率,待流动相从管柱流出且基线稳定后,将样品溶液由进样环注入,根据色谱图手动收集各峰组分,用于HPLC分析。

该正交设计试验以分离得到苄基芥子油苷和甲氧基苄基芥子油苷的量(mg/kg)、分离度以及固定相保留率为响应指标,考察流动相(下相)流速(mL/min,因素A)、进样量(mL,因素B)、硫酸铵溶液浓度(g/L,因素C)以及主机转速(r/min,因素D) 4个因素,每个因素设3个水平即L9 (34)(见表 1)。

表 1 高速逆流色谱分离玛咖芥子油苷的正交设计试验因素水平 Table 1 Factors and levels of orthogonal test for HSCCC separation of glucosinolates in Maca
1.2.4 GTL和GLI的鉴定

使用高分辨质谱对得到的组分进行鉴定。样品先通过UHPLC进行梯度洗脱分离,色谱柱为Thermo Hypersil Gold (100 mm×2.1 mm,1.9 μm),柱温35 ℃,进样量3 μL,流动相A为含有0.05%甲酸的超纯水,流动相B为含有0.05%甲酸的乙腈,流速为300 μL/min,洗脱梯度: 0～1 min,5%B; 1～9 min,5%B～90%B。样品进入质谱仪,采用ESI负离子模式进行离子化,喷雾电压-2.8 kV,鞘气35 au,辅助气体10 au,毛细管温度300 ℃,加热温度350 ℃。全扫描模式下分辨率70 000,扫描质量范围75~900; MS/MS模式下分辨率17 500,质谱二级碎裂碰撞能量(NCE) 30,分步碰撞能量(Stepped NCE) 50%。由于在HSCCC分离中所应用的溶剂体系盐浓度过高,所以对芥子油苷组分进行结构鉴定前先使用适量甲醇进行脱盐处理。

HPLC分析方法按何洪巨等[21]和胡丽萍等[22]分析硫代葡萄糖苷的方法进行适当调整。待分离样品和高速逆流色谱分离得到的各组分进行HPLC分析前先进行脱硫处理。取2 mL待分析样品经DEAE离子交换柱,用0.02 mol/L醋酸钠溶液2 mL冲洗离子交换柱。将离子交换柱转移至另一玻璃试管中,加入75 μL硫酸酯酶,在室温下封口过夜,次日用0.5 mL双蒸水清洗离子交换柱3次,流出液经0.45 μm滤膜过滤后用于HPLC分析。

HPLC分析使用Waters C18色谱柱(150 mm×3.9 mm,4 μm)，检测波长229 nm,流动相A为0.5 g/L四甲基氯化铵水溶液,流动相B为0.5 g/L四甲基氯化铵乙腈水溶液(水和乙腈的体积比为4∶1)。梯度洗脱程序:0～1.0 min,100%A;1.0～21.0 min,100%A～100%B;21.0～26.0 min,100%B～100%A;26.0～31.0 min,100%A。恒定流速1 mL/min,在31 min内可使芥子油苷全部分离。

按照以上条件使用GTL对照品制作标准曲线,根据保留时间和峰面积对玛咖中芥子油苷组分进行定量测定。

2 结果与讨论
2.1 HSCCC制备组分的结构鉴定

采用HSCCC方法从玛咖中分离得到两个主要组分,组分1和组分2(见图 2)。将HSCCC分离得到的各组分经HPLC和UHPLC-MS进一步分析鉴定。玛咖提取物经脱硫处理后的色谱图见图 3。

图 2 玛咖芥子油苷提取物的HSCCC谱图 Fig. 2 HSCCC chromatogram of glucosinalates in a Maca extract Operation conditions: the biphasic solvent system was normal butanol-acetonitrile-200 g/L ammonium sulfate solution (1∶0.5∶2.4,v/v/v),flow rate was 2 mL/min,injection volume was 20 mL,centrifugal speed was 900 r/min,and detection wavelength was 229 nm.
图 3 玛咖芥子油苷提取物与图 2中组分1和2的HPLC谱图 Fig. 3 HPLC chromatograms of glucosinalates in a Maca extract and Part 1 and Part 2 in Fig. 2 1. GTL; 2. GLI. Operation conditions: Waters C18 column (150 mm×3.9 mm,4 μm); the mobile phase was 0.5 g/L tetramethylammonium chloride aqueous solution (A) and water and acetonitrile (4∶1,v/v) containing 0.5 g/L tetramethylammonium chloride (B); the gradient elution was as follows: 0-1.0 min,100%A; 1.0-21.0 min,100%A-100%B; 21.0-26.0 min,100%B-100%A; 26.0-31.0 min,100%A (total run time 31.0 min); the flow rate was 1 mL/min.

经UHPLC-MS分析,组分1完形样品的准分子离子质量数([M-H]- m/z 408.042 9)与GTL的精确质量数(C14H18O9NS2,[M-H]- m/z 408.041 8)偏差小于2×10-6(2 ppm),脱硫处理样品的色谱保留时间与质谱信息均与GTL对照品的谱图相符,可确定组分1为GTL,见图 4。

图 4 组分1与GTL对照品的UHPLC-MS谱图 Fig. 4 Chromatograms and mass spectra of GTL standard and Part 1 by UHPLC-MS

组分2完形样品的准分子离子质量数([M-H]- m/z 438.053 7)与GLI的精确质量数(C15H20O10NS2,[M-H]- m/z 438.052 3)偏差小于2×10-6(2 ppm),其二级质谱含有硫苷类物质特征碎片;脱硫样品准分子离子质量数与GLI的[M-SO3]- 质量偏差小于4×10-6(4 ppm),并有合理的碎片。综上,组分2可定性为GLI(见图 5)。HSCCC分离得到的其他组分,通过色谱保留时间和质谱信息均未匹配到芥子油苷化合物信息。

图 5 组分2的UHPLC-MS谱图 Fig. 5 Chromatograms and mass spectra of Part 2 by UHPLC-MS
2.2 正交设计试验结果

采用HPLC对玛咖中芥子油苷提取物进行定量,通过GTL对照品拟合得到的标准曲线的线性方程为Y=5.690×106X+3.481×103,R=0.999 9,其中X代表质量浓度(g/L),Y代表峰面积。将HSCCC分离得到的组分进行HPLC分析,根据GTL线性方程和HSCCC分离组分体积进行换算得到单位质量的粗提物冻干粉中的GTL和GLI含量(mg/kg)。玛咖中芥子油苷HSCCC分离制备正交试验结果见表 2,用以评价分离结果的指标为GTL和GLI的含量以及分离度和固定相保留率。经HPLC分析定量和质谱鉴定,组分1中主要为GTL,组分2中主要为GLI。正交设计试验组中除第1组、第6组、第8组和第9组外,其他试验组基本实现了两组分的完全分离。

表 2 HSCCC分离制备GTL和GLI的正交试验结果 Table 2 Orthogonal test results of GTL and GLI by HSCCC

如表 2中结果所示,在第3组条件下,3项指标均高于其他试验组,即当流动相流速为2 mL/min,硫酸铵质量浓度达200 g/L,主机转速为900 r/min,500.00 mg样品用下相溶至15 mL进样时,分离得到的GTL和GLI含量最高,分别为157.72 mg/kg和31.93 mg/kg,且固定相的保留率高达57.6%,其HSCCC分离结果见图 2,保持运行状态第二次进样后,所得固定相保留率为55.9%,这一结果提供了有效的分离基础[23]。进一步分析,在GTL含量指标下,RA＞RD＞RB＞RC,可见流速和主机转速对于GTL的制备量影响较大;在GLI含量指标下,RC＞RD＞RA＞RB,可见分离体系的盐浓度对于GLI的制备量影响最大,盐浓度越高,GTL和GLI的分离效果越好,损失量越小;在分离度指标下,RC＞RA=RB＞RD,可见分离体系的盐浓度远大于其他3种因素对分离度的影响,盐浓度越高,得到越好的分离度。在固定相保留率指标下,RC＞RA＞RD＞RB,可见分离体系的硫酸铵浓度和流动相流速对固定相保留率影响大,盐浓度越大,流速越低,固定相损失越少。盐浓度增大起到盐析的作用,使得分离时间变长,分离效果更好,但是盐浓度过高对于后续的分析与结构鉴定带来不便,需进行脱盐处理;当流速增大时,分离时间明显缩短,但是两组分无法达到很好的分离度;转速在主机承受范围内越高对于固定相保留的效果影响越好;以500.00 mg粗提物冻干粉分别溶于不同体积的流动相中,相比于其他几种因素对于分离结果和固定相保留率影响较小,因此提供了大量进样工业化放大的思路。

3 结论

本研究基于高速逆流色谱技术,利用正交设计试验对玛咖中芥子硫苷的分离条件进行优化,得到的最优条件是溶剂系统为正丁醇-乙腈-200 g/L硫酸铵溶液(1:0.5:2.4,v/v/v),流动相流速为2 mL/min,主机转速为900 r/min,从玛咖根粗提物中一次性分离得到157.72 mg/kg纯度为97.9%的苄基芥子油苷和31.93 mg/kg的甲氧基苄基芥子油苷,固定相保留率达57.6%。分离组分经色谱和质谱分析,确定分离组分的结构并定量。本研究利用高速逆流色谱对玛咖中的芥子油苷进行分离,与传统分离方法相比,该方法由于没有固相载体引起的吸附作用,样品损失量小,成本低,而且进样量大,分离量大,分离体系平衡后可循环进样,可用于大量制备GTL标准品,具有良好的产业化发展前景。

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