脑心清是以柿叶乙酸乙酯浸出物为原料的纯中药制剂,有效成分主要为黄酮类[1-6]及有机酸类[7-8]物质,具有活血化瘀的功效,可用于治疗脉络瘀阻、眩晕头痛、肢体麻木、胸痹心痛、胸中憋闷、心悸气短等症状。脑心清在临床上对冠心病、脑动脉硬化症具有良好疗效,并具有一定的降血压、降血脂的作用,且长期服用未发现明显毒副作用[9-10]。梁敬仪等[11]采用HPLC法测定脑心清片中山柰素、槲皮素的含量;王少妹等[7]等采用HPLC建立了脑心清浸膏中原儿茶酸含量的测定方法;贝伟剑等[4]采用HPLC法测定了脑心清浸膏中金丝桃苷的含量;王莲等[12]采用比色法测定了柿叶中总黄酮的含量;盛晓静等[13]采用高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)法测定了柿叶中齐墩果酸及熊果酸的含量。以上文献中所采用的方法仅测定了脑心清或柿叶提取物中的少数成分,相比而言高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)法具有更高的专属性和灵敏度,可同时对多种成分进行准确的定量分析,并广泛应用于食品、药品等领域的分析检测[14-18]。如范晓苏等[17]建立了超高效液相色谱-串联质谱联用(UPLC-MS/MS)测定复方杏香兔耳风胶囊中10种有效成分的方法;蒋娅兰等[18]采用高效液相色谱-串联质谱联用(HPLC-MS/MS)法同时测定了银杏保健茶中16种黄酮类成分。脑心清中黄酮类成分种类繁多,且黄酮类及有机酸类成分的紫外吸收波长有所差异,因此本实验采用HPLC-MS/MS法同时测定了脑心清原料药浸膏中原儿茶酸、金丝桃苷、山柰酚-3-O- β -D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3-O- β -D-吡喃半乳糖苷、杨梅素、槲皮素、柚皮素和山柰酚8种有效成分的含量,同时该方法也适用于脑心清片剂的质量控制。该方法高效、快速,进一步完善了脑心清原料药浸膏及其制剂的质量标准研究。
Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司),API-5500质谱仪(美国AB Sciex公司),AE240电子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)。
乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯(美国Fisher公司);水(纯净水,杭州娃哈哈集团有限公司)。
脑心清原料药浸膏(沈阳药科大学宋少江教授实验室提供);脑心清片市售品(薄膜衣片,批号:K5A001、K5A002、K5A005);原儿茶酸、山柰酚-3-O- β -D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3-O- β -D-吡喃半乳糖苷对照品(上海源叶生物科技有限公司,纯度≥98% ),金丝桃苷对照品(中国食品药品检定研究院,纯度≥93.3% ),杨梅素、槲皮素、柚皮素、山柰酚、葛根素对照品(成都普菲德生物技术有限公司,纯度≥98% )。
色谱柱:Dikma Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相:乙腈(A),0.1%(v/v)甲酸水溶液(B)。梯度洗脱程序: 0～3.0 min,22%A; 3.0～10.0 min,22%A ～35%A; 10.0～15.0 min,35% A～90%A;15.0～20.0 min,90% A～100%A;20.0～21.0 min,100% A～22%A; 21.0～23.0 min,22%A。流速:0.8 mL/min;柱温:25 ℃;进样量:10 μ L。
离子源:ESI源;检测方式:负离子检测;扫描方式:多反应监测(MRM);喷雾电压(IS): -4 500 V;源温度(TEM): 650 ℃;气帘气(CUR)压力: 2.41×105 Pa;雾化气(Gas1)压力: 3.45×105 Pa;加热气(Gas2)压力: 3.45×105 Pa。8种分析物及内标的保留时间、离子对及其他质谱参数见表 1。
精密称取8种化合物对照品适量,置于同一容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得混合对照品储备液(原儿茶酸、金丝桃苷、山柰酚-3-O- β -D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3-O- β -D-吡喃半乳糖苷、杨梅素、槲皮素、柚皮素和山柰酚的质量浓度分别为 5 000、12 500、625、12 500、500、5 000、200和 2 500 μ g/L)。称取葛根素内标适量,置于50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,配制成 4 000 μ g/L 的内标储备液。分别吸取混合对照品储备液0.5、1、2、4、8、20 mL,置于50 mL容量瓶中,各加入内标储备液5 mL,用甲醇稀释至刻度,摇匀,制成含内标400 μ g/L 的系列混合对照品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ,于4 ℃冷藏保存。
精密称取脑心清原料药浸膏0.1 g,置于100 mL容量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,精密量取上述溶液2.5 mL于100 mL容量瓶,加入10 mL内标储备液,用甲醇稀释至刻度,用0.22 μ m微孔滤膜过滤,得供试品溶液Ⅰ。
取脑心清片10片,去除薄膜衣后,研细,同法配制,得供试品溶液Ⅱ。
本实验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液和0.1%(v/v)甲酸乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相时的分离效果。流动相中加入一定量的酸可改善待测组分色谱峰的峰形,当流动相为乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液时,各组分峰形良好,且能在短时间内洗脱出所有待测组分,提高分离效率,同时避免流动相酸性过强对仪器及色谱柱造成损害。因此最终选用乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相。
在质谱一级全扫描中发现,各化合物在负离子条件下产生的信号均比在正离子条件下产生强;在二级扫描中发现,金丝桃苷、山柰酚-3-O- β -D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3-O- β -D-吡喃半乳糖苷能够产生明显的特征苷元碎片,如m/z 301和285,更易于定量。因此本实验采用负离子多反应监测(MRM)模式保证化合物检测的灵敏度和专属性。
在优化的色谱条件下,供试品空白溶剂(甲醇)、混合对照品溶液以及供试品溶液Ⅰ、供试品溶液Ⅱ的色谱图如图 1所示。空白溶剂及片剂辅料均不干扰测定,说明方法的专属性良好。
吸取系列混合对照品溶液(Ⅰ~Ⅵ)各10 μ L,在优化的色谱条件下测定,以对照品的质量浓度(X,μ g/L)为横坐标,对照品峰面积与内标峰面积的比值(Y)为纵坐标,加权(1/X2)最小二乘法进行线性回归,得到回归方程(见表 2),各检测组分的线性关系良好(r＞0.99)。
将混合对照品储备液用甲醇逐级稀释后,在优化的色谱条件下测定,分别将信噪比为3(S/N=3)和10(S/N=10)时所对应的检测成分的含量定为检出限(LOD)和定量限(LOQ),结果见表 2。
取混合对照品溶液Ⅳ,在优化的色谱条件下测定,原儿茶酸、金丝桃苷、山柰酚-3-O- β -D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3-O- β -D-吡喃半乳糖苷、杨梅素、槲皮素、柚皮素和山柰酚的峰面积与内标峰面积比值的相对标准偏差(RSD,n=6)分别为1.1% 、1.3% 、1.9% 、1.1% 、1.1% 、1.3% 、1.3%和1.8% 。结果表明,仪器的精密度良好。
取脑心清原料药浸膏6份,按1.4.2节方法制备供试品溶液Ⅰ,在优化的色谱条件下测定,计算原儿茶酸、金丝桃苷、山柰酚-3-O- β -D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3-O- β -D-吡喃半乳糖苷、杨梅素、槲皮素、柚皮素和山柰酚的含量,上述含量的RSD(n=6)分别为1.1% 、0.6% 、1.4% 、1.0% 、1.9% 、0.6% 、0.9%和1.3% 。结果表明,方法的重复性良好。
取脑心清原料药浸膏适量,按1.4.2节方法制备供试品溶液Ⅰ,置于室温,分别于0、4、6、12、24、48 h进样分析,各组分含量的RSD(n=6)分别为1.4% 、0.4% 、1.3% 、1.5% 、1.4% 、0.4% 、1.8%和1.0% 。结果表明,供试品溶液在室温下48 h内稳定。
取已知含量的脑心清原料药浸膏6份,每份约0.1 g,分别精密称定并加入8种对照品适量,按1.4.2节方法制备供试品溶液Ⅰ,在优化的色谱条件下测定,计算样品中各待测组分的含量、回收率和相对标准偏差,结果见表 3。
分别取脑心清原料药浸膏3份及市售脑心清片3批,按1.4.2节方法制备供试品溶液Ⅰ、Ⅱ,在优化的色谱条件下测定,计算样品中各待测组分的平均含量,结果见表 4。
脑心清原料药浸膏中槲皮素、金丝桃苷及山柰酚-3-O- β -D-吡喃半乳糖苷的含量较多,脑心清片的检测结果也可得出相似结论。本实验操作简便、耗时短,该方法可为脑心清原料药浸膏及其制剂的含量测定提供理论依据。
本实验所建立的HPLC-MS/MS分析方法具有高灵敏度和专属性,能够高效、快速地对脑心清原料药浸膏中包括有机酸和黄酮类共8种有效成分进行定量分析,同时该方法可排除制剂中辅料等物质的干扰,因此也可作为脑心清片剂质量控制的检测方法,能够为脑心清原料药及其制剂的质量标准研究提供一定的参考。
2016,
Vol. 34 Issue (8): 773-777
PDF
2016,
Vol. 34 Issue (8): 773-777
PDF