柱前衍生-高效液相色谱法测定调制乳粉中左旋肉碱的含量


扩展功能
	加入收藏夹

	复制引文信息

	加入引用管理器

	Email Alert

	RSS
本文作者相关文章
	王巧玲

	于玥

	徐敦明

	张志刚

	方恩华

	冯峰

	张峰

	储晓刚

王巧玲¹, 于玥¹, 徐敦明², 张志刚², 方恩华², 冯峰³, 张峰³, 储晓刚³

1. 二连浩特出入境检验检疫局, 内蒙古二连浩特 011100;
2. 厦门出入境检验检疫局, 福建厦门 361026;
3. 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所, 北京 100123

收稿日期：2016-03-18

基金项目：质检总局公益性行业科研专项项目(2012104002);福建省自然科学基金项目(2014J01057);检验检疫行业标准项目(2014B087)

通讯联系人： Tel:(0592)7250900,E-mail:Xudm@xmciq.gov.cn.

摘要：建立了柱前衍生-高效液相色谱(HPLC)测定乳制品中左旋肉碱含量的方法。试样经0.1 mol/L盐酸超声提取后,采用阳离子交换固相萃取柱净化,在三乙胺和氯甲酸丁酯的催化下与L-丙酰胺-β-萘胺发生取代反应,使用配有二极管阵列检测器(DAD)的高效液相色谱仪测定,外标法定量。该方法在0.250~50.0 mg/L范围内线性关系良好,线性方程为y=164.4x-11.3,相关系数为0.9998,加标回收率为84.3%~86.0%,相对标准偏差为1.93%~3.18%。该方法的检出限为10 mg/kg,定量限为25 mg/kg。运用该方法对国内20个实际乳粉样品中的左旋肉碱含量进行测定,20个样品中均检出了左旋肉碱,含量为53~163 mg/kg。该方法快速、简便、准确,适用于乳品中左旋肉碱含量的检测。

关键词：高效液相色谱左旋肉碱调制乳粉衍生化

Determination of L-carnitine in dairy products by high performance liquid chromatography coupled with pre-column derivatization

WANG Qiaoling¹, YU Yue¹, XU Dunming², ZHANG Zhigang², FANG Enhua², FENG Feng³, ZHANG Feng³, CHU Xiaogang³

1. Erlianhot Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Erlianhot 011100, China ;
2. Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361026, China ;
3. Institute of Food Safety, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China

Received: 2016-03-18

Foundation Item: Public Science and Technology Research Funds Project of AQSIQ (No. 2012104002); Natural Science Foundation of Fujian Province (No. 2014J01057); Inspection and Quarantine Standards Project (No. 2014B087)

^* Corresponding author. Tel:(0592)7250900,E-mail:Xudm@xmciq.gov.cn.

Abstract: A method has been established for the determination of L-carnitine in dairy products by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled with pre-column derivatization. The samples were extracted by ultrasonator with 0.1 mol/L HCl as extraction solvent, and purified by a cation exchange solid phase extraction column, undergone a substitution reaction with L-propionamide-β-naphthylamine catalyzed by triethylamine and butyl chlorocarbonate. Then, the compound was detected by HPLC, with a diode array detection (DAD) as quantitative method. A linear calibration curve was obtained in the mass concentration range of 0.250-50.0 mg/L. The linear equation was y=164.4x-11.3 with the correlation coefficient of 0.9998, and the recoveries were 84.3%~86.0% with the relative standard deviations (RSDs) of 1.93%~3.18%. The limit of detection (LOD) was 10 mg/kg, and the limit of quantification (LOQ) was 25 mg/kg. The proposed procedure was then applied to the analysis of 20 real samples collected from China, and the contents of L-carnitine were 53-163 mg/kg. This method is rapid, simple, accurate and suitable for the determination of L-carnitine in dairy products.

Key words: high performance liquid chromatography (HPLC) L-carnitine dairy products derivatization

左旋肉碱(L-carnitine),又称L-肉碱、L-肉毒碱、维生素Bt,是一种白色晶状体或白色透明细粉,稳定性较好,有较好的溶水性和吸水性。左旋肉碱存在于大多数哺乳动物组织中,属于类维生素的营养素,与动物体内的脂肪酸代谢密切相关,是一种具有调节线粒体内酰基比率、促进脂肪酸β-氧化、抗疲劳排毒和促进支链氨基酸正常代谢等多种生理功能的氨基酸物质^[1]。

左旋肉碱在维持婴儿生命及促进婴幼儿发育的某些生理过程中也具有一定功能,如生酮作用、氮代谢等方面^[2]。由于婴儿自身合成左旋肉碱的能力较弱,只有成人的15%,所以每日给婴儿补充左旋肉碱是必需的。母乳作为婴儿的主要食物来源，其中的左旋肉碱含量较高，但随着社会的发展,许多母亲由于工作等原因不能母乳哺喂婴儿,往往选用市售奶粉喂养婴儿,因此需要在婴儿配方食品中添加适量的左旋肉碱以满足其生理需要。

当前,世界上已有22个国家和地区允许在婴儿奶粉中添加左旋肉碱^[3]。我国也规定可在婴幼儿奶粉中添加适量的左旋肉碱,以满足婴幼儿的生理需要。国家强制性标准GB 14880-2012^[4]中规定了左旋肉碱在儿童用调制乳粉中的添加量为50～150 mg/kg,其他用途调制乳粉中的添加量为300～400 mg/kg。在GB 10765-2010^[5]及GB 10767-2010^[6]中对食品的基体都没有特殊要求,均规定食品中左旋肉碱为可选择性成分,如需添加,最小添加量为0.3 mg/100 kJ。

目前,国内外关于左旋肉碱的检测方法主要包括分光光度法^[7-10]、离子色谱法^{[3, 11]}、液相色谱法^{[12, 13]}、液相色谱-串联质谱法^[14-16]。其中分光光度法需酶解过夜,检出限高、反应效率较低;离子色谱法特异性差;液相色谱-串联质谱法准确性高,但是仪器昂贵,成本高。本文通过优化提取方法、衍生反应条件等因素,建立了特异性强、灵敏度高的衍生化-高效液相色谱法,适用于乳品中左旋肉碱含量的定量检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司),配有二极管阵列检测器(DAD);离心机(美国戴安公司):转速不小于15 000 r/min;分析天平(赛多利斯):感量分别为0.01 g和0.1 mg;固相萃取装置(美国Supelco公司);氮吹浓缩仪(美国Caliper公司);超声波清洗器(上海分析仪器厂); pH计(上海分析仪器厂): 精度为pH 0.01。

乙腈、甲醇、三氯甲烷(色谱纯,德国Merck公司); L-丙酰胺-β-萘胺(L-Ala-β-NA,纯度大于98%,Fluka公司);盐酸、碳酸氢钠、磷酸二氢钾为优级纯;氨水、磷酸、氯甲酸丁酯、三乙胺为分析纯。实验用水符合GB/T 6682-2008规定要求。标准品:左旋肉碱,CAS号:541-15-1,纯度大于98%,Sigma公司。

称取适量标准物质,用乙腈-水(90∶10,v/v)溶液配制成质量浓度为1 g/L的标准储备液，-4 ℃以下避光保存。根据实验需要用乙腈稀释标准储备液,配成适当浓度的标准工作溶液。

混合型阳离子交换固相萃取柱(mixed-mode cation ion exchange SPE): Oasis MCX (3 mL/60 mg,Waters公司),使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 10 mmol/L盐酸对SPE柱进行活化。

衍生化试剂的配制:称取0.50 g三乙胺以三氯甲烷定容至100 mL,配制成催化剂Ⅰ;称取0.50 g氯甲酸丁酯以三氯甲烷定容至100 mL,配制成催化剂Ⅱ;称取0.45 g L-丙酰胺-β-萘胺以乙腈溶解定容至100 mL,配制成衍生试剂。

1.2 样品处理

1.2.1 提取

准确称取5.00 g样品于50 mL容量瓶中,加入30 mL 0.1 mol/L的盐酸溶液,涡旋振荡1 min,超声提取15 min后,以0.1 mol/L盐酸溶液定容至50 mL。取1 mL提取液于20 mL试管中,加入9 mL乙腈,涡旋混匀1 min后取部分于5 mL离心管中,15 000 r/min离心5 min,所得上清液待净化。

1.2.2 净化

准确移取1 mL待净化的上清液于活化好的阳离子固相萃取柱中,以1滴/s的速度过柱,用3 mL 10 mmol/L的盐酸水溶液淋洗,弃去淋洗液,真空抽干1 min,用2 mL 4%(体积分数)氨水甲醇溶液洗脱,收集洗脱液于15 mL离心管中,40 ℃下氮气吹干,所得残渣待衍生。

1.2.3 衍生

在残渣中加入0.5 mL衍生试剂,超声1 min溶解残渣并混匀,再依次加入0.5 mL催化剂Ⅰ和0.5 mL催化剂Ⅱ,涡旋混匀3 min,室温下静置反应40 min后,加入1 mL 50 mmol/L碳酸氢钠水溶液,涡旋混匀3 min终止反应,萃取反应产物。4 000 r/min离心5 min,取上层水相过0.22 μm有机系滤膜,供液相色谱测定,测定需在12 h内完成。

1.3 HPLC条件

色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18 (100 mm×4.6 mm,3.5 μm);流动相:乙腈-磷酸二氢钾缓冲液(50 mmol/L,pH 2.8)(体积比为25∶75);流速:0.8 mL/min,保持12 min;柱温:35 ℃;进样量:10 μL;检测波长:244 nm,参考出峰时间:3.8 min。

2 结果与讨论

2.1 衍生试剂的选择

使用DAD对左旋肉碱标准品进行全波长扫描,发现左旋肉碱在190 nm下吸光度最高,随着波长增加吸光度逐渐减小,230 nm几乎无吸收,而且干扰峰较多、检出限太高,因此采用柱前衍生的方法测定乳品中的左旋肉碱。

左旋肉碱属于类氨基酸物质。氨基酸衍生试剂2,4-二硝基氟苯常与氨基酸的氨基发生氢的取代反应,实现氨基酸的衍生。但左旋肉碱的氨基上已连有3个甲基,发生取代反应很难,2,4-二硝基氟苯并非左旋肉碱理想的衍生试剂。因此考虑在左旋肉碱羟基或者羧基上发生的衍生反应。目前已有报道^{[17, 18]}的两种衍生方法,衍生试剂分别是芴甲氧羰酰氯(FMOC)和L-Ala-β-NA,实验对比了两种衍生反应方案。

2.1.1 FMOC衍生法

在碱性条件下,FMOC常与左旋肉碱羟基上的氢发生取代反应(见图 1)。衍生产物测定波长为263 nm。使用FMOC作衍生试剂,其反应产物的紫外吸收强度较弱,不便于测定较低浓度的样品。

图 1 FMOC与左旋肉碱的反应原理 Fig. 1 Reaction principle of FMOC with L-carnitine

2.1.2 L-Ala-β-NA衍生法

在氯甲酸丁酯、三乙胺的催化下,L-Ala-β-NA常与左旋肉碱的羧基发生反应(见图 2)。使用DAD对衍生产物做全波长扫描,测得最大吸收波长244 nm,且同一浓度衍生产物的紫外吸收强度强于FMOC衍生法。因此选择L-Ala-β-NA作为衍生反应试剂。

图 2 左旋肉碱与L-丙酰胺-β-萘胺的反应原理 Fig. 2 Reaction principle of L-propionamide-β-naphthylamine (L-Ala-β-NA) with L-carnitine

2.2 衍生反应条件的优化

2.2.1 反应催化剂的选择

氯甲酸乙酯、氯甲酸丁酯均可用作反应催化剂,但氯甲酸乙酯沸点低,毒性较强,且不易购买,故选用氯甲酸丁酯作反应催化剂。

2.2.2 溶剂的选择

文献^[16]报道L-丙酰胺-β-萘胺的溶剂为乙醇。但实验发现,在后续的液液萃取过程中,使用L-丙酰胺-β-萘胺乙醇溶液的样品,萃取分层不够理想。本方法选用乙腈作L-丙酰胺-β-萘胺的溶剂,萃取分层效果良好。

2.2.3 萃取次数对实验结果的影响

实验证明使用1 mL 50 mmol/L碳酸氢钠水溶液作萃取剂,萃取效率较高,无需重复萃取。由图 3可见,第二次萃取液中未测得目标物。

图 3 两次萃取液的色谱图对比 Fig. 3 HPLC chromatograms of two extractions

2.2.4 温度和时间对衍生反应的影响

吸取5 μg左旋肉碱标准品于离心管中,固定反应时间10 min,考察温度对衍生反应的影响。对比4、20(室温)、40、60 ℃的反应结果,发现4、20和40 ℃的反应产物一致,60 ℃下副反应较强烈。由于室温(20 ℃)的实验条件更容易控制,本方法选择室温作为衍生反应温度。

吸取5 μg左旋肉碱标准品于离心管中,在室温下考察反应时间对衍生反应的影响。10 min时的衍生产物明显高于5 min时的衍生产物;10～30 min时,随着时间的增加,衍生反应产物缓慢增加。30 min和40 min反应产物变化不大;50 min时,反应产物有所下降(见图 4)。为得到较好的衍生反应效果,本方法将衍生反应时间设定为40 min。

图 4 反应时间对衍生反应的影响 Fig. 4 Effect of reaction time on the derivative reaction

2.2.5 衍生产物稳定性的测定

吸取5 μg左旋肉碱按照上述优化的衍生条件衍生后进行测定,在室温下考察测定溶液的稳定性,测定时间间隔为1、6、12、24 h。研究发现,1、6、12 h的目标峰面积分别为829.7、828.2、830.5,差距很小;24 h的目标物峰面积仅为786.7,较原峰面积减少了10%左右。为确保检测的准确性,应在12 h内完成实验。

2.2.6 衍生试剂与催化剂的添加顺序对衍生效果的影响

在实验过程中发现,衍生试剂与催化剂的添加顺序、左旋肉碱在反应体系中的均匀分布程度影响衍生产物的生成,导致产物不够稳定,副产物较多,进而影响线性关系。图 5a为在5 μg标准品中先加入催化剂,混匀后,加入衍生试剂的衍生产物色谱图。图 5b为在5 μg标准品中先加入衍生试剂,混匀后,再加入催化剂的衍生产物色谱图。实验发现,若衍生试剂未与左旋肉碱充分混合均匀,催化剂会先与衍生试剂反应,且衍生产物复杂,影响衍生效果。因此,本文采用先加入衍生试剂,与左旋肉碱混合均匀后,再加入催化剂的方法进行实验。

图 5 衍生试剂与催化剂添加顺序不同时衍生产物的色谱图 Fig. 5 Chromatograms of the derivative products under different adding orders of derivative reagent and catalyzer a. catalyst was added first,and the derivative reagent was added secondly; b. derivative reagent was added first,and the catalyst was added secondly.

2.2.7 基质对衍生效果的影响

实验发现,样品基质对衍生效果有减弱作用,因此在制作标准曲线的时候,应采用基质加标的方法进行。乳粉基质的样品,因其零添加样品中天然存在左旋肉碱,因此制作标准曲线的时候需扣除基质空白。

2.3 净化方法的优化

实验发现乳品中存在大量的干扰物质,基质效应明显,对分析目标物抑制显著^[15]。本实验比较了不同的固相萃取柱对样品回收率的影响,结果表明左旋肉碱在WCX与HLB柱中会随淋洗液一起流失,目标化合物在淋洗液中有检出。采用MCX柱,左旋肉碱的回收率大于80%,因此选用MCX柱净化。

2.4 线性范围、检出限和定量限

用乙腈将标准储备液稀释后,在离心管中加入0.250、0.500、1.00、5.00、10.0、50.0 μg的系列左旋肉碱标准品,按照上述的衍生方法进行衍生,得到0.250、0.500、1.00、5.00、10.0、50.0 mg/L的系列溶液,采用本方法优化的色谱条件,进行HPLC-DAD分析。以进样浓度为横坐标(x),目标峰峰面积为纵坐标(y)绘制左旋肉碱的标准曲线,左旋肉碱的线性方程为y=164.4x-11.3,相关系数为0.999 8,结果表明,左旋肉碱衍生物在0.250～50.0 mg/L范围内,线性关系良好。

通过添加试验,在零添加左旋肉碱样品中添加标准品,按前述方法进行测定,以信噪比(S/N)=3计算检出限(LOD),S/N=10计算定量限(LOQ),得到本方法左旋肉碱的LOD为10 mg/kg,LOQ为25 mg/kg。

2.5 回收率、准确度和精密度

以零添加左旋肉碱的乳粉为空白样品基质,在定量限、最小添加浓度、最大添加浓度3个浓度水平做添加回收,每个浓度水平进行10次重复试验,测得回收率为84.3%～86.0%,相对标准偏差为1.93%～3.18%。表明本方法的回收率、准确度和精密度满足要求,重复性好,能够满足调制乳粉中左旋肉碱含量的测定。空白样品和添加样品的色谱图见图 6,左旋肉碱的回收率、准确度和精密度见表 1。

图 6 (a)空白乳粉样品及(b) 400 mg/kg左旋肉碱加标样品的色谱图 Fig. 6 Chromatograms of (a) a blank milk powder sample and (b) the sample spiked with 400 mg/kg L-carnitine standard

表 1 乳制品中左旋肉碱的回收率与相对标准偏差(n=10) Table 1 Recoveries and RSDs of L-carnitine in dairy products (n=10)

2.6 实际样品检测

使用本文建立的方法对20个调制乳粉样品中的左旋肉碱含量进行测定,检出含量为53～163 mg/kg(见表 2),按照GB 13432-2013《食品安全国家标准预包装特殊膳食用食品标签》中营养成分实际含量不应低于标示值的80%来判定,样品标签的符合率达96%。

表 2 20个样品中左旋肉碱的标签值与测定值 Table 2 Tag values and determined values of L-carnitine in 20 samples

3 结论

本研究建立了衍生化-高效液相色谱测定调制乳粉中左旋肉碱含量的方法。试样中的左旋肉碱经盐酸提取,阳离子交换固相萃取柱净化,在氯甲酸丁酯、三乙胺的催化下与L-丙酰胺-β-萘胺发生取代反应,生成紫外吸收较强的化合物,供配有二极管阵列检测器或紫外检测器的高效液相色谱仪测定,外标法定量。该方法线性关系良好、准确性高,操作相对简便,可为我国乳制品中左旋肉碱的检测提供有力的技术支持,对保障乳制品的质量安全具有积极意义。

参考文献

[1]	Yang J, Agricultural Engineering,2012, 2 (1):54. 杨静, 农业工程,2012, 2 (1):54.
[2]	Zhou S F, He Z Q, Liu J P, et al, Acta Nutrimenta Sinica,1997, 19 (2):146. 周书凤, 何志谦, 刘建平, 等, 营养学报,1997, 19 (2):146.
[3]	Chen J, Zhong X L, Yu Y H, Physical Testing and Chemical Analysis Part B:Chemical Analysis,2013, 49 (1):6. 陈军, 钟新林, 余彦海, 理化检验:化学分册,2013, 49 (1):6.
[4]	GB 14880-2012
[5]	GB 10765-2010
[6]	GB 10767-2010
[7]	Zuo H X, Zhang Y B, Huang M M, et al, Science and Technology of Food Industry,2012, 35 (2):53. 左惠心, 张玉斌, 黄明明, 等, 食品工业科技,2012, 35 (2):53.
[8]	Wang T X, Xiong W M, Lin M Y, Fujian Analysis & Testing,2012, 21 (1):52. 王天西, 熊文明, 林梦勇, 福建分析测试,2012, 21 (1):52.
[9]	Xu P, Life Science Instruments,2013 (5):45. 徐萍, 生命科学仪器,2013 (5):45.
[10]	Jin S M, Zhao Z H, Zhu H, et al, Cereal and Food Industry,2011, 18 (5):54. 金世梅, 赵志红, 朱慧, 等, 粮食与食品工业,2011, 18 (5):54.
[11]	Zou X L, Zhou Y Y, Qiao R, et al, Journal of Hygiene Research,2011, 40 (3):358. 邹晓莉, 周艳阳, 乔蓉, 等, 卫生研究,2011, 40 (3):358.
[12]	Gan B B, Li S H, Chinese Journal of Health Laboratory Technology,2010 (7):1688. 甘宾宾, 黎少豪, 中国卫生检验杂志,2010 (7):1688.
[13]	Xu L M, Wang Z Z, Bi Y A, et al, Strait Pharmaceutical Journal,2009, 21 (11):46. 徐连明, 王振中, 毕宇安, 等, 海峡药学,2009, 21 (11):46.
[14]	Zhu Q, Su L K, Zheng J G, et al, Journal of Instrumental Analysis,2012, 31 (3):355. 竺琴, 苏流坤, 郑家概, 等, 分析测试学报,2012, 31 (3):355.
[15]	Xu D M, Chen Y, Zhang J, et al, Journal of Instrumental Analysis,2016, 35 (1):1. 徐敦明, 陈燕, 张缙, 等, 分析测试学报,2016, 35 (1):1.
[16]	Liu Y M, Xue X, Liu G Q, et al, Chinese Journal of Chromatography,2015, 33 (9):943. 刘艳明, 薛霞, 刘国强, 等, 色谱,2015, 33 (9):943.
[17]	Miyuki K, Yoshio M, Hiroyuki N, J Chromatogr A,1999, 857 :127.
[18]	Sascha F L, Hans A, J Pharm Biomed Anal,2002, 30 :209.