色谱  2016, Vol. 34 Issue (9): 835-849   PDF    
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李凌云
许晓敏
林桓
赵文
叶融
黄晓冬
郑姝宁
刘新艳
刘肃
徐东辉
超高效液相色谱-串联质谱法快速检测蔬菜中248种农药残留
李凌云1, 许晓敏1, 林桓1, 赵文2, 叶融3, 黄晓冬1, 郑姝宁1, 刘新艳1, 刘肃1, 徐东辉1     
1. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 农业部蔬菜产品质量安全风险评估实验室(北京), 农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室, 北京 100081;
2. 中国农业科学院蜜蜂研究所, 北京 100093;
3. 北京林业大学生物科学与技术学院, 北京 100083
收稿日期：2016-04-05
基金项目：国家蔬菜产品质量安全风险评估项目（GJFP2016002）
通讯联系人： Tel:(010)82106963,E-mail:xudonghui@caas.cn
摘要：采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术建立了快速检测蔬菜中248种农药残留的分析方法。蔬菜样品采用乙腈提取，盐析后无需净化，缩短了样品前处理的时间。采用正负离子多反应监测（MRM）模式对蔬菜中248种农药残留进行定性和定量分析。245种农药在各自的线性范围内线性关系良好（r>0.99）。除丁硫克百威、灭蝇胺、苯磺隆和二氯喹啉酸4种农药外，其余244种农药在3个添加水平下的平均回收率范围为63.0%～126.4%，相对标准偏差（RSD）范围为0.5%～26.7%，方法的定量限为0.001～0.030 mg/kg。该方法具有简单、快速、灵敏度高、准确度高等优点，适合蔬菜样品中农药多残留的快速检测分析。
关键词： 超高效液相色谱-串联质谱     农药残留     蔬菜    
Rapid detection of 248 pesticide residues in vegetables by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
LI Lingyun1, XU Xiaomin1, LIN Huan1, ZHAO Wen2, YE Rong3, HUANG Xiaodong1, ZHENG Shuning1, LIU Xinyan1, LIU Su1, XU Donghui1     
1. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Ministry of Agriculture Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Vegetable Products(Beijing), Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China ;
2. Institute of Apicultural Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China ;
3. College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
Received: 2016-04-05
Foundation Item: National Vegetable Product Quality and Safety Risk Assessment Project (No. GJFP2016002)
* Corresponding author. Tel:(010)82106963,E-mail:xudonghui@caas.cn
Abstract: A multiresidue analytical method for rapid detection of 248 pesticide residues in vegetables using an ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) technique was successfully developed. The vegetable samples were extracted by acetonitrile. After salting out, the solvent extracts were analyzed by UHPLC-MS/MS directly. And further purification was not needed. The positive and negative ion modes and multiple reaction monitoring (MRM) mode were used to identify and quantify the 248 pesticide residues in vegetables. The results showed that 245 pesticides had good linearity within their respective linear ranges (r>0.99). Except four pesticides (carbosulfan, cyromazine, tribenuron-methyl, quinclorac), the average recoveries of the other 244 pesticides at three spiked levels ranged from 63.0% to 126.4% with the relative standard deviations (RSDs) from 0.5% to 26.7%. The limits of quantification of this method were in the range of 0.001-0.030 mg/kg. In comparison with other pretreatment methods for pesticide residues, this method not only shortened the time of sample pretreatment, but also enhanced significantly the recoveries of pesticides. The results in this study suggested that it is a simple, rapid, sensitive and accurate method for pesticide residue determination, and suitable for rapid screening of pesticide residues in vegetables.
Key words: ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS)     pesticide residues     vegetables    

农药的发明和使用一直被认为是农业生产安全的重要保证,并对提高农产品的产量发挥着至关重要的作用。但长期和大量使用农药,不可避免地会对生态环境和人体健康产生影响[1]。据统计,2011年中国农药使用量高达178.7万吨,其中只有10%～30%附着于农作物,其余大部分流失于土壤、水体和大气中,使耕地和周边环境遭受到不同程度的污染,并且随着用药量和施药次数的增加,部分农药残留也逐渐增加。2009年国际绿色和平组织在我国多个城市对常见蔬菜和水果的农药残留进行检测,共检测出50种农药残留[2]。因此对农产品进行及时、有效地农药残留检测是十分必要的。由于农药的种类繁多和农民喷洒的不规范,以至于对农药残留的常规检测和突发事件的应急过程中，农药的定性与定量分析具有很大的不确定性。因此发展前处理简单、快速和农药覆盖面广的农药多残留分析方法至关重要。

农药残留分析包括样品前处理和仪器检测两部分。其中样品前处理过程是整个农药残留分析的关键步骤,直接关系着分析结果的准确性。常用的农残样品前处理方法有液液萃取[3]、固相萃取[4]、基质固相分散萃取[5]和超临界萃取[6]等。这些方法不但溶剂消耗量大且后续仍需繁琐的净化步骤,耗时长,不利于农残样品的大批量处理和农药事件的应急处理。即使QuEChERS方法[7-10]简化了样品前处理过程,但仍需花费大量时间进行样品净化,且净化材料多采用N-丙基乙二胺,该材料对酸性农药有吸附作用,从而导致酸性农药的回收率偏低。

目前农药残留的检测方法很多,主要有气相色谱(GC)法[11, 12]、高效液相色谱(HPLC)法[13]、高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)法[14-18]、气相色谱-质谱联用(GC-MS)法[19-22]、毛细管电泳(CE)法[23]以及高分辨质谱法[24-25]等。其中液相色谱-三重四极杆串联质谱(HPLC-MS/MS)技术因具有分离效果好、灵敏度高、抗干扰能力强、选择性好等优点成为农残检测的首选方法[26-31]。

本研究利用液相色谱-串联质谱抗干扰能力强、灵敏度高的优点,采用较少的进样体积减小基质效应,建立了超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)快速检测蔬菜中248种农药残留的分析方法。该方法操作简单、省时，且可获得较高的回收率,适合大批量蔬菜样品农药残留的筛查检测。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

LC-30A超高效液相色谱仪和 LC-MS/MS-8050三重四极杆质谱仪均购自日本Shimadzu公司。

乙腈、甲醇、丙酮(HPLC级,美国JT Baker公司);乙酸铵、甲酸(HPLC级,美国Fluka公司);水(纯净水,Milli-Q超纯水仪制备); 248种农药标准品(纯度＞96%,德国Dr. Ehrenstorfer公司);其他试剂均为分析纯,购自北京化学试剂公司。

1.2 标准溶液的配制

10mL烧杯中,根据农药的溶解度选用甲醇或丙酮进行溶解后,转移至10 mL容量瓶中,定容至刻度,配制成各农药的标准储备溶液。准确量取一定体积的各农药标准储备溶液,用甲醇定容,得248种农药的混合标准溶液,于-20 ℃保存。

1.3 样品处理

称取10.00g蔬菜样品于50 mL离心管中,加入20.0 mL乙腈,振荡提取30 min后,加入5 g氯化钠,剧烈振荡1 min,以5000 r/min离心3 min后,取上层乙腈相,过0.22 μm滤膜,滤液待测。

1.4 色谱条件

色谱柱:Shim-pack XR-ODS Ⅲ (150 mm×2.0mm,2.2 μm);流动相:A相为甲醇,B相为1 mmol/L乙酸铵水溶液。梯度洗脱条件:0～4.0 min,10%A～50%A; 4.0～20.0 min,50%A～75%A; 20.0～22.0 min,75%A～95%A; 22.0～27.0 min,95%A; 27.0～27.1 min,95%A～10%A; 27.1～35.0 min,10%A。流速:0.4 mL/min;柱温:40 ℃;进样量:1 μL。

1.5 质谱条件

ESI源;接口电压4000 V;正离子和负离子扫描方式同时扫描;MRM模式;雾化气流量3 L/min,干燥气流量10 L/min,气体均为氮气;加热气流量10 L/min,气体为空气;接口温度250 ℃;脱溶剂管温度250 ℃；加热模块温度400 ℃；碰撞气压力2.7×105 Pa,气体为氩气。

2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化

将各农药分别配制成100μg/L的标准溶液。将标准溶液在不接色谱柱的情况下直接通过液相色谱注入质谱。同时建立正负离子两种扫描模式,对每种农药标准品分别进行采集,根据正负离子全扫描谱图,得到准确的母离子,首选[M+H]+或[M-H]-峰,再考虑[M+Na]+或[M+NH4]+峰。利用仪器自动优化功能,筛选二级碎片离子信息,获得碎片离子及质谱参数Quadrupole 1(Q1)、Quadrupole 3(Q3)和碰撞能量(CE),并将母离子和2个信号较强的子离子组成监测离子对,以MRM模式进行检测。248种农药响应强度最佳时的质谱条件见表 1。

表 1 248种农药的保留时间、离子对、碰撞能量、定量限(LOQs)及在菜豆基质中的平均加标回收率(0.1 mg/kg)和相对标准偏差(RSDs)(n=5) Table 1 Retention times (tR),MRM transitions,collision energies,LOQs,the average recoveries and RSDs of the 248 pesticides in beans spiked at 0.1 mg/kg (n=5)
2.2 流动相的优化

本实验考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-甲酸水溶液和甲醇-乙酸铵水溶液作为流动相时对分析结果的影响。结果表明,甲醇-水作为流动相与乙腈-水相比,可提高部分农药(如阿维菌素)的质谱信号,但大部分农药的质谱响应仍偏低。在甲醇-水中加入甲酸,可增加正离子的电离程度,但负离子的电离受到影响。在甲醇水溶液中加入乙酸铵,绝大部分农药的灵敏度均明显提高,表明甲醇-乙酸铵水溶液更适合作流动相。同时考察了不同浓度(1.0、2.5、5.0、10.0mmol/L)的乙酸铵对检测结果的影响。结果表明,随着乙酸铵浓度的增加,大部分农药的响应降低,且高浓度的乙酸铵会增加离子源的清洗频次。因此最终采用甲醇-1.0 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相。在MRM模式下,菜豆空白基质中添加含量为50.0 μg/kg的248种农药混合标准品的总离子流色谱图见图 1。

图 1 在MRM模式下菜豆空白基质中添加248种农药混合标准溶液(50.0 μg/kg)的总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion chromatogram of bean blank matrix spiked with 248-pesticide mixed standard solution in MRM mode (50.0 μg/kg)
2.3 进样体积对溶剂效应的影响

当样品溶液与初始流动相差别较大时,出峰时间较早的化合物的色谱峰会出现分叉或变宽的现象,此为溶剂效应。本实验的进样溶液为乙腈,而初始流动相为甲醇-乙酸铵水溶液(1:9,v/v),因此要考虑溶剂效应对色谱峰的影响。本研究通过减少进样体积来降低溶剂效应。不同进样体积(1、2、3、5μL)下乙酰甲胺磷的色谱图如图 2所示。当进样量为5 μL时,乙酰甲胺磷的色谱峰出现分叉、展宽等现象;随着进样体积的减少,色谱峰分叉、展宽等现象逐渐减小;当进样体积为1 μL时,乙酰甲胺磷的溶剂效应几乎消失。

图 2 进样体积对乙酰甲胺磷色谱峰的影响 Fig. 2 Effect of injection volumes on the chro-matographic peaks of acephate
2.4 进样体积对基质效应的影响

基质效应是指基质中的共提取干扰物影响目标化合物的离子化,从而使化合物在仪器上的响应发生增强或抑制的现象。本文采用相对响应值法评价基质效应。基质效应=(B/A-1)×100%[32],A为纯溶剂中农药的响应值;B为样品基质中添加相同浓度农药的响应值。将番茄、甘蓝、菜豆、芹菜、黄瓜、青花菜、菠菜、韭菜等蔬菜基质配制相同浓度的标准溶液,以基质效应的绝对值大小衡量不同进样量(1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μL)对基质效应的影响。嘧菌酯在不同基质中不同进样量下的基质效应见图 3。当进样量为1.0 μL时,以不同蔬菜基质配制的嘧菌酯的基质效应的绝对值大小低于10%,几乎不存在基质效应;当进样量为2.0 μL和5.0 μL时,青花菜和韭菜的基质效应升至20%以上,表现出明显的基质效应;当进样量为10.0 μL时,除黄瓜基质外其他蔬菜的基质效应升至20%以上,青花菜和韭菜的基质效应已升至40%以上;当进样量为20.0 μL时,除黄瓜、菠菜外,其他蔬菜的基质效应升至40%以上,青花菜和韭菜的基质效应升至60%以上,基质效应严重。减少进样量不仅可降低基质效应和溶剂效应,还可减少样品基质对色谱柱及仪器造成的污染。因此本实验最终将进样量选为1.0 μL。

图 3 不同基质中进样体积对嘧菌酯基质效应的影响 Fig. 3 Effect of injection volumes on the matrix effects of azoxystrobin in different matrixes

由图 3可知,不同蔬菜的基质效应是不同的。当进样量为1.0μL时,嘧菌酯在番茄、甘蓝基质中几乎不存在基质效应,但在芹菜、黄瓜等基质中存在基质增强效应。为得到更准确的结果,减少基质效应,本研究均采用空白基质配制标准溶液进行定量计算。

2.5 方法学验证
2.5.1 线性范围和线性关系

用菜豆、芹菜、番茄、菠菜、大白菜、黄瓜、韭菜、油菜、茄子、生菜、笋、油麦菜、甘蓝13种蔬菜的空白基质将248种农药配制成质量浓度为0.001、0.0025、0.005、0.010、0.025、0.050、0.100、0.200mg/L的系列混合标准溶液。按1.4节和1.5节方法进行LC-MS/MS测定,以峰面积(y)对质量浓度(x,mg/L)作标准曲线,得到248种农药的线性方程。环丙唑醇、唑酮草酯和苯磺隆的相关系数分别为0.9738、0.9843和0.9878,其他农药的相关系数均在0.9907～0.9999之间。如菜豆基质中,噻虫嗪、速灭磷等222种农药在0.001～0.200 mg/L范围内线性关系良好,丙硫多菌灵、嘧菌环胺等9种农药在0.0025～0.200 mg/L的范围内线性关系良好,涕灭威、多效唑等8种农药在0.005～0.200 mg/L的范围内线性关系良好,氯苯胺灵和阿维菌素等7种农药在0.010～0.200 mg/L的范围内线性关系良好,除虫脲和唑酮草酯2种农药在0.025～0.200 mg/L的范围内线性关系良好。

2.5.2 定量限

各蔬菜基质在0.005和0.010mg/kg的添加水平下,以信噪比大于10(S/N＞10)确定248种农药的LOQ为0.001～0.03 mg/kg(见表 1)。其中氯唑磷、克螨特等94种农药的LOQ小于0.005 mg/kg,四螨嗪、茚虫威等129种农药的LOQ为0.005 mg/kg,三唑醇、益棉磷等11种农药的LOQ为0.01 mg/kg,联苯三唑醇、芸苔素内酯等12种农药的LOQ为0.02 mg/kg,除虫脲和氯硝胺的LOQ为0.03 mg/kg。所有农药的定量限均满足检测要求。

2.5.3 回收率和精密度

对番茄、菠菜、菜豆、大白菜、黄瓜、韭菜、油菜、茄子、芹菜、生菜、笋、油麦菜、甘蓝13种蔬菜的248种农药进行0.005、0.01和0.1mg/kg 3个水平的加标回收率试验(n=5)。除灭蝇胺、苯磺隆、丁硫克百威和二氯喹啉酸外,其他244种农药在13种蔬菜中的平均回收率为63.0%～126.4%,RSD为0.5%～26.7%。方法的准确度和精密度均符合分析要求。灭蝇胺的回收率为43.3%～58.8%;苯磺隆对酸性蔬菜敏感,在番茄中的回收率较低,只有39%,在其他蔬菜上的回收率为71.8%～101.3%;丁硫克百威的回收率为42.0%～95.8%;二氯喹啉酸的回收率为39.8%～90.4%。菜豆在0.1 mg/kg的添加水平下的平均回收率和精密度见表 1。灭蝇胺的回收率为48.5%,RSD为6.4%；其他247种农药的回收率为71.6%～113.5%,RSD为0.4%～14.2%。

2.6 与GB/T 20769-2008前处理方法的比较

为进一步验证方法的可靠性,比较了本文方法和GB/T 20769-2008方法分析得到的油菜样品中248种农药(添加水平为0.1mg/kg)的回收率(见图 4)。本文方法对乙酰甲胺磷、敌百虫、甲基硫菌灵、碘苯腈等农药的回收率明显高于GB/T 20769-2008法。本实验根据GB/T 20769-2008法对氯吡脲和苯磺隆进行分析,二者的回收率为0,而采用本文方法分析氯吡脲和苯磺隆，其回收率均大于90%。本实验方法快速、简便、适于更多种类农药的分析。

图 4 采用本文方法和GB/T 20769-2008法时油菜中部分农药的加标回收率(0.1 mg/kg) Fig. 4 Spiked recoveries of some pesticides in cole using this method and GB//T 20769-2008 method (0.1 mg/kg)
2.7 实际样品的测定

应用所建立的方法对市售的黄瓜、韭菜、辣椒、油菜、菜豆等9类蔬菜100个样品进行农药残留的快速测定(部分结果见表 2)。结果表明,市售蔬菜中含烯酰吗啉、苯醚甲环唑、嘧霉胺、啶虫脒、啶酰菌胺等多种农药残留。多菌灵、烯酰吗啉、苯醚甲环唑的检出频次分别为28、27、22。其他农药的检出频次相对较低。在菜豆样品中检出多菌灵的含量为0.0604 mg/kg,超过GB 2763-2014的限量标准,其他检出农药的含量均未超过限量标准。

表 2 部分蔬菜样品中农药残留的快速筛查结果 Table 2 Rapid screening results of the pesticide residues in some vegetable samples
3 结论

本文采用UHPLC-MS/MS技术建立了同时定性和定量分析蔬菜中248种农药残留的快速检测方法。样品经提取后无需净化,缩短了样品前处理的时间。该方法简便、快速、准确、灵敏度高,适合于大批量蔬菜样品中农药残留的快速检测。

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