顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用分析费约果叶片挥发性香气成分条件优化


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白俊英, 黄仁华, 陆云梅, 余游, 王丹

西南科技大学生命科学与工程学院, 四川绵阳 621010

收稿日期：2016-04-05

基金项目：国家自然科学基金项目（31000259）；四川省科技厅"十一五"科技项目（14zs2105）；校实验室开放基金项目（15xnkf03）

通讯联系人： E-mail:huangrenhua@swust.edu.cn

摘要：为了建立适合费约果叶片香气成分检测的顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（HS-SPME-GC-MS）分析方法，考察HS-SPME中不同萃取条件对香气萃取效果的影响，采用L₉（3⁴）正交试验，以出峰个数和总峰面积为考察指标确定最佳萃取条件。结果表明，萃取温度对出峰个数和总峰面积的影响较大，而加样量的影响较小。实验得出的较优萃取条件为：加样量0.6 g，萃取温度50 ℃，萃取时间50 min，解吸时间6 min。在此萃取条件下能够得到88种物质，这些物质能更真实地反映费约果叶片香气成分的化学构成，为费约果叶片的开发利用提供有价值的数据。

关键词：顶空固相微萃取气相色谱-质谱最优萃取条件正交试验挥发性香气成分费约果叶片

Optimization of headspace solid phase micro-extraction combined with gas chromatography-mass spectrometry conditions of volatile flavor from Feijoa sellowiana leaves

BAI Junying, HUANG Renhua, LU Yunmei, YU You, WANG Dan

College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China

Received: 2016-04-05

Foundation Item: Natural Science Foundation of China (No. 31000259); "11th Five-Year" Science and Technology Project of Sichuan Provincial Science and Technology Department (No. 14zs2105); the Open Fund of School Laboratory (No. 15xnkf03)

^* Corresponding author. E-mail:huangrenhua@swust.edu.cn

Abstract: To establish the appropriate extraction conditions for the analysis of volatile constituents from Feijoa sellowiana leaves by headspace solid phase micro-extraction (HS-SPME) combined with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), the extraction conditions were investigated by orthogonal tests. The sum of the peak areas and total peak numbers of the volatile constituents were used as indices to optimize the extraction conditions by using L₉(3⁴) orthogonal array design. The results showed that the influence of temperature was larger and that of the sample amount was smaller for total peak numbers and peak areas. The optimum HS-SPME parameters were selected as follows: 0.6 g sample, extracted for 50 min at 50 ℃, and then desorbed for 6 min. Under these conditions, a total of 88 substances were detected. These substances can reflect the fragrant chemical components of Feijoa sellowiana leaves, and provide some references for the development and utilization of the leaves.

Key words: headspace solid phase micro-extraction(HS-SPME) gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) appropriate extraction condition orthogonal test volatile flavor Feijoa sellowiana leaves

固相微萃取(solid phase micro-extraction,SPME)技术是基于固相萃取技术发展起来的一种新的样品预处理方法^[1]。顶空固相微萃取(HS-SPME)是将萃取头垂直置于供分析液体或固体样品上方的气相中,萃取、吸附挥发性或半挥发性组分^[2]。特别适合于微量挥发性成分的富集,操作简便,能有效减少底物及液态基质中干扰物质的影响,具有集采集、萃取、浓缩、进样、分析于一体,无需溶剂,易实现自动化,方便与色谱仪器联用等特点^[3-4]。固相萃取与气相色谱-质谱联用是近年来发展起来的方法,可用来分析挥发性香气成分及水和果蔬中的农药残留^[5-7]。

费约果(Feijoa sellowiana Berg.)系桃金娘科多年生亚热带常绿灌木或小乔木,为集食用、药用、观赏为一体的果树新品种,原产于巴西、巴拉圭、乌拉圭和阿根廷,目前在美国加利福尼亚州和新西兰广泛栽培^[8-10]。费约果叶片四季常绿,耐修剪,具有浓郁而独特的香味,且持久不散,是香精香料、化妆品等产品的天然优质来源。费约果不同组织器官香气物质的研究表明,其果实、果皮提取物中含有的大量精油成分具有抗菌、抗癌、抗氧化和促进免疫能力的潜在应用价值^[11-13]。但费约果果实成本相对较高,作为天然活性物质来源空间较小,而费约果叶片作为天然活性物质来源有较大发展前景,且国内相关研究尚属空白。基于此,本研究以费约果叶片为材料,采用HS-SPME萃取费约果叶片的挥发性成分,以气相色谱-质谱(GC-MS)进行成分分析,并采用正交试验对萃取条件进行优化,建立费约果叶片香气物质的可靠分析方法,以期为费约果叶片天然香气成分的开发和利用提供科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

Varian 3900-Saturn 2100气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司);手动固相微萃取进样手柄和Carboxen^®/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS,75 μ m)萃取头(美国Supelco公司); 20 mL螺纹顶空瓶;HH型恒温水浴锅(金坛市金城国胜实验仪器厂);电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司); FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

费约果品种“库利激”(Coolidge)成熟叶片,洁净且无病虫害,采摘于四川绵阳西南科技大学西山校区费约果种植园。真空干燥后用万能粉碎机粉碎成均一粉末,密封,备用。

1.2 实验方案设计

根据顶空固相微萃取的设计方法结合热力学和动力学原理可知,影响顶空固相微萃取效率的主要因素包括萃取头种类、加样量、萃取温度及时间、解吸时间,且各因素之间存在交互作用,据此,实验采用适于相对分子质量较小的挥发性成分吸附的75 μ m CAR/PDMS萃取头,分别选取加样量、萃取温度、萃取时间和解吸时间等4个因素进行正交试验设计,以出峰个数和总峰面积为指标确定最佳条件。L₉(3⁴)正交表见表 1。

表 1 正交试验因素与水平 Table 1 Factors and coded levels used in orthogonal array design

1.3 HS-SPME法

准确称取费约果叶片粉末于20 mL顶空瓶中,用配有聚四氟乙烯垫的密封盖密封,将密封顶空瓶放在60 ℃水浴锅中平衡30 min,然后,将老化后的75 μ m CAR/PDMS萃取头迅速插入样品瓶顶空部分,距离样品一定高度,在一定温度下加热吸附,吸附后的萃取头取出,并迅速插入气相色谱进样口,于250 ℃解吸一定时间后拔出,用于GC-MS分析(萃取头插入进样口时启动仪器采集数据)。萃取头首次使用时,需要在气相色谱进样口老化(温度300 ℃,时间30 min);以后每次使用前需在250 ℃下处理10 min,以确保脱去其可能吸附的挥发性成分。

1.4 色谱条件

色谱柱为HP-5MS(含5%苯甲基聚硅氧烷)弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m);色谱进样口温度250 ℃;进样量1 μ L;柱室温度:40 ℃,保持1 min,采用程序升温以5 ℃/min 的升温速率升至130 ℃,再以2 ℃/min 的升温速率升至190 ℃,然后以5 ℃/min 的升温速率升至240 ℃,保持5 min;载气:高纯氦气,恒流模式,流速1 mL/min;不分流进样。

1.5 质谱条件

质谱接口温度:220 ℃;电离方式:EI;电子能量:70 eV;离子源温度:190 ℃;四极杆温度:210 ℃,调谐方式:标准调谐;溶剂延迟时间:3 min;扫描模式:全扫描;质量扫描范围:40～300。

2 结果与讨论

2.1 实验条件考察

顶空固相微萃取过程中,加样量、萃取温度、萃取时间、解吸时间等都是影响萃取效果的重要因素^[14]。加样量的多少直接影响挥发性成分的含量,进而影响吸附量;吸附过少,影响检测效果;吸附过多,超出仪器检测范围,则会影响谱库匹配结果;经反复预实验,选取加样范围为0.2~0.6 g。萃取温度对萃取效果的影响表现为,升高温度能加快待测组分的运动,促进富集过程进行,但过高的温度会影响待测物在气相与涂层间的分配系数,反而不利于萃取的平衡。文献^[15]表明,萃取温度超过50 ℃时,对风味物质的萃取量呈下降趋势,综合考虑,选取萃取温度为30 ℃至50 ℃。萃取时间直接影响萃取达到平衡,萃取时间短,则吸附不完全;萃取时间过长,则吸附组分可能发生解吸。因此萃取时间必须合理才能达到最佳的萃取效果。文献^[16]表明,萃取头在40 min即可处于吸附饱和状态,故选取时间为30～50 min。解吸时间对萃取效果也有较大影响。解吸时间的长短直接影响待测组分从固定相中的解吸程度进而影响萃取效果。解吸时间短,固定相中的吸附组分解吸不完全,使分析结果不理想;解吸时间过长,待测组分虽能完全解吸,但长时间的高温却会大大缩短萃取头使用寿命。综合萃取头性能考虑,选取解吸时间为2～6 min。

选取正交试验因素水平(见表 1),结果如表 2所示,正交试验对出峰个数和总峰面积影响的极差分析见表 3。由表 3可知,当以出峰个数为考察指标时,较优组合为A1B2C3D2,各因素对萃取效果影响的大小顺序为D＞B＞A＞C,即解吸时间影响最大,萃取温度和萃取时间影响次之,加样量影响最小;当以总峰面积为考察指标时,较优组合为A3B3C3D3,各因素对萃取效果影响的大小顺序为B＞C＞A＞D,即萃取温度影响最大,萃取时间次之,加样量和解吸时间也有一定影响。由此可以看出,萃取温度对出峰个数和总峰面积的影响均较大,而加样量的影响均偏小,此外,当考察指标不同时,影响因素的作用大小差异较大。综合考虑,最终确定较优组合为A3B3C3D3,即加样0.6 g,在萃取温度50 ℃下吸附萃取50 min,最后解吸6 min。费约果叶片香气成分经顶空固相微萃取最佳工艺条件分析,得到出峰个数为88,总峰面积为 59 992 805,结果与表 2的结果相比较,较优组合峰面积远远超过正交试验中的任何一个,且出峰个数也较多,由此可以看出最优组合对提取费约果叶片香气成分效果更好。

表 2 正交试验设计与结果 Table 2 Results of orthogonal array experiments

表 3 正交试验对峰个数和总峰面积影响的极差分析 Table 3 Range analysis for peak number and total peak area

2.2 对最优萃取条件下香气成分的考察

正交试验后,在选定的最优顶空固相微萃取条件下进行香气成分提取及鉴定实验,得到费约果新鲜叶片挥发性成分的总离子流色谱图(见图 1),其中主要成分及相对含量见表 4。在最优条件下费约果叶片挥发性成分色谱图中共分离得到88种化合物,鉴定出65种,占挥发性成分总量的96.583% ,包括醇类、酯类、醛类、酮类、烯萜类、烃类(烷烃、炔烃、苯形烃)及其他类(萘、氧化物、苯甲酰甲醛水合物等)。其中,含量最高的是烯萜类,有26种,占挥发性成分总量的46.167% ;其次依次是醇类 (16种,31.595% )、酯类(5种,10.397% )、烃类(4种,3.422% )、其他类(8种,2.477% )和酮类(3种,2.132% );含量最低的是醛类,有3种,仅占挥发性成分总量的0.393% 。其中含量最高的6种香气物质按含量高低依次是(E)-3-己烯-1-醇(12.039% )、2,4-二甲基-3-丙二酸丙酯(9.797% )、叶醇(9.511% )、石竹烯(7.888% )、 α -荜澄茄油萜(5.691% )、(-)- β -榄香烯(5.400% ),占总含量的50.326% ,其余58种香气物质占总含量的46.257% 。

图 1 费约果叶片香气成分的总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion current chromatogram of the volatile components of Feijoa sellowiana leaves

表 4 费约果叶片香气成分初探 Table 4 Tentative results of aroma components of Feijoa sellowiana leaves

Number	Compound	Retention time/min	Formula	M_r	Relative content/%
1	2-heptene,5-methyl-	3.569	C₈H₁₆	112	0.025
2	(2Z)-2-penten-1-ol	4.097	C₅H₁₀O	86	0.238
3	3-hexanol	4.631	C₆H₁₄O	102	0.410
4	trans-2-methylcyclopentanol	4.679	C₆H₁₂O	100	1.346
5	leaf aldehyde	5.784	C₆H₁₀O	98	0.167
6	leaf alcohol	5.965	C₆H₁₂O	100	9.511
7	(E)-3-hexen-1-ol	6.047	C₆H₁₂O	100	12.039
8	(E)-2-hexen-1-ol	6.291	C₆H₁₂O	100	0.435
9	(1-methylbutyl)oxirane	6.383	C₇H₁₄O	114	2.749
10	(E)-2-hepten-1-ol	7.231	C₇H₁₄O	114	0.099
11	2-hexyne,4-methyl-	7.517	C₇H₁₂	96	0.320
12	2-heptyn-1-ol	8.847	C₇H₁₂O	112	0.022
13	1-octen-3-ol	9.530	C₈H₁₆O	128	0.098
14	malonic acid,2,4-dimethylpent-3-yl propyl ester	9.673	C₁₃H₂₄O₄	244	9.797
15	3,6-dimethyl-4-octanone	10.045	C₁₀H₂₀O	156	1.318
16	3-ethyl-4-nonanol	10.183	C₁₁H₂₄O	172	1.330
17	2,2-dimethyl-4-octenal	10.366	C₁₀H₁₈O	154	0.169
18	1-decanol,5,9-dimethyl-	10.482	C₁₂H₂₆O	186	0.358
19	tert-butylbenzene	10.852	C₁₀H₁₄	134	0.186
20	perilla alcohol	10.999	C₁₀H₁₆O	152	0.341
21	1,3,6-octatriene,3,7-dimethyl-,(E)-	11.170	C₁₀H₁₆	136	0.539
22	santolinatriene	11.492	C₁₀H₁₆	136	0.143
23	isopinocarveol	11.879	C₁₀H₁₆O	152	0.021
24	2,5-dimethyl-1,5-hexadien-3-ol	11.935	C₈H₁₄O	126	0.041
25	phenylglyoxal monohydrate	12.118	C₈H₈O₃	152	0.073
26	dimethylbenzylcarbinyl acetate	12.838	C₁₂H₁₆O₂	192	0.421
27	linalool	13.112	C₁₀H₁₈O	154	4.350
28	1-nonyne,7-methyl-	13.246	C₁₀H₁₈	138	0.167
29	1,3,5,5-tetramethyl-1,3-cyclohexadiene	13.944	C₁₀H₁₆	136	0.094
30	(4E,6Z)-2,6-dimethyl-2,4,6-octatriene	14.309	C₁₀H₁₆	136	0.126
31	propanoic acid,2,2-dimethyl-,hexyl ester	14.650	C₁₁H₂₂O₂	186	0.109
32	2-decanone	15.797	C₁₀H₂₀O	156	0.108
33	propanoic acid,2-methyl-,2-ethylhexyl ester	17.286	C₁₂H₂₄O₂	200	0.036
34	lilac aldehyde A	18.165	C₁₀H₁₆O₂	168	0.057
35	2-undecanone	18.629	C₁₁H₂₂O	170	0.706
36	6-octadienoic acid,3,7-dimethyl-,methyl ester,(Z)-2	20.013	C₁₁H₁₈O₂	182	0.034
37	γ-elemene	20.888	C₁₅H₂₄	204	0.186
38	α-cubebene	21.883	C₁₅H₂₄	204	5.691
39	α-copaene	23.793	C₁₅H₂₄	204	1.075
40	ylangene	23.835	C₁₅H₂₄	204	1.361
41	β-bourbonene	24.388	C₁₅H₂₄	204	4.046
42	(-)-β-elemene	24.673	C₁₅H₂₄	204	5.400
43	1-hydroxy-1,7-dimethyl-4-isopropyl-2,7-cyclodecadiene	25.135	C₁₅H₂₄	204	0.064
44	α-gurjunene	25.923	C₁₅H₂₄	204	1.343
45	1,2,4a,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-	26.140	C₁₅H₂₄	204	0.017
	1-(1-methylethyl)naphthalene
46	caryophyllene	26.733	C₁₅H₂₄	204	7.888
47	β-guaiene	28.693	C₁₅H₂₄	204	0.170
48	α-caryophyllene	28.983	C₁₅H₂₄	204	3.044
49	aromadendrene	29.293	C₁₅H₂₄	204	2.010
50	isoledene	30.095	C₁₅H₂₄	204	1.058
51	germacrene D	30.553	C₁₅H₂₄	204	2.142
52	(-)-α-selinene	31.073	C₁₅H₂₄	204	1.324
53	(+)-γ-gurjunene	31.480	C₁₅H₂₄	204	3.555
54	aromadendrene,dehydro-	31.935	C₁₅H₂₂	202	0.108
55	1-isopropyl-7-methyl-4-methylene-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydro	32.485	C₁₅H₂₄	204	0.673
	naphthalene 1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydro naphthalene
56	δ-cadinene	32.765	C₁₅H₂₄	204	1.146
57	l-calamenene	32.975	C₁₅H₂₂	202	3.118
58	1,6-dimethyl-4-(1-methylethyl)-(1,2,3,4,4a,7)	33.628	C₁₅H₂₄	204	0.182
	hexahydronaphthalene
59	(-)-α-muurolene	33.898	C₁₅H₂₄	204	0.141
60	spathulenol	36.363	C₁₅H₂₄O	220	0.956
61	caryophyllene oxide-(1)	36.713	C₁₅H₂₄O	220	1.072
62	aromadendrene oxide	38.035	C₁₅H₂₄	204	0.047
63	alloaromadendrene	38.308	C₁₅H₂₄O	220	0.370
64	1,6-dimethyl-4-(1-methylethyl) naphthalene	41.788	C₁₅H₁₈	198	0.356
65	aromadendrene oxide-(2)	46.148	C₁₅H₂₄O	220	0.057
Total					96.583

表 4 费约果叶片香气成分初探 Table 4 Tentative results of aroma components of Feijoa sellowiana leaves

3 结论

通过对费约果叶片挥发性成分顶空固相微萃取工艺的预试验(预试验结果未列出)和正交试验分析,以出峰个数和总峰面积为依据,确定了费约果叶片挥发性成分顶空固相微萃取的最佳工艺,建立了适用于费约果香气物质分析的仪器分析可靠方法,为中国费约果产业的发展及费约果叶片作为天然香气物质优质大宗资源的广阔前景奠定了理论基础。

在鉴定出的费约果香气物质组分中,含量超过1%的化合物按含量由高到低依次有:(E)-3-己烯-1-醇、丙二酸2,4-二甲基-3-丙酯、叶醇、石竹烯、 α -荜澄茄油萜、(-)- β -榄香烯、芳樟醇、 β -波旁烯、(+)- γ -古芸烯、l-去氢白菖烯、 α -石竹烯(丁香烯)、2-(1-甲基丁基)-环氧乙烷、大根香叶烯D、香橙烯、衣兰烯、反-2-甲基环戊醇、 α -古芸烯、3-乙基-4-壬醇、(-)- α -芹子烯、3,6-二甲基-4-辛酮、 δ -荜澄茄烯、 α -蒎烯、石竹烯氧化物-(1)、异喇叭烯。由此可以看出,费约果叶片浓郁而特别的香味主要来自于烯类化合物、酯类化合物和醇类化合物。

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