桑黄(Phellinus spp.)属于大型药用真菌,始载于《神农本草经》,名曰“桑耳”,至唐代甄权所著《药性论》时首次提及“桑黄”[1]。现代药理研究表明桑黄具有抑菌[2]、消炎[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、加强机体免疫[6]、保肝护肝[7]、降血糖[8]和降血脂[9]等20多种生理活性。但是目前尚缺乏从机体内源性代谢物的角度对桑黄药效作用机制的系统研究。
代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学等之后发展起来的系统生物学的一个新分支,可以从机体内源性代谢物角度研究中药治疗疾病的机理[10]。代谢组学于1999年由Nicholson等[11]首次提出,代谢组学可以通过对人或实验动物模型的尿液[12]、血液[13]、组织提取物[14]等生物终端代谢物的整体动态变化进行系统地分析,评价疾病的发生发展、中药药效物质及其作用机制,确定导致这些机体代谢物发生改变的作用位点、代谢途径和真正发挥作用的药效物质及其作用机制[15]。液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术分离性能优越、检测范围广、灵敏度高、定性功能强大[16-17],尤其是超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UPLC-HDMS)技术的出现同时满足了高速度、高灵敏度和高分辨率的要求,为代谢组学的研究提供了有力的工具[18-19]。
本课题组前期已开展了桑黄(Phellinus igniarius,为Phellinus spp.的一个种)干预后大鼠的血清代谢组学研究,在此基础上,利用UPLC-HDMS技术,检测灌胃给予桑黄水煎液28天后的大鼠尿液中代谢物的变化,并结合模式识别分析,寻找潜在的生物标志物,揭示桑黄给药前、后内源性代谢物的变化趋势,探讨桑黄产生作用的代谢通路,为研究桑黄药效作用机制奠定了基础。
Waters AcquityTM UPLC液相色谱仪、Waters SynaptTM High Definition MS (HDMS/MS) System质谱仪、MassLynx V4.1工作站、ACQUITY UPLCTMHSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、 KDC-160HR高速冷冻离心机(美国Waters公司); Thermo Savant Modulyo D冷冻干燥机(美国Thermo公司); 7020全自动生化分析仪(日本日立公司); VX-Ⅱ多管涡旋振荡器(北京踏锦科技有限公司); PB1501-N电子分析天平(上海梅特勒\5托利多有限公司);粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。
桑黄(杭州清正生物科技有限公司);甲醇、乙腈(色谱级,德国Merck公司);甲酸(色谱级,天津科密欧化学试剂有限公司);亮氨酸-脑啡肽(美国Sigma公司);戊巴比妥钠(德国Merck公司);蒸馏水(广州屈臣氏公司);其他试剂为国产分析纯。
称取桑黄子实体700 g,粉碎,加10倍体积的水浸泡1 h。加热至沸腾后保持微沸1 h,过滤,收集滤液。残渣再加5倍体积的水保持微沸煎煮0.5 h,过滤,收集滤液。合并滤液,浓缩,得生药含量为700 g/L的桑黄水煎液。
12只雄性Wistar大鼠((200±20) g)饲养于浙江省中医药研究院动物中心。自由摄食、饮水,适应性喂养7天。随机分成空白组(control group,n=6)和给药组(dosed group,n=6)。给药组每天按照7.5 mL/kg剂量灌胃给予桑黄水煎液,连续给药28天;空白组在实验周期内每天给予等量纯净水。
空白组和给药组大鼠在给药后第0、14和28天上代谢笼,收集24 h的尿液。尿液以5 000 r/min的速度离心15 min,取上清液,分装后作为待测尿样,置于-80 ℃保存。于第28天收集尿液后,用体积分数为2%的戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠,腹主静脉采血,置于真空肝素钠管中,于4 ℃下以4 000 r/min的速度离心15 min,取上清液。生化分析仪检测血浆中的葡萄糖(glucose)、甘油三酯(triglyceride)、胆固醇(cholesterol)、胆汁酸(bile acid)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)。
取1.4节待测尿样1 mL,室温解冻,于4 ℃下以13 000 r/min的速度离心15 min,取上清液,过0.22 μm滤膜,滤液用于UPLC-HDMS分析。
质控(quality control,QC)尿样的制备:取1.4节每组待测尿液样品各50 μL混合在一起,涡旋混匀。于4 ℃下以13 000 r/min的速度离心15 min。取上清液,经0.22 μm滤膜过滤,滤液用于UPLC-HDMS分析。在分析样品时,每分析6个普通样本后分析1个QC样本。
色谱条件:色谱柱为ACQUITY UPLCTM HSS T3柱,柱温为40 ℃,进样量为2 μL。流动相A为0.1%(体积分数)甲酸乙腈溶液,流动相B为0.1%(体积分数)甲酸水溶液,流速为0.4 mL/min。梯度洗脱程序:0～2.50 min,1%A～11%A; 2.50～6.00 min,11%A～21%A; 6.00～8.00 min,21%A～40%A; 8.00～8.50 min,40%A～60%A; 8.50～9.50 min,60%A～99%A; 9.50～11.25 min,99%A; 11.25～11.50 min,99%A～1%A。
质谱条件:电喷雾离子(ESI)源,采用正、负离子模式检测。正离子扫描参数:毛细管电压为2.8 kV,锥孔电压为40 V,提取电压为4.0 V,离子源温度为110 ℃,脱溶剂气温度为400 ℃,脱溶剂气流量为500 L/h,锥孔气流量为50 L/h。负离子扫描参数:毛细管电压为2.5 kV,锥孔电压为35 V,提取电压为3.5 V,离子源温度为110 ℃,脱溶剂气温度为350 ℃,脱溶剂气流量为500 L/h,锥孔气流量为50 L/h。采用亮氨酸-脑啡肽([M+H]+为m/z 556.277 1,[M-H]-为m/z 554.261 5)溶液为准确质量测定的锁定质量溶液。扫描范围为m/z 50～1 000。
采用MarkerLynx软件进行色谱峰识别和匹配,进行数据的模式识别分析,主要包括主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法(orthogonal projection to latent structures,OPLS)等模式识别方法。通过OPLS-DA(orthogonal partial least squares discriminant analysis)模型的S-plot筛选出变量投影重要性(variable importance for the projection,VIP)大于2的离子,找到具有显著性差异的离子,作为潜在生物标记物。并根据精确相对分子质量和二级质谱数据,结合HMDB、NIST、METLIN和KEGG等数据库进行检索,对各差异离子进行鉴定表征,各鉴定表征离子需符合质量误差小于5×10-6(5 ppm)。将鉴定表征后的差异代谢物导入MetaboAnalyst 3.0网站进行代谢通路分析,寻找相关代谢通路。
其他数据采用SPSS 19.0软件中的one-way ANOVA进行分析,数据用“均数±标准差(mean±SD)”表示,t检验中p＜0.01表示有显著性差异。
灌胃给予桑黄水煎液28天后的大鼠体重、主要血糖、血脂及肝功能指标等变化情况见表 1。与空白组相比,给药组的大鼠体重、主要血糖、血脂和肝功能指标均无显著性差异,但血浆中胆汁酸的含量显著增加,提示灌胃给予桑黄水煎液在不损伤肝脏正常生理功能的情况下,可以促进肝脏对胆汁酸的合成和分泌。胆汁酸是胆汁的重要组成部分,在动物机体内能够乳化脂肪,扩大脂肪与脂肪酶的接触面积,同时具有调控胰脂肪酶和脂蛋白酯酶的活性,提高其对脂肪的水解代谢,此外,胆汁酸还可促进脂肪的吸收[20]。桑黄可显著提高机体血浆中胆汁酸的含量,提示桑黄具有一定程度的调控脂质代谢、降低血脂的功能。
采用UPLC-HDMS联用技术对大鼠给药后第0、14和28天的空白组和给药组尿样进行分析。QC尿样的典型基峰强度(based peak intensity,BPI)图见图 1。使用Makerlynx软件进行色谱峰识别和匹配,并进行PCA非监督模式识别,结果见图 2。
图 2中C为空白组,S为给药组。在0天时由于空白组和给药组均未给药,二者在PCA上不能区分。给药14天后尚不能有效分离。给药28天后,在正离子模式下,给药组和空白组在主成分2上具有显著性差异,分离聚类明显;而在负离子模式下,给药组和空白组在主成分1上具有显著性差异。分析结果表明,在代谢组学层面上,给药组在药物作用下与空白组产生明显区分,体内代谢产物发生显著改变。
通过监督模式的OPLS-DA对空白组及给药组样品进行了分析,再通过OPLS-DA模型的S-plot筛选VIP大于2的离子,之后将这些离子通过SPSS 19.0进行one-way ANOVA分析,找到具有显著性差异的离子,并根据精确相对分子质量和二级质谱数据进行数据库检索,寻找潜在生物标记物,结果见图 3。与正常组相比(图 4),给药组尿液中6-磷酸葡萄糖、S-腺苷甲硫氨酸、羧基甲苯磺丁脲、次黄嘌呤和4-羟基-L-苏氨酸显著升高,而辛酰基葡萄糖醛酸苷、3-硫酸雌酮、神经氨酸、D-木糖和甲基鸟嘌呤则显著降低。6-磷酸葡萄糖是葡萄糖经过磷酸化后的产物,参与磷酸戊糖途径与糖酵解等体内重要能量代谢[21],6-磷酸葡萄糖水平的升高和D-木糖水平的降低在一定程度上提示桑黄可促进体内糖代谢,增强糖消耗,与文献[22]报道的桑黄降糖作用相一致。神经氨酸在本质上是最常见的唾液酸,研究表明可转移的癌细胞往往会产生丰富的唾液酸糖蛋白,这些糖蛋白能够帮助癌细胞进入血液而发生转移[23]。而甲基鸟嘌呤是天然存在的被修饰后的嘌呤,在癌症患者的血清和尿液中均发现其含量升高,特别是在结直肠癌患者尿中甲基鸟嘌呤含量的上升已被证实是肿瘤组织通过快速的核酸周转或增加核酸甲基化程度来实现的[24]。桑黄可有效降低神经氨酸和甲基鸟嘌呤在尿中的水平,这与桑黄抗肿瘤作用相一致,可能是桑黄抗肿瘤作用的机制之一。
图 5为将10个通过模式识别筛选出的差异代谢物导入MetaboAnalyst 3.0网站进行代谢通路分析得到的结果。可知灌胃给予桑黄水煎液后主要对机体的半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、嘌呤代谢等代谢通路产生了影响。
本研究采用UPLC-HDMS技术对灌胃给予桑黄水煎液28天后的大鼠尿液进行了代谢组学研究。用PCA和OPLS-DA等模式识别方法进行分析,共筛选出10个生物标志物,分别是6-磷酸葡萄糖、S-腺苷甲硫氨酸、羧基甲苯磺丁脲、次黄嘌呤、辛酰基葡萄糖醛酸苷、3-硫酸雌酮、神经氨酸、D-木糖、甲基鸟嘌呤和4-羟基-L-苏氨酸。经MetaboAnalyst 3.0网站分析,灌胃给予桑黄水煎液主要对机体的半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、嘌呤代谢等代谢通路产生了影响。生化检测结果表明服用桑黄不产生明显的肝毒性,同时在代谢层面提示桑黄具有一定的降糖、调脂和抗肿瘤活性,与文献报道一致。本研究为深入探讨桑黄药效作用机制奠定了一定的实验基础。
2016,
Vol. 34 Issue (8): 811-816
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