QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定棕榈原油中敌草快等6种农药残留


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王连珠¹, 李晓莲¹, 方恩华², 陈泳¹, 王登飞¹, 徐敦明²

1. 漳州出入境检验检疫局, 福建漳州 363100;
2. 厦门出入境检验检疫局, 福建厦门 361012

收稿日期：2016-04-12

基金项目：福建省自然科学基金项目(2011J01386,2016J01070)

通讯联系人： Tel:(0596)2175990,E-mail:wanglz0308@sohu.com

摘要：建立了QuEChERS-液相色谱-串联质谱同时测定棕榈原油中敌草快、乐果、倍硫磷、倍硫磷亚砜、倍硫磷砜、氟吡甲禾灵残留量的方法。以回收率及基质效应为考察指标,评估了乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)/C18混合物、C18键合锆胶(Z-Sep+)/C18混合物、Z-Sep+、C18 4种分散吸附剂的净化效果,结果表明Z-Sep+/C18的净化效果最佳。样品采用含1%(v/v)乙酸的甲醇溶液提取,Z-Sep+/C18分散固相萃取净化;液相色谱以Atlantis T3色谱柱梯度洗脱分离,质谱分析采用电喷雾正离子电离、多反应监测模式,以基质匹配校准曲线外标法进行定量。6种农药在3个添加水平(10、20、250 μg/kg)下的回收率范围为70.0%~97.9%,相对标准偏差范围为2.6%~10.2%; 6种农药的定量限(S/N≥10)为0.1~2.5 μg/kg。该方法简便、灵敏、准确、环保,适用于棕榈原油中上述6种农药残留的定性、定量分析。

关键词： QuEChERS 液相色谱-串联质谱敌草快农药残留棕榈原油氧化锆

Determination of six pesticide residues including diquat in crude palm oil by QuEChERS-liquid chromatography- tandem mass spectrometry

WANG Lianzhu¹, LI Xiaolian¹, FANG Enhua², CHEN Yong¹, WANG Dengfei¹, XU Dunming²

1. Zhangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhangzhou 363100, China ;
2. Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361012, China

Received: 2016-04-12

Foundation Item: Fujian Provincial Natural Science Foundation (Nos. 2011J01386, 2016J01070)

^* Corresponding author. Tel:(0596)2175990,E-mail:wanglz0308@sohu.com

Abstract: A fast method based on QuEChERS methodology was developed for the simultaneous determination of diquat, dimethoate, fenthion, fenthion-sulfoxide, fenthion-sulfone, haloxyfop-methyl in crude palm oil using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The clean-up effects of four dispersive sorbents were evaluated in terms of recoveries and matrix effects. The four sorbents were the mixture of primary secondary amine (PSA) and C18, a mixture of two sorbents a bonded C18 zirconia-coated silica (Z-Sep+) and C18, Z-Sep+, C18. As a result, the best effects were obtained from using the mixture of Z-Sep+ and C18 sorbents. The samples were extracted with methanol containing 1%(v/v) acetic acid. The extracts were cleaned up with dispersive solid phase extraction using Z-Sep+/C18 sorbents. Chromatographic analysis was carried out on an Atlantis T3 column with gradient elution. The pesticides were analyzed by positive electrospray ionization-tandem mass spectrometry under multiple reaction monitoring mode. The quantification was achieved using matrix-matched standard calibrations as external standard. The recoveries at the fortification levels of 10, 20 and 250 μg/kg in crude palm oil ranged from 70.0% to 97.9% with the relative standard deviations of 2.6%-10.2%. The limits of quantification (S/N≥10) were 0.1-2.5 μg/kg. The method has been proven to be simple, sensitive, accurate and environmental and thus suitable for the determination of the six pesticide residues above in crude palm oil.

Key words: QuEChERS liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) diquat pesticide residues crude palm oil zirconium dioxide

中国是棕榈油消费大国,是世界第三大棕榈油进口国,仅次于印度和欧盟。棕榈油具有营养成分较为丰富、应用广泛、价格低廉等特点,国内棕榈油消费需求日益增长,尤其是在反式脂肪酸及转基因食品广受关注后,全球市场上棕榈油作为氢化植物油和动物油脂的替代是大势所趋。

为保护消费者安全,食品安全国家标准^[1]规定植物油中敌草快、乐果的残留限量为0.05 mg/kg,氟吡甲禾灵的残留限量为1.0 mg/kg,倍硫磷及其氧类化合物(亚砜、砜化合物)之和(以倍硫磷表示)为0.01 mg/kg。国际食品法典委员会(CAC)及日本亦规定食用植物油/粗植物油中敌草快的残留限量为0.05 mg/kg^[2]。敌草快是一种高效、中等毒性、持效期长的联吡啶类除草剂,为碱性的阳离子有机化合物(结构见图 1),几乎不被憎水性的反相色谱柱保留。由于其独特的物理化学性质,近期国内外建立的多残留分析方法均不包含敌草快的测定^[3-5]。敌草快的测定方法有气相色谱-质谱法(GC-MS)^[6]、液相色谱法^[7]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)^[8-11]。GC-MS需柱前衍生,操作繁琐;LC-MS/MS具有灵敏度高、选择性强、前处理简单的特点而成为测定敌草快的主流方法^[8-11]。徐娟等^[5]采用乙腈提取、低温冷冻及C18+乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)分散固相萃取净化、LC-MS/MS测定植物油中104种农药残留;Moreno-González等^[12]采用乙腈提取、碳十八键合锆胶(Z-Sep+)分散固相萃取净化、LC-MS/MS测定植物油中31种氨基甲酸酯类农药残留,而植物油中敌草快与乐果、倍硫磷、氟吡甲禾灵等农药残留的同时测定方法至今未见报道。

图 1 敌草快的化学结构 Fig. 1 Chemical structure of diquat

氧化锆键合硅胶(zirconia-coated silica,Z-Sep)及碳十八键合锆胶(bonded C18 zirconia-coated silica,Z-Sep+)是新的固相吸附剂,能有效吸附保留脂肪等而应用于植物油^[12]、鱼肉^[13]、高含油植物产品(牛油果、杏仁)^{[14, 15]}、玉米和毛豆^[16]中农药等多残留分析的分散固相萃取净化。本文采用Z-Sep+/C18混合物为分散固相吸附剂,建立了基于QuEChERS方法的液相色谱-串联质谱同时测定棕榈原油中敌草快、氟吡甲禾灵、乐果、倍硫磷、倍硫磷亚砜、倍硫磷砜残留量的方法。该方法灵敏、快速、准确、环保。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

API 4000三重四极杆质谱仪(美国AB公司),配电喷雾离子源;1200 Series液相色谱仪(美国Agilent公司); T25高速分散机(德国IKA公司); Milli-Q高纯水发生器(美国Millipore公司); Sigma 3-30K高速冷冻离心机(德国Sigma公司); XP205分析天平(感量0.01 mg,瑞士Mettler公司)。

Supel^TMQuE Z-Sep+分散吸附剂(美国Supelco公司),PSA及C18吸附剂(40 μm,美国Agilent公司)。无水硫酸镁(MgSO₄)、氯化钠(NaCl)、乙酸钠均为分析纯(上海国药集团);甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck公司),甲酸、乙酸为色谱纯(美国Fluka公司)。实验用水均为高纯水(经Milli-Q超纯水器纯化)。

敌草快、氟吡甲禾灵、乐果、倍硫磷、倍硫磷亚砜、倍硫磷砜标准品(纯度大于99.8%,Sigma-Aldrich公司),以甲醇配制质量浓度为100 mg/L的各农药单标准溶液;再用甲醇稀释为1.0 mg/L的6种农药混合标准溶液,-18 ℃下储存。

基质匹配标准溶液:移取6份各0.5 mL空白样品提取液于2 mL离心管中,以弱氮气(N₂)流吹至近干,分别加入50 μg/L的农药标准溶液20、40、100、200、500 μL,各补加甲醇至500 μL,再各加0.5 mL水混匀,配制成1.0、2.0、5.0、10.0、25.0 μg/L相应的基质匹配标准溶液,经0.2 μm微孔膜过滤供LC-MS/MS分析。基质匹配标准溶液现配现用。

1.2 样品前处理

称取2.00 g均质试样于50 mL具塞离心管中,加入2 mL正己烷,再加入含1%(v/v)乙酸的甲醇溶液10.0 mL,涡旋1 min,于9 500 r/min、4 ℃下离心5 min;取上层溶液1.0 mL于预先加有Z-Sep+/C18 (75 mg/100 mg)混合物的离心管中,涡旋30 s,于9 500 r/min、4 ℃下离心5 min,静置20 min;取0.5 mL净化液至离心管中,再加0.5 mL水混匀,经0.2 μm微孔膜过滤供LC-MS/MS分析。

1.3 色谱和质谱条件

Waters Atlantis^® T3色谱柱(150 mm×2.1 mm,3 μm);柱温35 ℃;进样体积10 μL。流动相A为0.1%(v/v)甲酸水溶液,流动相B为0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液;梯度洗脱程序:0～4 min,40%B; 4～15 min,40%B～100%B; 15～18 min,100%B; 18～21 min,100%B～40%B; 21～31 min,40%B;流速为0.2 mL/min。

电喷雾离子化,正离子模式;电喷雾电压5 500 V;雾化气流速55 mL/min,辅助气流速55 mL/min,气帘气流速20 mL/min,离子源温度500 ℃,仪器工作软件为Analyst 1.5,多反应监测(MRM)模式扫描,其他条件见表 1。

表 1 6种农药的保留时间及质谱分析参数 Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters for the six pesticides

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

敌草快为碱性阳离子有机化合物,在低pH条件下电离为阳离子,几乎不被憎水性的反相色谱柱保留,因此色谱分离一般采用亲水相互作用模式色谱柱(HILIC)^[8-10]。但HILIC色谱柱不能分离如乐果、倍硫磷、氟吡甲禾灵等中等极性及弱极性化合物,采用Waters Atlantis HILIC色谱柱(150 mm×2.1 mm,3 μm)分离以上6种化合物时,除敌草快外其他5种化合物均不保留,5种化合物堆积在一起而且峰形拖尾。

Waters Atlantis^® T3色谱柱(150 mm×2.1 mm,3 μm)采用三官能团键合技术,低配基密度(～1.6 μmol/m²)C18烷基链键合和特殊的端基封尾技术,通过减少C18的覆盖率,极性化合物更易“进入”C18链之间,与C18链充分发挥保留作用以及与填料孔中残存硅羟基发生相互作用,在增强极性化合物保留能力的同时,维持了对中等极性及疏水化合物的适度保留能力。本文采用Waters Atlantis^T3色谱柱,6种化合物能很好地分离,而且峰形尖锐不拖尾(见图 2)。

图 2 6种农药混合标准溶液(1.0 μg/L)的提取离子色谱图 Fig. 2 Extracted ion chromatograms of a mixture of the six pesticides standards (1.0 μg/L) 1. diquat,2. dimethoate,3. fenthion-sulfoxide,4. fenthion-sulfone,5. fenthion,6. haloxyfop-methyl.

流动相中加入0.1%(v/v)的甲酸可降低色谱柱残余硅羟基的活性,对于碱性化合物有较好的峰形,而且在正离子电离模式下加入甲酸有利于目标化合物离子化,从而提高化合物响应值;采用0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液和0.1%(v/v)甲酸水溶液为流动相获得了较好的峰形及较高的响应值。图 2为在优化的色谱-质谱条件下6种农药混合标准溶液的提取离子色谱图,图 3为按1.2节进行前处理的棕榈原油加标样品的提取离子色谱图。

图 3 添加6种农药(添加水平为10 μg/kg)的棕榈原油样品的提取离子色谱图 Fig. 3 Extracted ion chromatograms of the six pesticides spiked in crude palm oil at 10 μg/kg for each pesticide 1. diquat; 2. dimethoate; 3. fenthion-sulfoxide; 4. fenthion-sulfone; 5. fenthion; 6. haloxyfop-methyl.

2.2 提取溶剂的选择

敌草快溶于水,微溶于乙醇和其他带羟基的溶剂,在酸性和中性溶液中稳定,在碱性条件下不稳定,一般采用甲醇-盐酸溶液提取^{[8, 11]}。在已建立的多农药残留分析方法中,乐果、倍硫磷、氟吡甲禾灵均采用乙腈提取^{[3-5, 13-15]}。采用甲醇加酸性水溶液提取,由于甲醇与水互溶,盐析也不能分层,不利于后续的分散固相萃取净化。

比较5种溶剂((1)乙腈,(2)1%(v/v)乙酸乙腈溶液,(3)甲醇-乙腈(1∶1,v/v),(4)甲醇,(5)1%(v/v)乙酸甲醇溶液)对6种目标化合物的提取效果。在20 μg/kg添加水平下,按照1.2节方法进行前处理，5种溶剂对目标物的平均回收率(n=4)见表 2。结果显示:采用乙腈提取,敌草快的回收率小于20%;采用甲醇-乙腈(1∶1,v/v)提取,敌草快的回收率有所提高(35.7%),但仍然达不到要求;采用甲醇提取,敌草快的回收率达到75%,但倍硫磷及氟吡甲禾灵的回收率低于70%;采用1%(v/v)乙酸甲醇溶液提取,6种化合物的回收率均大于70%。因此本文采用1%(v/v)乙酸甲醇溶液提取。

表 2 μg/kg添加水平下5种溶剂提取目标物的回收率比较(n=4) Table 2 Comparison of recoveries of the analytes spiked at 20 μg/kg extracted with five solutions (n=4)

由于棕榈油具有一定的黏性,加入2 mL正己烷溶解油样后再用1%(v/v)乙酸甲醇溶液提取,可以将基体分散均匀,提高对目标物的提取效率。甲醇沸点低,涡旋提取时须旋紧离心管盖,并于4 ℃下离心,以防止甲醇挥发而引起溶剂体积变化。

2.3 分散吸附剂的选择

去除基质干扰物是测定脂肪基质中农药残留的关键点,需要优化分散固相萃取净化条件以获得较低的基质效应。

试验发现,在同样的净化条件下,采用甲醇提取6种化合物的基质效应显著高于乙腈提取,可见采用甲醇提取带入了较多的基质干扰物。

以回收率及基质效应指标考察4种分散吸附剂((1)75 mg C18+75 mg PSA,(2)75 mg C18+75 mg Z-Sep+,(3)150 mg Z-Sep+,(4)150 mg C18)的净化效果。在20 μg/kg添加水平下,按照1.2节方法进行前处理,分别采用以上4种分散吸附剂进行净化,并按照1.1节配制系列浓度的基质匹配标准溶液及纯溶剂标准溶液,绘制标准曲线,按照以下公式对基质效应进行量化评估:基质效应(ME)=[(基质匹配校准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率)-1]×100%。|ME|＜20%为弱基质效应,可忽略而无需采取补偿措施;20%≤|ME|≤50%为中等程度基质效应,|ME|＞50%为强基质效应,均须采取措施补偿基质效应^{[14, 15]}。测得的回收率结果见图 4,基质效应的结果见图 5。

图 4 采用不同分散吸附剂净化时目标物的回收率(n=4) Fig. 4 Recoveries of the analytes cleaned-up using different dispersive sorbents(n=4)

图 5 采用不同分散吸附剂净化时目标物的基质效应 Fig. 5 Matrix effects (MEs) of the analytes cleaned-up using different dispersive sorbents ME=[(slope matrix/slope solvent)-1]×100%.

图 4结果显示:采用C18+PSA净化,倍硫磷及氟吡甲禾灵的回收率低于60%,相对标准偏差也较大。单纯采用Z-Sep+净化,倍硫磷及氟吡甲禾灵的回收率低于70%;只采用C18净化,敌草快及乐果的回收率仅为50%;采用C18+Z-Sep+净化效果最好,6种化合物的回收率均大于70%,RSD≤10%。

图 5结果表明:4种分散吸附剂净化后,6种化合物均显示基质抑制效应,在本文色谱条件下最晚出峰的倍硫磷及氟吡甲禾灵均表现为强基质效应,特别是氟吡甲禾灵的基质效应最大。从图 2及图 3相同浓度化合物在纯溶剂及基质中的响应值变化亦显示氟吡甲禾灵的基质抑制效应最强。4种分散吸附剂中采用C18+Z-Sep+吸附剂净化6种化合物的基质效应最小,净化效果最好。采用C18净化,6种化合物的基质效应最大,最早出峰的敌草快也显示强基质效应。采用C18+PSA净化,敌草快、乐果、倍硫磷亚砜、倍硫磷砜4种化合物的基质效应略高于采用C18+Z-Sep+净化,而倍硫磷及氟吡甲禾灵的基质效应与采用C18+Z-Sep+净化的结果基本一致。单纯采用Z-Sep+净化,氟吡甲禾灵的基质效应高于采用C18+Z-Sep+净化,敌草快的基质效应略优于采用C18+Z-Sep+净化,其他4种化合物的基质效应与采用C18+PSA净化的结果相当。

二氧化锆(ZrO₂)是同时具有表面酸性位和碱性位的过渡金属氧化物,具有路易斯酸-碱的特性,ZrO₂水相体系的等电点(pI)在pH=6附近,当外界溶液的pH=pI时,整个分子不带电;当外界溶液pH＜pI时,两性离子质子化带正电;当外界溶液的pH＞pI时,两性离子释放质子带负电^[13]。本文采用1%(v/v)乙酸甲醇溶液提取,二氧化锆两性离子在酸性条件下质子化带正电,对羧酸、柠檬酸、油酸等极性物质具有较强的吸附能力^[14],因此表现为较强极性的敌草快、乐果等显示弱基质效应。倍硫磷及氟吡甲禾灵的基质效应最大,说明提取液中含有较多非极性基质干扰物,需要加入C18吸附剂以增加对非极性基质干扰物的去除能力。

进一步优化C18及Z-Sep+吸附剂的使用量,发现减少Z-Sep+用量(50 g/L)会增加敌草快的基质效应;增加C18使用量(100 g/L)可进一步降低氟吡甲禾灵的基质效应,继续增大C18用量则无益。因此确定每毫升提取液中加入100 mg C18及75 mg Z-Sep+进行分散固相萃取净化。

2.4 方法学评价

按照本文1.2节前处理并配制基质匹配校准溶液,在1.0～200 μg/L范围内6种化合物在棕榈原油中的基质匹配标准溶液的质量浓度(x)与对应的峰面积(y)呈良好的线性关系,相关系数(r)为0.997 6～1.000 0(见表 3)。

表 3 方法定量限(LOQ)、基质匹配标准溶液的线性关系、棕榈原油中3个添加水平下的回收率(Rec.)和相对标准偏差(RSD)(n=6) Table 3 Limits of quantification (LOQs) of the method,linear relationships of matrix-matched standard solutions, recoveries (Rec.) and relative standard deviations (RSDs) at three spiking levels in crude palm oil (n=6)

在棕榈原油基质中各添加10、20、250 μg/kg的6种农药混合标准溶液进行回收率试验,每个添加水平重复测定6次,6种农药的回收率为70.0%～97.9%,相对标准偏差为2.6%～10.2%(见表 3)。

以10 μg/kg加标样品定量离子对色谱信号的3倍信噪比(S/N=3)确定方法检出限为0.1～0.8 μg/kg,以S/N≥10确定方法定量限为0.1～2.5 μg/kg(见表 3),符合国内外残留限量要求^{[1, 2]}。

3 结论

通过优化色谱分离技术、提取溶剂及分散固相萃取净化条件,建立了一次提取同时测定棕榈原油中敌草快、乐果、倍硫磷、倍硫磷亚砜、倍硫磷砜、氟吡甲禾灵6种农药残留的方法。采用1%(v/v)乙酸甲醇溶液提取、C18+Z-Sep+分散固相萃取净化、液相色谱-电喷雾正离子电离-三重四极杆串联质谱检测技术,可同时提取测定强极性化合物敌草快及弱极性化合物氟吡甲禾灵等宽极性化合物。该方法简便快速、灵敏准确、节省环保。所建立的方法适用于棕榈原油中敌草快、乐果、倍硫磷、倍硫磷亚砜、倍硫磷砜、氟吡甲禾灵6种农药残留的测定。该方法亦可适用于其他植物原油及植物油中以上6种农药的定性、定量测定。

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