色谱  2016, Vol. 34 Issue (10): 946-950   PDF    
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张水锋
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姜侃
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王越
陈小珍
朱岩
曾宪远
梯度洗脱优化-离子色谱-脉冲安培法分析婴幼儿配方乳粉中的糖和糖醇
张水锋1,2, 盛华栋1, 姜侃1, 潘项捷1, 张慧1, 张东雷1, 王越1, 陈小珍1, 朱岩2, 曾宪远3     
1. 浙江省质量检测科学研究院, 浙江 杭州 310018;
2. 浙江大学化学系, 浙江 杭州 310010;
3. 惠州市食品药品检验所, 广东 惠州 516003
收稿日期：2016-04-13
基金项目：国家重大科学仪器设备开发专项（2012YQ09022903）；浙江省公益性技术应用研究计划项目（2015C37055）；浙江省质监局科技计划项目（20160102）.
通讯联系人： Tel:(0571)88273637,E-mail:zhuyan@zju.edu.cn
摘要：建立了梯度洗脱优化-离子色谱-脉冲安培检测技术分析婴幼儿配方乳粉中麦芽糖醇、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖6种与代谢疾病紧密相关的糖和糖醇的方法。该方法对样品的前处理、色谱柱的选择、淋洗液的梯度等色谱条件进行了优化，重点研究了淋洗液梯度对各组分分离效果的影响。将梯度洗脱程序分解为弱保留组分分离、乳糖分离、基质消除、系统平衡4个子程序，并分别对其进行了条件优化，实现了6种组分的完全分离，并有效解决了弱保留组分色谱峰易重叠、乳糖色谱峰易拖尾等现象。6种组分的线性范围为0.5~100 mg/L，相关系数（r）>0.99，方法的检出限（S/N=3）为0.06~0.40 mg/L。该方法具有分离度好、灵敏度高等优点，可满足例行分析的要求，同时也为淋洗液的梯度优化提供了可借鉴的方法。
关键词： 离子色谱     脉冲安培检测     梯度洗脱     糖     糖醇     婴幼儿配方乳粉    
Determination of carbohydrates and sugar alcohol in infant formula by ion chromatography with pulsed amperometric detection and an optimized gradient elution
ZHANG Shuifeng1,2, SHENG Huadong1, JIANG Kan1, PAN Xiangjie1, ZHANG Hui1, ZHANG Donglei1, WANG Yue1, CHEN Xiaozhen1, ZHU Yan2, ZENG Xianyuan3     
1. Zhejiang Institute of Quality Inspection Science, Hangzhou 310018, China ;
2. Department of Chemistry, Zhejiang University, Hangzhou 310010, China ;
3. Huizhou Institute for Food and Drug Control, Huizhou 516003, China
Received: 2016-04-13
Foundation Item: National Important Project on Science Instrument (No. 2012YQ09022903); Zhejiang Provincial Public Welfare Technology Application Research Project (No. 2015C37055); Science and Technology Planning Project of Zhejiang Province Quality Supervision Bureau (No. 20160102).
* Corresponding author. Tel:(0571)88273637,E-mail:zhuyan@zju.edu.cn
Abstract: A method was developed for the determination of carbohydrates and sugar alcohol related closely to metabolic diseases in infant formula, including maltitol, galactose, glucose, sucrose, fructose and lactose, by ion chromatography (IC) with pulsed amperometric detection and an optimized gradient elution. The developed method included the systematic optimizations of sample pre-treatment, column selection and gradient elution. And more attention has been paid to optimizing the gradient elution program. According to the chromatographic behavior of the targets, the total gradient elution was divided into four subprograms, including separation of the analytes with weaker retentions, separation of lactose, matrix elimination and system equilibrium, and each part was also optimized in detail. By the optimized gradient elution, both negative chromatographic phenomena of overlapping between analytes with weak retentions and tailing for lactose were eliminated well, and all of the analytes were separated completely. Both maltitol and galactose were fitted well with quadratic curve, and the others were fitted well with linear equation, with the correlation coefficients (r) greater than 0.99, in the concentration range of 0.5-100 mg/L, with the limits of detection (LODs) (S/N=3) of 0.06-0.40 mg/L. The developed method offered a helpful method for gradient elution optimization, and it had been used for the determination of the real samples. It was proved to be feasible for routine analysis.
Key words: ion chromatography (IC)     pulsed amperometric detection     gradient elution     carbohydrates     sugar alcohol     infant formula    

婴幼儿配方乳粉中糖及相关化合物的种类和含量与婴幼儿的乳糖不耐症、半乳糖血症等代谢疾病密切相关,因此建立婴幼儿配方乳粉中糖及相关化合物的检测方法至关重要。目前用于糖类分析的方法主要有液相色谱-示差折光检测法[1]或蒸发光散射检测法[2]、气相色谱法[3]、气相色谱-质谱联用法[4]、酶解法[5]、离子色谱法[6-8]等。液相色谱法受检测器的影响,灵敏度较低;气相色谱及气相色谱-质谱联用法分离效果好,灵敏度高,但样品前处理步骤复杂,一般对目标分析物需进行硅烷化反应,反应条件较为苛刻,需在无水条件下进行;酶解法专一性强,但检出限相对较高。离子色谱-电化学检测法结合优化的梯度洗脱程序[9, 10]在糖及相关化合物的分析中展现出独特的优势,具有分离能力强、灵敏度高,选择性好等优点[11, 12],已被美国分析化学家协会(AOAC)等国际组织广泛应用于各类食品的分析检测中[13]。由于婴幼儿配方乳粉的基质十分复杂,含糖种类多且浓度相差大,对分离条件的要求较高。目前关于离子色谱法分析乳制品中糖类的报道较多,但采用离子色谱法同时分析糖醇、单糖、二糖时常存在弱保留组分分离易重叠[14]、乳糖的色谱峰易拖尾[15]等现象,在例行分析时结果的重现性较差[16]。

本文选择乳粉中与婴幼儿常见代谢疾病密切相关的麦芽糖醇、半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖进行研究,建立了离子色谱-脉冲安培检测的分析方法,并根据目标分析物保留行为的特点对梯度洗脱程序进行了优化,解决了实际样品分析时弱保留组分色谱峰易重叠、乳糖易拖尾等现象。建立的分析方法可满足例行分析的要求。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

ICS-5000离子色谱系统配有四元梯度泵、电化学检测器(配有三电极检测体系(金盘工作电极、pH-Ag/AgCl复合参比电极、钛对电极))与色谱模块,CarbonPac PA1分析柱(250 mm×4 mm,10.0 μm)、保护柱(50 mm×4 mm,10.0 μm),Biofuge Stratos高速离心机(美国Thermo Scientific公司); Chromeleon 6.80 SR9色谱工作站(美国ThermoFisher公司); DS-2510 DTH超声波处理器(上海声析超声仪器有限公司)。实验用水均为Milli-Q系统(美国Millipore公司)制备的超纯水(电阻率≥18.2 MΩ\5cm)。

50%(质量分数)氢氧化钠(NaOH)溶液、甲醇(色谱纯)均购自德国Merck公司;乙酸钠(NaOAc,纯度≥99.9%)购自美国Thermo Scientific公司;冰醋酸(分析纯)购自杭州化学试剂有限公司;其他试剂均为分析纯或以上等级。C18固相萃取小柱(6 mL/500 g,北京迪马欧泰科技发展中心),使用前依次用3 mL甲醇、5 mL去离子水活化。所有样品溶液,进样前均过0.2 μm聚四氟乙烯亲水滤膜(美国Millipore公司)。实验样品为市售婴幼儿配方乳粉。

麦芽糖醇、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖(纯度≥99.0%)均购自美国Sigma-Aldrich公司。分别称取0.1 g上述标准品至100 mL容量瓶中，用水充分溶解并定容，配制质量浓度为1 g/L的标准储备液,于4 ℃冷藏储存,保存期为15天。各水平标准溶液用去离子水稀释至所需浓度,现配现用。

淋洗液A为去离子水,取1 L去离子水,充氮气20 min,在氮气保护下封存(下同);淋洗液B为1 mol/L NaOH溶液,取80.0 g 50% NaOH溶液,加入1 L去离子水,充分混匀,充氮气20 min,在氮气保护下封存;淋洗液C为0.3 mol/L NaOAc溶液,精确称取20.6 g NaOAc于1 L去离子水中,搅拌5 min,充分混匀,过0.2 μm尼龙滤膜,在氮气保护下封存。

1.2 样品前处理

称取约2.0 g(精确至0.1 mg)婴幼儿配方乳粉样品于50 mL玻璃烧杯中,加入25 mL去离子水,混匀,超声10 min后,转移至100 mL容量瓶中,加入60 μL冰醋酸,混匀,用去离子水定容至刻度,于4 ℃静置60 min,促使蛋白质沉淀。取上述溶液25 mL,以10 000 r/min离心10 min,吸取1 mL溶液,用去离子水稀释至25 mL后，过C18固相萃取小柱净化。弃去前3 mL溶液,收集后面的滤液,过0.2 μm滤膜,得澄清试液。将上述清液一分为二,一份直接进样测麦芽糖醇、半乳糖、葡萄糖、蔗糖和果糖的含量,另一份试液取1 mL稀释至10 mL后,过0.2 μm滤膜,测乳糖的含量。

1.3 仪器条件

色谱柱为CarbonPac PA1；流速为1.0 mL/min;柱温为30 ℃;进样体积为10 μL。采用脉冲安培检测法进行分析,检测池温度为30 ℃。检测波形为三电位波形,参数设定为0～0.40 s,0.05 V; 0.41～0.60 s,0.75 V; 0.61～1.00 s,-0.15 V;信号采集时间为0.20～0.40 s。采用梯度洗脱的方法进行分离,梯度洗脱程序如表 1所示。

表 1 梯度洗脱程序 Table 1 The program of gradient elution
2 结果与讨论
2.1 样品前处理的优化

由于婴幼儿配方乳粉成分复杂,蛋白质及其他营养成分种类较多,易对色谱柱及检测器造成不可逆的损坏并对检测结果产生干扰,因此需在样品前处理的过程中将蛋白质完全去除。去除蛋白质的方法一般有重金属沉淀法[17]、pH调节法[18]等。考虑到金属离子的不利影响,排除了用亚铁氰化钾、乙酸锌体系沉淀蛋白质的方法。本实验采用冰醋酸沉淀蛋白质,取样品6份,分别加入30、40、50、60、70、80 μL冰醋酸,考察蛋白质的沉淀情况。结果表明,加入60 μL冰醋酸时,样品中的蛋白质完全沉淀,因此确定加入冰醋酸的体积为60 μL。

为降低脂类及脂溶性物质对色谱分离的影响,采用C18固相萃取小柱对沉淀蛋白质后的样品溶液进行净化处理。上机测试前,用0.2 μm聚四氟乙烯亲水滤膜进行过滤,除去溶液中可能存在的固体杂质,最终得到满足实验要求的上机测试液。

2.2 色谱柱的选择

CarbonPac MA1柱主要适合弱离子化糖醇的分析;CarbonPac PA1柱适合分析单糖、双糖、低聚糖等;CarbonPac PA10与CarbonPac PA20柱适合分析单糖,与氨基捕获柱结合使用,可以分析糖蛋白单糖。本实验分别对CarbonPac MA1、PA1、PA20柱的分离效果进行了比较。结果表明,CarbonPac MA1柱容量大(1 450 μeq/柱),对麦芽糖醇、半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖的分离效果较好,但对乳糖的分析时间较长;CarbonPac PA1柱容量适中,在优化的梯度洗脱程序下,各组分均得到较好的分离,且峰形对称、分析时间适中;CarbonPac PA20柱分离速度快,但对NaOH的浓度十分敏感,保留时间易漂移,并且对半乳糖和葡萄糖的分离度不如CarbonPac PA1柱。因此本实验选择CarbonPac PA1柱作为分析柱。

2.3 梯度洗脱程序的优化

除乳糖的保留时间相对较长外,其他组分在PA1柱上的保留时间相对较短,因此采用梯度洗脱程序优化分离效果。实验采用(A)去离子水、(B)1 mol/L NaOH溶液和(C)0.3 mol/L NaOAc溶液组成三元流动相,进行梯度洗脱试验。

首先进行等度洗脱试验,NaOH溶液的浓度选为0.01、0.02和0.03 mol/L。当NaOH的浓度为0.01 mol/L时,乳糖的保留时间超过50 min,其他组分的色谱峰展宽明显,灵敏度降低；当浓度增加至0.02 mol/L时,6种组分均能实现基线分离,但乳糖完全出峰的时间需48 min,且色谱峰拖尾严重,峰宽达10 min；当浓度为0.03 mol/L时,半乳糖、葡萄糖的色谱峰出现明显的重叠现象。线性增加NaOH的浓度(0.02～0.03 mol/L)进行梯度洗脱试验,麦芽糖醇、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖5种弱保留组分在20 min内实现了有效分离,且峰形较好(见图 1a)。当NaOH的浓度增加至0.06 mol/L时,果糖与蔗糖的保留时间重叠,而乳糖的色谱峰仍存在明显的拖尾现象,说明乳糖洗脱时需对淋洗液作进一步优化。

图 1 不同淋洗液梯度下6种分析物的色谱图 Fig. 1 Chromatograms of the six analytes with different gradient elutions a. 0-50.0 min,98%A (H2O)+2%B (1 mol/L NaOH); 50.1-55.0 min,15%B+85%C (NaOAc); 55.1-70.0 min,98%A+2%B; b. as shown in Table 1.
Peaks: 1. maltitol; 2. galactose; 3. glucose; 4. fructose; 5. sucrose; 6. lactose; 7. matrix.

在5种弱保留组分实现有效分离的基础上对乳糖的分离条件进行深入优化。乳糖为二糖,电离的羟基数目较多,在色谱柱上形成强保留,分析时间较长。乳糖在低浓度的NaOH溶液中电离不充分,易形成拖尾峰(见图 1a),因此通过提高淋洗液的洗脱强度,抑制乳糖色谱峰的拖尾现象。在弱保留组分完全分离后(约20 min),线性增加NaOH溶液的浓度(0.03～0.15 mol/L),对乳糖进行梯度洗脱。乳糖在流动相中充分离子化,有效抑制了拖尾现象。当NaOH的浓度超过0.15 mol/L时,乳糖与基质峰存在重叠现象,因此NaOH的浓度上限设为0.15 mol/L。

同时考察了淋洗液切换到冲洗程序的时间点对乳糖和基质分离度的影响。在乳糖的保留时间前切换,易导致乳糖与基质的色谱峰重叠;在保留时间后切换,则易引起乳糖色谱峰的拓宽。因此将切换时间设为乳糖色谱峰的最高点，约30 min时(见图 1b)。

优化后的淋洗液梯度程序由4个子梯度程序组成:(1)麦芽糖醇、半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖5种弱保留组分的分离程序,线性增加NaOH溶液的浓度(0.02～0.03 mol/L),对目标组分进行梯度洗脱,时间为0～20.0 min;(2)乳糖的分离程序,线性增加NaOH溶液的浓度(0.03～0.15 mol/L),时间为20.0～30.0 min; (3)基质消除程序,以15% 1 mol/L NaOH溶液与85% 0.3 mol/L NaOAc溶液组成的强淋洗液对基质进行洗脱、对色谱柱进行再生,时间为30.1～35.0 min;(4)系统平衡程序,待基质完全洗脱后,以初始淋洗液对系统进行充分平衡,时间为35.1～45.0 min。6种分析物在优化的淋洗液梯度洗脱程序中实现了完全分离,乳糖色谱峰的峰形尖锐,有效消除了拖尾现象(见图 1b)。

2.4 方法学验证
2.4.1 标准曲线

分别配制质量浓度为0.5、2.0、20.0、50.0、80.0、100.0 mg/L 6种分析物的混合标准溶液,以峰面积(y)为纵坐标,质量浓度(x,mg/L)为横坐标,绘制标准工作曲线。各组分的标准工作曲线、相关系数(r)、检出限(LOD,S/N=3)见表 2。在0.5～100.0 mg/L质量浓度范围内,麦芽糖醇与半乳糖符合二次曲线拟合,葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖符合线性拟合,相关系数(r)为0.999 5～0.999 9,检出限为0.06～0.40 mg/L。国家标准GB 5413.5-2010[19]采用液相色谱-示差折光检测法分析婴幼儿食品和乳品中的乳糖和蔗糖,检出限为0.3 g/100 g,折算为上机测试液的质量浓度为30 mg/L。与国标方法相比,本方法灵敏度更高。

表 2 6种化合物的曲线方程、相关系数(r)和检出限(S/N=3) Table 2 Curve equations,correlation coefficients (r) and LODs (S/N=3) of the six compounds
2.4.2 精密度

在优化的色谱条件下,在一天内每间隔1 h对质量浓度为50.0 mg/L的混合标准溶液测试1次,各组分峰面积的RSD小于5.3%(n=6)。

2.5 实际样品的测定

利用本实验建立的方法对市售某品牌婴幼儿配方乳粉进行分析,称取5份平行样品,每份样品得到样液2份,一份测保留较弱的5种组分,另一份稀释后检测乳糖。婴幼儿配方乳粉中6种分析物的色谱图见图 2。

图 2 婴幼儿配方乳粉样品中6种分析物的色谱图 Fig. 2 Chromatogram of the six analytes in an infant formula sample Peaks: 1. galactose; 2. glucose; 3. fructose; 4. sucrose; 5. lactose; 6. matrix.

婴幼儿配方乳粉中6种分析物的含量见表 3。根据实际样品中6种组分的含量，分别配制质量浓度为50 g/L的麦芽糖醇、果糖、乳糖单标准溶液和质量浓度1 g/L的半乳糖、葡萄糖、蔗糖单标准溶液。在3个添加水平下进行加标回收率试验。实际样品的加标回收率为82.0%～106%,RSD为2.54%～5.90%(n=5)。

表 3 实际样品中6种分析物的含量、加标回收率和相对标准偏差(n=5) Table 3 Contents,spiked recoveries and RSDs of the six analytes in a real sample (n=5)
3 结论

本文建立了梯度洗脱-离子色谱-脉冲安培检测技术分析婴幼儿配方乳粉中麦芽糖醇、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖的方法,并对样品的前处理、色谱柱的选择、淋洗液的梯度等色谱条件进行了优化。通过将梯度洗脱程序划分为弱保留组分分离、乳糖分离、基质消除、系统平衡4个子梯度程序,有效消除了弱保留组分的重叠、乳糖拖尾等现象,实现了6种与婴幼儿代谢疾病密切相关的糖和糖醇的基线分离。相比传统液相色谱光学检测法,本方法具有分离能力强,检测灵敏度高等优点,可满足例行分析的要求。

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