Edman降解中异硫氰酸苯酯新修饰位点的发现和验证


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周艳卿, 蒋小岗

苏州大学药学院, 江苏苏州 215123

收稿日期：2016-04-15

基金项目：国家自然科学基金项目（31470772）

通讯联系人： Tel:(0512)65882370,E-mail:jiangxiaogang@suda.edu.cn

摘要：Edman降解是最早建立的一种用于多肽和蛋白质氨基端测序的方法，该方法现在仍被广泛用于生物化学领域。随着高通量蛋白质组学技术的发展和应用，该方法中的异硫氰酸苯酯反应被用于修饰蛋白质氨基端，并用于检测蛋白质水解位点。但还没有异硫氰酸苯酯是否可以修饰其他氨基酸侧链并影响多肽序列分析的研究。为了探究其修饰其他氨基酸的可能性，本文利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）研究了异硫氰酸苯酯对一个模型肽的化学修饰。质谱数据解析后发现在高浓度异硫氰酸苯酯的反应条件下，组氨酸上可以引入一个新的异硫氰酸苯酯修饰位点。这一修饰位点的发现预示着通过改变实验条件或分析方法，可以更准确地利用Edman降解和蛋白质组学技术分析多肽和蛋白质。

关键词：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱液相色谱-串联质谱 Edman降解异硫氰酸苯酯模型肽组氨酸

Discovery and validation of a novel modification by phenyl isothiocyanate in Edman degradation

ZHOU Yanqing, JIANG Xiaogang

College of Pharmaceutical Sciences, Soochow University, Suzhou 215123, China

Received: 2016-04-15

Foundation Item: National Natural Science Foundation of China (No. 31470772)

^* Corresponding author. Tel:(0512)65882370,E-mail:jiangxiaogang@suda.edu.cn

Abstract: Edman degradation is the earliest technique used for the peptide N-terminal sequencing. Moreover, this method is still widely applied in multiple disciplines of the life science research community. With the development and application of robust proteomic techniques, the reaction of phenyl isothiocyanate (PITC) in this method developed by Edman has been used to modify the amines of peptides, and the identification of proteolytic cleavages of proteins occurring in cell signaling events, in a high throughput manner. However, there is no report about whether PITC can introduce modifications on the other amino acids, affecting the analysis and identification of proteins and peptide sequences. In order to explore the possibility of PITC modification on other amino acids, we used matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry (LC-MS/MS) to investigate the reaction products between PITC and a model peptide under two different PITC conditions in this work. Through MS and MS/MS analyses, we found that at a high PITC concentration, PITC could additionally generate a new modification on an amino acid, histidine. The discovery of this modification may help us to more accurately analyze protein and peptide sequences during the application of Edman degradation and proteomics analysis after the optimization of experimental conditions and improvement of analytical methods.

Key words: matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry (LC-MS/MS) Edman degradation phenyl isothiocyanate model peptide histidine

蛋白质的水解是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式。蛋白质水解过程可以改变蛋白质的定位^[1],激活蛋白质或使蛋白质失活,从而影响其下游信号通路^[2]。研究蛋白质水解功能的一个首要条件是要找到蛋白质的水解位点,从而可以通过定点突变和其他生物化学方法研究其功能。在高通量蛋白质组学方法发展之前,研究者们利用已有研究结果猜测可能的蛋白质水解位点,并通过定点突变和生物化学实验验证这些水解位点。近期由于蛋白质组学新方法的不断建立,利用化学修饰^[3-4]或酶催化反应^[5-8]等方法对蛋白质的氨基端^[3-5]或羧基端^[6-8]进行特异性修饰,并通过正向富集纯化获得蛋白质的端基多肽;也有通过多肽化学反应后反向纯化端基多肽的方法^[9-12]。这些方法的应用可以在蛋白质组水平上筛选获得蛋白质水解位点^[13-15],大大加快了对这些水解功能的后续研究。

迄今为止,Edman试剂——异硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate,PITC)修饰氨基酸仍是常用的氨基酸检测和定量分析方法^[16-18]。近年来,Edman降解原理也被应用于蛋白质水解位点的高通量筛选中^{[4, 19]}。在该方法中,利用Edman降解的第一步化学反应中的异硫氰酸苯酯对蛋白质N端的氨基和赖氨酸侧链上的氨基进行修饰,从而封闭所有的氨基,使得修饰后的蛋白质不再带有可以反应的氨基基团(见图 1)。N端经PITC修饰的氨基酸可以在强酸条件下发生裂解,并产生一个新的氨基端,这一新的、唯一的氨基可以与氨基反应试剂(如含有双硫键的N-羟基琥珀酰亚胺试剂)反应,并被特异性修饰。从而在被胰蛋白酶酶解成多肽后可以用链霉亲和素琼脂糖树脂分离氨基端多肽,并用LC-MS/MS方法鉴定相应的多肽,获得水解位点。该方法已被成功用于凋亡过程中蛋白质水解位点的鉴定^[4]。

图 1 PITC与多肽链上氨基的反应示意图 Fig. 1 Schematic representation of the chemical reaction between phenyl isothiocyanate (PITC) and the amino group on a peptide

在PITC与蛋白质的反应过程中,为了提高对N端氨基和赖氨酸侧链氨基修饰的完全程度,在反应中会使用较高浓度的PITC，同时会进行较长时间的反应。然而,目前还没有文献报道这一反应条件是否有可能在其他的氨基酸侧链上引入修饰,是否会影响多肽的后续鉴定工作。本文使用一个模型多肽进行该反应时发现,在PITC过量的条件下,其他氨基酸侧链也有可能会发生修饰。利用碰撞诱导解离串联质谱方法发现在该反应中这一修饰发生在组氨酸上。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UltrafleXtreme^TM基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)购自德国Bruker公司;Orbitrap Elite液相色谱-复合型电场轨道阱回旋共振质谱联用质谱仪(LC-MS/MS)、振荡仪、超纯水机均购自美国Thermo Fisher公司;SpeedVac离心浓缩仪购自美国Labconco公司;Acclaim PepMap100 C18柱(粒径5 μ m,孔径10 nm,5 mm×300 μ m)和Acclaim PepMap100 C18柱(粒径3 μ m,孔径10 nm,15 mm×75 μ m)均购自美国Thermo Fisher公司;Cleanup C18 Pipette Tips(10 μ L)购自美国Agilent公司。

模型肽(GHLSGAYTR)由上海吉尔生化有限公司合成;PITC(纯度为99.0% )购自美国Sigma-Aldrich公司;甲醇、吡啶、三乙胺、甲苯均为分析纯,购自中国国药集团化学试剂有限公司;乙腈为色谱级,购自德国Merck公司;三氟乙酸为色谱级,购自美国Tedia公司;甲酸(纯度为98% )、 α -氰-4-羟基肉桂酸二乙胺盐(CHCA,纯度＞99.0% )购自美国Fluka公司。

1.2 PITC化学修饰

1.2.1 溶液配制

模型肽粉末用纯水溶解,配成质量浓度为25 g/L 的溶液。按V(甲醇) ∶ V(水) ∶ V(三乙胺) ∶ V(吡啶)=7.5 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 0.5的比例配制500 μ L反应混合液,涡旋混匀。取1 μ L PITC,用三乙胺稀释80倍,配制成使用时的低浓度PITC。取一定量的MALDI基质CHCA粉末溶于含0.1%(体积分数,下同)三氟乙酸和50%乙腈的水溶液中,一直添加至淡黄色基质不再溶解,配成饱和溶液,现配现用。

1.2.2 PITC与多肽反应

2个Eppendorf(EP)管中均各加入200 μ L反应混合液和10 μ L模型肽溶液,再分别加入10 μ L PITC(与多肽的物质的量比约为400 ∶ 1,高浓度)和10 μ L稀释80倍的低浓度PITC(与多肽的物质的量比约为5 ∶ 1)。以800 r/min 的转速在50 ℃的振荡仪上振荡反应1 h,再分别加入10 μ L高浓度或低浓度PITC,相同条件下继续反应1 h。用1 mL甲苯萃取残留的PITC及其他有机试剂,以3 000 g的转速离心2 min,弃去上层有机相并重复萃取3次。在通风橱中用氮气轻轻吹除有机相,在SpeedVac离心浓缩仪中离心1～2 h,将样品浓缩至干。

1.3 质谱样品准备

浓缩至干的样品用0.1%的三氟乙酸溶解后,用Cleanup C18 Pipette Tips除盐纯化。先预平衡Cleanup C18 Pipette Tips,即用100%乙腈洗涤1次,用含0.1%三氟乙酸和50%乙腈的水溶液洗涤2次,再用0.1%甲酸水溶液洗涤2次。将Cleanup C18 Pipette Tips放置于样品溶液中,反复轻轻吹打使C18树脂与样品充分结合。再用0.1%甲酸水溶液反复洗涤Cleanup C18 Pipette Tips 4～6次,在20 μ L 50%的乙腈水溶液中反复轻轻吹打,以洗脱结合的多肽。最后在SpeedVac离心浓缩仪中离心除去溶剂。

1.4 MALDI-TOF-MS检测

将浓缩成粉末的多肽样品溶于4 μ L含0.1%三氟乙酸和50%乙腈的水溶液中,将样品与新鲜配制的CHCA饱和溶液按体积比为1 ∶ 1混合,取1～4 μ L混合液点涂在样品板上,待其自然结晶后,将样品板放置于MALDI-TOF-MS仪器中,样品在激光激发下产生多肽离子,在正电荷反射模式下采集数据并通过质量分析器及检测器分析,获得MALDI-TOF-MS图谱。

1.5 LC-MS/MS检测

用Orbitrap Elite质谱仪对多肽样品进行分析检测。将浓缩成粉末的多肽样品溶于20 μ L 0.1%甲酸水溶液中,取8 μ L溶液上载到富集柱(Acclaim PepMap100 C18柱,5 μ m,10 nm,5 mm×300 μ m)上,其中液相色谱溶剂A是0.1%甲酸水溶液,溶剂B是含80%乙腈和0.1%甲酸的水溶液。上样液为含2%乙腈和0.1%甲酸的水溶液。保留在分析柱(Acclaim PepMap100 C18柱,3 μ m,10 nm,15 mm×75 μ m)上的样品在下述条件下进行分离:0～10 min,6%B; 10～130 min,6%B～44%B; 130～140 min,98%B; 140～150 min,6%B。在正电荷模式下自动采集数据获得MS图谱,母离子扫描分辨率为 120 000,碰撞诱导解离方式下对强度最高的15个离子进行二级质谱分析,且对各选定的母离子在60 s内进行两次分析。通过对各种多肽碎片信息的自动采集,得到各个多肽的二级质谱图。

2 结果与讨论

2.1 低浓度PITC对多肽的修饰

传统的Edman降解的第一步需要使PITC与多肽N端的氨基基本反应完全。在多数情况下这一研究中的反应样品是没有三级结构的多肽,所以在较为温和的反应条件下就可以使反应相对较为完全。在第二步的三氟乙酸裂解后,可以利用液相色谱分析、鉴定N端氨基酸。一般Edman降解的总产率可以达到90%～98%^[20],但由于该反应的每一循环均存在一小部分没有反应的氨基酸,所以Edman降解一般只能鉴定出20个左右的氨基端序列。本文用一个氨基酸序列为GHLSGAYTR的模型肽进行了Edman降解反应。没有修饰的模型肽在MALDI-TOF-MS中的m/z为961.30,与理论计算值一致(见图 2a)。该多肽与低浓度(体积分数约0.1% )PITC以物质的量比为1 ∶ 10反应后,MALDI-TOF-MS检测证实产物较为均一,其修饰多肽的m/z为 1 096.52(见图 2b)。这一数据与多肽的氨基与PITC反应后的理论计算值一致。

图 2 模型肽(GHLSGAYTR)与低浓度PITC反应(a)前(b)后的MALDI-TOF-MS谱图 Fig. 2 Spectra of a model peptide (GHLSGAYTR) (a) before or (b) after the reaction with a low concentration of PITC by MALDI-TOF-MS

2.2 高浓度PITC对多肽的修饰

在从蛋白质组中分析端基多肽时,由于样品中蛋白质的丰度各不相同,为了防止高丰度蛋白质对低丰度蛋白质的影响,氨基端的反应越完全越好。另外,蛋白质的羧基端也有很多赖氨酸,其侧链的氨基也需要和PITC反应以封闭这些活性基团,使之不影响后续的标记反应。因此该试验中应尽量使PITC与氨基的反应趋于完全。为了达到这一目的,在反应体系中使用了体积分数约为8%的PITC(多肽和PITC的物质的量比约为1 ∶ 800)。反应后,纯化多肽产物,利用MALDI-TOF-MS检测,发现产物有多个丰度较高的峰(见图 3),从m/z计算相对分子质量后发现其中主峰(m/z 1 096.63)是只有1个PITC修饰的多肽(Ⅰ),另一个丰度稍低的峰(m/z 1 231.72)为含有2个PITC修饰的多肽(Ⅱ)。由于所用的多肽中除了N端的氨基外没有其他氨基,所以这一修饰可能是从其他氨基酸的侧链修饰后得到的。根据相对峰高估计多肽Ⅰ和多肽Ⅱ的含量比约为3 ∶ 1。

图 3 模型肽(GHLSGAYTR)与高浓度PITC反应产物的 MALDI-TOF-MS谱图 Fig. 3 Spectra of the products of the model peptide (GHLSGAYTR) reacted with a high concentration of PITC by MALDI-TOF-MS

2.3 模型肽与高浓度PITC反应产物的色谱分析

为了研究多肽Ⅱ中2个PITC分子修饰的可能位点,用LC-MS/MS对其进行了分析。总离子流色谱(total ion current chromatogram,TIC)图结果显示该样本由两组不同的峰组成(见图 4a)。这两组峰在色谱上的保留时间不同,可以很好地把相应的产物分离开来。该结果显示了这两个峰的疏水性不同,与图 3中的MALDI-TOF-MS结果和推测的修饰相符。由于在反应体系中只有PITC这个反应物有1个疏水性基团,这一结果预示着色谱中后出的峰可能是多肽上又额外加了1个PITC基团。

图 4 模型肽(GHLSGAYTR)与高浓度PITC反应产物的 LC-MS谱图 Fig. 4 Chromatograms of the products of the model peptide (GHLSGAYTR) reacted with the high concentration of PITC by LC-MS a. total ion chromatogram (TIC); b. extracted ion chromatogram (XIC,m/z=548.65-548.90,z=2) of the model peptide covalently modified with one PITC moiety; c. XIC (m/z=616.20-616.40,z=2) of the model peptide covalently modified with two PITC moieties.

检测LC-MS中这两个峰的m/z之后,发现这两个峰的m/z与模型肽上分别加1个和2个PITC的m/z相同。从总离子流色谱中分离出这两个多肽的二价分子离子峰(m/z=548.65～548.90和616.20～616.40,z=2)的提取离子色谱(extracted ion chromatogram,XIC)获得图 4b和4c所示的结果。这两个峰叠加后的形状与总离子流色谱图形状十分相似,也说明了这两个修饰的多肽是样品中最主要的两个组分。

2.4 模型肽与高浓度PITC反应产物的二级质谱分析

为了进一步分析含有2个PITC的多肽(Ⅱ)中哪个氨基酸侧链上可能发生了PITC的修饰,分别对这两个峰在碰撞诱导解离(collision induced dissociation,CID)的方式下进行了串联质谱分析(见图 5)。对多肽I的分析发现其氨基端被1个PITC修饰了,标注了各个碎片离子峰的二级质谱可以很好地与理论值对应。

图 5 模型肽(GHLSGAYTR)与高浓度PITC反应后获得的两个主要产物的二级质谱图 Fig. 5 Spectra of the two major products of the model peptide (GHLSGAYTR) reacted with the high concentration of PITC by MS/MS a. spectrum of the model peptide with one PITC moiety (Ⅰ) by MS/MS; b. spectrum of the model peptide with two PITC moieties (Ⅱ) by MS/MS. 1 ppm＝10^-6.

分析了第二个峰的二级质谱图后,发现当组氨酸上被1个PITC修饰后所产生的理论碎片离子峰与实验结果最相符。其中不含组氨酸的碎片离子的m/z值也表明这些氨基酸上确实不存在PITC的修饰。这一分析结果说明了在高浓度PITC条件下,PITC可以与组氨酸的侧链基团发生反应。

这一结果的发现为今后利用该方法来鉴定蛋白质端基或蛋白质的水解提出了新的需要考虑的因素。在具体研究中,根据这些因素优化实验步骤或检测方法可能对鉴定含组氨酸的多肽有帮助。最近Huang等^[21]报道了在不同高碘酸钠浓度下氨基酸侧链可以发生不同程度的氧化修饰,通过氨基酸丰度变化成功筛选到多个新的副反应位点,并利用氨基端保护的方法提高了对特定多肽的鉴定效率。本研究的后续实验也可以借鉴该文献中所提出的实验方法筛选PITC与蛋白质反应中新的副反应位点。

3 结论

通过MALDI-TOF-MS和LC-MS/MS分析,发现在Edman降解反应中,高浓度FITC可以与组氨酸的侧链反应,从而使含有该氨基酸多肽的修饰变得复杂。在利用Edman试剂进行蛋白质修饰时,考虑组氨酸的可变修饰也许会检测出更多的多肽。另一方面,也可以通过进一步优化反应条件,把组氨酸侧链的PITC修饰控制在一个很小的程度内。这一研究结果将有利于今后基于Edman试剂修饰蛋白质的高通量蛋白质组学方法对蛋白质氨基端或水解位点的鉴定。

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