水产品中的汞以无机汞和有机汞的形态存在。无机汞包括一价和二价化合物,有机汞包括甲基汞、二甲基汞、乙基汞、苯甲基汞等。无机汞在微生物的作用下转化为以甲基汞为主的有机汞类[1]。有机汞的毒性比无机汞强,甲基汞的毒性最强。日本水俣湾有机汞污染事件导致2 248人患水俣病,其中死亡1 004人,该事件引起了世界对甲基汞污染的广泛关注。各国对水产品中甲基汞的含量制定了严格的限量标准。水产品中含砷化合物主要有亚砷酸盐(As(Ⅲ))、砷酸盐(As(V))、甲基砷酸盐(MMA)、二甲基砷酸盐(DMA)、砷胆碱(AsC)、砷甜菜碱(AsB)、砷糖(AsS)与砷酯(AsL)等。其中As(Ⅲ)与As(V)的毒性最强,MMA与DMA的毒性较低,而AsC、AsB、AsS、AsL被认为毒性很低或无毒[2]。因此不能以砷的总量评价水产品的砷污染与毒害情况。国际上均以无机砷(As3+与As5+总量)的含量进行卫生学评价。现行的GB 2762-2012标准中不以水产品中总汞与总砷的含量来衡量，而是规定了甲基汞与无机砷的限量值。
甲基汞与无机砷主要通过联用技术实现测定,如将气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)等分离手段与原子荧光光谱(AFS)[3-6]、质谱(MS)[7-9]、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)[10-15]等检测手段联用。无机砷的测定还可采用离子色谱(IC)等相关联用技术[16, 17]。
目前单独分析甲基汞与无机砷的方法有很多,但未见同时测定甲基汞与无机砷方法的报道。本文采用盐酸超声提取样品中的甲基汞和无机砷,2,3-二巯基丙醇(BAL)与四苯硼钠先后在强酸与弱酸性水相中衍生无机砷和甲基汞,用甲苯萃取衍生物,经气相色谱-质谱(GC-MS)法进行定性和定量分析。本方法将无机砷与BAL、甲基汞与四苯硼钠的衍生条件与样品前处理过程相结合,采用分步水相衍生,无需调节pH值,操作简单;同时测定甲基汞与无机砷,既节约了样品量又减少了检测时间;GC-MS法成熟,仪器价格相对便宜,基层实验室普及率高,方法易推广使用。
GCMS-QP2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪(日本Shimadzu公司); A11粉碎机(德国IKA公司); DMT-2500多管漩涡混合仪(南京互川电子有限公司); 5430R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司); Milli-Q纯水机(美国Millipore公司)。
甲基汞标准溶液(以Hg计,下同,65.5μg/g)、二价汞标准溶液(1 000 mg/L)、乙基汞标准溶液(76.4 μg/g)、三价砷标准溶液(1 000 mg/L)、五价砷标准溶液(1 000 mg/L)、甲基砷标准溶液(以As计,下同,46.2 μg/g)、砷甜菜碱(38.8 μg/g)、砷胆碱(28.0 μg/g)和鱼肉中总汞与甲基汞成分分析标准物质(GBW10029)均购自中国计量科学研究院；二甲基砷酸钠(纯度98%,中国百灵威公司),用水配制成1 000 mg/L二甲基砷标准储备溶液(以As计)。
乙酸钠(NaOAc·3H2O)、乙酸、无水乙醇、正己烷、环己烷、氯仿、四氯化碳为分析纯(上海国药集团); BAL(纯度97%,中国百灵威公司),配制成10 g/L的BAL甲醇溶液;乙酸钠缓冲液(pH 3.6),称取1.6g NaOAc·3H2O于适量水中,加入26.8 mL 6 mol/L乙酸,用水稀释至100 mL;四苯硼钠(纯度99%,中国百灵威公司),称取0.1 g于少量水中溶解,加入5.0 mL乙酸钠缓冲液(pH 3.6),用水稀释至25 mL,配制成4 g/L的四苯硼钠水溶液;苯、甲苯均为农残级(上海安谱公司);异辛烷、甲醇、乙酸乙酯为HPLC级(德国Merck公司);盐酸为优级纯(上海国药集团);氯化钠为分析纯(上海国药集团),于700 ℃灼烧3 h后,置于干燥器中保存;实验用水,在线电阻率为18.2 MΩ·cm。
色谱柱:Rtx®-5SilMS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样室温度:250 ℃;升温程序:初始温度80 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升至250 ℃,保持15 min;载气:氦气;流速:1.0mL/min;进样体积:1.0 μL;不分流进样:1 min。
接口温度:250 ℃;离子源(EI)温度:200 ℃;电子能量:70 eV;溶剂延迟:3-3 min。全扫描模式m/z 100～300定性分析，选择离子监测(SIM)模式定量检测。甲基汞和无机砷的保留时间、定量离子和定性离子见表 1。
取样品可食部分打碎、研细,称取0.2～0.4 g干样或1.0～2.0 g湿样于15 mL具塞聚丙烯离心管中,加入5.0 mL 6.0 mol/L盐酸溶液,以2 000 r/min涡旋2 min后,超声30 min,于-10 ℃以7 500 r/min离心15 min,剔除液面微量的凝固脂肪,取上清液至30 mL离心管中,加入5.0 mL 6.0 mol/L的盐酸溶液,重复操作,合并上清液。上清液中加入150 μL BAL甲醇溶液,混匀,于35 ℃水浴衍生30 min后,分别加入0.5 g氯化钠、1.0 mL无水乙醇和2.00 mL甲苯,涡旋5 min,于20 ℃以7 500 r/min离心5 min,吸取1.0 mL上清液至15 mL离心管中,加入0.50 mL四苯硼钠溶液,涡旋10 min,于20 ℃以7 500 r/min离心5 min,取上清液,待测。
甲基汞在弱酸性条件下被四苯硼钠衍生成甲基苯基汞(见图 1a),甲基苯基汞在m/z 290～297有8个同位素峰,其中m/z 294质谱峰的相对丰度最高,为基峰(见图 1c);甲基苯基汞分子离子中的汞与甲基之间的键能较汞与苯环更低,易发生σ键断裂,生成苯基汞离子(见图 1b),对应同位素的最高峰为m/z 279(见图 1c)。本方法选择m/z 294为甲基汞的定量离子,m/z 292、279为定性离子。
无机砷的含量是As3+与As5+的总量。BAL可将As5+还原为As3+(见图 2a)[18],再衍生成As-BAL(见图 2b),As-BAL中As的含量即为无机砷的含量。分别添加1.00 μg As3+与As5+于2支含有10.0mL 6 moL/L盐酸溶液的离心管中,按1.3节方法进行衍生化。仪器分析结果表明,二者衍生物的保留时间、响应强度及质谱谱图完全一致,即二者具有相同的衍生产物As-BAL与衍生化效率,证实了方法测定的无机砷是As3+与As5+的总量。
As-BAL的质谱图见图 2d。As-BAL脱氢(H2)产生的基峰离子(m/z 212)或分别经α断裂[19]、脱水(H2O)、消除反应生成m/z 183、165、107特征离子,可能的裂解途径见图 2c。m/z 183特征离子是杂醇离子,易脱去一分子水,相对丰度较低;m/z 107特征离子在空白样品中的本底值较高。因此本方法选择m/z 212为无机砷的定量离子,m/z 214、165为定性离子。
甲基汞的衍生物甲基苯基汞与无机砷的衍生物As-BAL皆为弱极性化合物,热稳定性好,适合Rtx®-5SilMS(30m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱的分离。在优化的色谱条件下,7 min内可成功分离并测定甲基汞与无机砷,甲基汞与无机砷衍生物的选择离子色谱图见图 3。
生物样品中甲基汞的提取方法主要有碱消解[11]、酸浸提[8]与酶解后酸浸提[10]等,无机砷的提取方法主要有水[14]、水-甲醇[15]与酸液[6]等溶液直接浸提及酶解后酸浸提[20]等。酸浸提对甲基汞[4]与无机砷[2, 21]形态转换的影响均较小,高浓度的盐酸溶液有利于破坏甲基汞、无机砷(As3+与As5+)与水产品中含硫物质的配合从而提高提取效率。参考美国环保局(EPA)Method 1632A[21]和相关文献[8, 22],选择6.0mol/L盐酸作为浸提液。金枪鱼标准物质(GBW10029)按1.3节方法平行测定(n=3),甲基汞的平均值为0.819 mg/kg(以Hg计),在标准参考值(0.84±0.03) mg/kg(以Hg计)范围内。
盐酸提取液中含有少量中弱极性杂质,本方法首先利用离心室-10℃的低温凝固析出脂肪类弱极性物质,然后加入无水乙醇减少非脂成分进入甲苯层,以减少待测液中的杂质。
提取液中的甲基汞以氯化甲基汞的形式存在,具有水溶性,加入氯化钠至水相饱和,有助于提高萃取率。本方法向10 mL的6 mol/L的盐酸中添加略超饱和量的0.5g氯化钠。
甲基汞的极性相对较强,需衍生降低极性以改善色谱行为。降低甲基汞的极性通常采用葛氏试剂衍生法[7]与水相衍生法[3]。葛氏试剂衍生法需在非水环境下进行,操作繁琐,因此本文采用水相衍生法。常用的甲基汞水相衍生剂有四乙基硼钠[23]、四丙基硼钠[24]和四苯硼钠[3, 8]。四苯硼钠的价格便宜,化学性质稳定,保存期长,衍生产物相对分子质量大,质谱检测时可避免低相对分子质量杂质的干扰,具有更低的检出限和更高的选择性等优点。因此选择四苯硼钠作为甲基汞的衍生剂。
无机砷的衍生剂有巯基乙酸甲酯[25]、二巯基甲苯[26]与BAL[18, 27]等,方法均为水相衍生。巯基乙酸甲酯和二巯基甲苯皆不溶于水,与无机砷的衍生反应均在弱酸性条件下,衍生时需振荡或涡旋;BAL溶于水,与无机砷衍生反应的pH范围广(pH -1～7),且生成物As-BAL在甲基汞最佳衍生条件下(pH 3～4)稳定。因此选择BAL作为无机砷的衍生剂。
据文献[18]报道,无机砷可在强酸性条件下与BAL发生衍生化反应。本实验考察了不同浓度(0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mol/L)的盐酸溶液对As-BAL(1.00 μg As3+)响应强度的影响(见图 4a)。当盐酸的浓度逐渐升至2.0 moL/L时,As-BAL的响应强度也随之增高,当浓度为2.0 mol/L时，对As-BAL的响应强度最高。本方法选择盐酸的浓度为6 mol/L,与样品处理液的酸度相同,以简化操作。
甲基汞与四苯硼钠的衍生环境为弱酸性。考察不同pH的四苯硼钠溶液对甲基汞(以Hg计,1.00μg)衍生物响应强度的影响(见图 5a)。甲基汞衍生物的响应强度在pH 3.6时最高。本方法确定四苯硼钠衍生液的pH值为3.6。
分别向10.0mL 6 mol/L盐酸中加入30、50、70、100、150、200、300 μL BAL甲醇溶液(10 g/L),考察衍生剂用量对As-BAL响应强度的影响(见图 4b)。随着BAL甲醇溶液用量的增加,As-BAL的响应强度也随之升高。当用量为150 μL时,As-BAL的响应强度最高。本方法确定BAL甲醇溶液的用量为150 μL。
分别吸取0.50 mL质量浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10 g/L的四苯硼钠溶液(pH 3.6),考察四苯硼钠的质量浓度对甲基汞衍生物响应强度的影响(见图 5b)。随着四苯硼钠质量浓度的增加,甲基汞衍生物的响应强度也随之增高,当四苯硼钠溶液的浓度为4.0g/L时，甲基汞衍生物的响应强度最高。本方法确定四苯硼钠溶液(pH 3.6)的质量浓度为4.0 g/L。
本方法于35℃水浴中进行无机砷衍生试验,无机砷与BAL的衍生时间分别选为0、5、10、20、30、40、50、60 min，考察衍生时间对As-BAL响应强度的影响(见图 4c)。当衍生时间为30 min时，As-BAL的响应强度最高,因此本方法选择无机砷的衍生化时间为30 min。
四苯硼钠不溶于甲苯,衍生反应需在涡旋下进行。本实验考察了涡旋时间为1、3、5、10、15、20、30 min时,甲基汞衍生物的响应强度(见图 5c)。当涡旋时间为10 min时,甲基汞衍生物的响应强度较高,随着涡旋时间继续增加，甲基汞的响应强度出现波动。因此本方法将涡旋时间选为10 min。
本实验考察了不同萃取溶剂(苯、甲苯、正己烷、环己烷、异辛烷、三氯甲烷、四氯化碳)对萃取效率的影响。向水相(10.0 mL 6 mol/L盐酸、1.0 mL无水乙醇、0.5 g氯化钠)中分别加入1.00 μg甲基汞(以Hg计)和As3+,用2.00 mL甲苯按1.3节方法萃取,重复4次,合并萃取液。将得到的甲基汞与无机砷的总量计为100%,将2 mL 7种有机溶剂的一次性萃取液中甲基汞与无机砷的总量与之比较,计算萃取效率(见表 2)。结果表明,7种溶剂对无机砷均有较高的萃取效率;正己烷、环己烷、异辛烷与氯仿对甲基汞的萃取效率极低,苯、甲苯与四氯化碳对二者均有较高的萃取效率。综合比较操作条件与试剂毒性,最终选择甲苯作为萃取剂。
水产品在6.0mol/L盐酸的作用下,部分机体有机物会有不同程度的水解,加入无水乙醇可以避免某些非脂成分进入甲苯层,同时也可有效减轻或消除甲苯层的乳化现象。将贻贝干与鲜小黄鱼样品按1.3节方法处理,考察加入0、0.5、1.0、2.0、3.0 mL无水乙醇时甲苯层的乳化现象。结合总离子流色谱图的杂峰情况,本方法最终确定无水乙醇的添加量为1.0 mL。
分别对其他形态的汞与砷如二价汞、乙基汞、甲基砷酸、二甲基砷酸、砷甜菜碱与砷胆碱等做干扰试验。二价汞、乙基汞能与四苯硼钠反应,甲基砷酸、二甲基砷酸可被BAL衍生,砷甜菜碱与砷胆碱则不与BAL反应。证明其他形态的汞与砷在本方法条件下皆不干扰甲基汞与无机砷的衍生、分离与测定。
分别向10.0mL 6 mol/L盐酸溶液中添加适量标准溶液,配制质量浓度为0、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 μg/L的甲基汞与无机砷的混合标准使用液(以上机液浓度计),按1.3节方法配制校准工作曲线,以各目标物定量离子的色谱峰峰面积(Y)对质量浓度(X,μg/L)作线性回归。结果表明,甲基汞与无机砷在5～2 000 μg/L范围内,线性关系良好,回归方程分别为Y=1.68×105X-2.3×103和Y=3.20×106X+9.7×104,相关系数(r)分别为0.999 7和0.999 1;检出限均为3 μg/kg(以0.3 g干样计,S/N=3)与0.7 μg/kg(以1.5 g湿样计,S/N=3)。与现有标准方法[22, 28, 29]比较,本方法的检出限更低,可同时检测甲基汞与无机砷,检测用时更短,具有更广泛的适用性。
取市售干蛤、海带、小黄鱼3个样品,分别添加10、100、1 000μg/kg标准溶液,混匀静置2 h后,进行测试,考察方法回收率与精密度。每个水平测定6次,甲基汞与无机砷的回收率为80.0%～110.0%,相对标准偏差(n=6)为2.5%～9.4%(见表 3)。
采用本方法对市售鱼、虾、贝类及藻类样品中的甲基汞和无机砷进行了含量测定(见表 4)。结果表明,本方法适用于水产品中甲基汞和无机砷的检测。
本文根据无机砷与甲基汞在样品前处理方面的共性,采用6 mol/L盐酸作为提取液,超声波辅助提取。利用二者可分别在强酸与弱酸性条件下与BAL和四苯硼钠生成热稳定化合物的原理,采用分步水相衍生法,建立了同时测定水产品中甲基汞与无机砷的气相色谱-质谱联用分析方法。与常见的单独测定甲基汞和无机砷的方法相比,本方法操作简单、高效,检出限低,能很好地满足日常实际样品的检测。
2016,
Vol. 34 Issue (9): 918-924
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