非甾体抗炎剂(NSAIDs)是一类不含甾体结构的抗炎药,广泛应用于畜禽养殖产业,在治疗哺乳动物乳腺炎、关节炎及运动性损伤等方面有重要应用^[1]。但因其有一定毒性,过量服用或滥用可导致哺乳动物胃肠、肾脏和造血系统紊乱^{[2, 3]}。畜禽产品中的药物残留给人类健康带来潜在的威胁。因此许多国家和地区对于NSAIDs的使用都有严格的规定和限量要求。我国农业部235号公告^[4]规定乙酰水杨酸(aspirin,ASP)不得在产蛋鸡和产奶牛中使用,对乙酰氨基酚(acetaminophen,AMP)仅能在猪类产品中使用,安乃近在牛、猪、马肌肉组织中限量使用。此外,欧盟^[5]还对畜禽肉产品中卡洛芬、万达洛芬、氟尼辛、托芬那酸、美洛昔康(meloxicam,MXC)和双氯芬酸等多种NSAIDs的限量进行了明确规定。为了保障我国畜禽肉产品出口贸易,保障消费者身体健康,确保畜禽肉产品中NSAIDs残留量在安全食用范围内,建立一种简单、快速、可靠的检测方法对于监测NSAIDs的使用和残留水平十分必要。

由于NSAIDs在食品中浓度较低,多数以微量或痕量状态存在,同时NSAIDs在结构上带有苯环和酸性官能团,大多数是水溶性的,极性较强,富集和分离困难^[6]。目前动物源性食品中NSAIDs的检测方法已有报道,检验检疫行业标准^[7]中规定动物源产品中NSAIDs的检测采用乙腈提取、乙腈饱和正己烷除油,但该方法基质效应大,为了克服基质效应对检测结果的影响,采用基质配制标准曲线法进行校正。也有文献采用了固相萃取柱净化以消除基体杂质的干扰,Jedziniak等^[8]采用Sep-Pak Alumina N柱和C18柱结合对动物肌肉组织中的NSAIDs进行萃取,Hu等^[9]采用HLB柱对猪肉组织中的NSAIDs进行萃取。但这些净化方法除杂能力有限,基质效应仍然显著存在,需要采用基质匹配标准曲线的方法进行校正。但由于空白基质的样品不容易得到,采用基质匹配标准曲线法也有一定的缺陷。因而,针对动物源食品中极性NSAIDs药物残留的检测开发一种新型高效的前处理材料及方法是非常有意义的研究。

石墨烯是一种新型的碳纳米材料,具有二维的sp²杂化单层碳原子结构。由于具有共轭体系、大的比表面积以及极好的化学稳定性,石墨烯可与具有苯环结构的有机分子产生强的π-π堆积作用,这使其成为富集分离食品中极性NSAIDs药物的一种潜在的高效材料^[10-12]。有研究报道采用石墨烯富集了环境水样中的氯酚,发现石墨烯比C18、石墨化碳和碳纳米管等吸附剂吸附效率更高、重现性更好^[13]。但由于石墨烯质量超轻,在分散固相萃取中难以通过高速离心从样品溶液中完全分离。为了解决这个问题,基于石墨烯的磁性分散微固相萃取技术成为近年来发展起来的一种新型样品前处理技术。它将石墨烯的强吸附能力与便捷的磁性分离相结合,仅通过施加一个外部磁场即可实现相分离,具有操作简单、省时快速等优点^{[14, 15]}。有研究^[16]报道采用化学共沉淀法、水热法、溶剂热法制备了磁性石墨烯,并将其应用于环境水样中塑化剂^[17]、多环芳烃^[18]、杀菌剂^[19]、农药残留^[20]的磁性固相萃取中,都取得了较高的萃取效率。但目前磁性石墨烯在复杂的食品样品基体以及极性污染物分析中的应用还较少。另外与水热法和溶剂热法相比,共沉淀法制备工艺简单、成本低,该方法还可对磁性石墨烯成核和生长的情况实现较好的调控^[16]。

本研究采用化学共沉淀法制备了稳定的磁性石墨烯,并将磁性石墨烯分散微固相萃取-液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)结合,建立了畜禽肉产品中9种NSAIDs残留的测定方法,综合考察了不同的影响因素对磁性分散微固相萃取效率的影响。并从负载量、回收率、基质效应等方面对磁性石墨烯萃取材料与其他固相萃取柱进行了比较。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

超高压液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(Agilent 1290-6460,美国Agilent公司);扫描电镜(SEM,JSM-6480LV,日本电子公司);超声波清洗器(KQ2200E,昆山市超声仪器有限公司);循环水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ),予华仪器有限责任公司);真空干燥箱(DZF-6020,上海一恒科技有限公司)。Agilent ZORBAX RRHD SB-C18柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm,美国Agilent公司)。Sep-Pak Vac NH₂(6 mL,500 mg)和Oasis HLB(6 mL,500 mg)固相萃取柱(美国Waters公司)。

鳞片石墨(325目,粒径＜45 nm,中国Alfa化学有限公司);硫酸(质量分数为80%,上海苏懿化学试剂有限公司);盐酸(质量分数为36%)、氨水(质量分数为28%,中国国药集团上海化学试剂厂);水合肼(质量分数为80%,天津科密欧化学试剂有限公司);无水乙醇、甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯(色谱纯,美国TEDIA公司);硝酸钠、高锰酸钾、氢氧化钠、硫酸铁铵(NH₄Fe(SO₄)₂\512H₂O)、硫酸亚铁铵((NH₄)₂Fe(SO₄)₂\56H₂O)等其他试剂均为国产分析纯。实验用水均为超纯水(电阻率为18.2 MΩ\5cm)。

对乙酰氨基酚、安替比林(antipyrine,APR)、非那西丁(phenacetin,PNT)、吡罗昔康(piroxicam,PXC)、贝诺酯(benorilate,BNR)、美洛昔康、乙酰水杨酸、尼美舒利(nimesulide,NIM)、布洛芬(ibuprofen,IBF)标准品(纯度均不小于98%)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。畜禽肉类样品为实验室日常送检样品。

单标准溶液的配制:准确称取各标准品10 mg(精确至0.01 mg),分别置于100 mL的棕色容量瓶中,用乙腈溶解、定容,于-4 ℃避光保存。

混合标准溶液的配制:准确量取适量单标准溶液(PNT、BNR: 200 μL; AMP、APR、PXC、MXC、ASP、NIM: 600 μL; IBF: 6000 μL)至50 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,于-4 ℃避光保存。

1.2 磁性石墨烯的制备

氧化石墨采用改进的Hummers法^[21]制备,石墨烯采用Yang等^[22]的方法制备,磁性石墨烯(Fe₃O₄-G)通过化学共沉淀法在含石墨烯的碱性溶液中加入Fe²⁺和Fe³⁺制得^[23]。Fe²⁺和Fe³⁺的物质的量之比为1:2,保持整个实验装置为真空,并处于N₂氛围中。向三口烧瓶中加入0.60 g石墨烯、2.04 g (NH₄)₂Fe(SO₄)₂\56H₂O和3.01 g NH₄Fe(SO₄)₂\512H₂O,再加200 mL超纯水,混匀。将溶液超声15 min (100 W,40 Hz),在此过程中,逐滴加入12 mL 8.0 mol/L氨水,最终混合物的pH值为11～12。超声完成后,将混合物于50 ℃的油浴下机械搅拌60 min。在磁铁作用下,将沉淀物与上清液分离,沉淀物用大量去离子水洗涤至中性。产物再用无水乙醇洗涤3次后在真空下干燥,得到的黑褐色粉末即为Fe₃O₄-G。四氧化三铁纳米粒子采用Zhao等^[24]的方法制备,供研究萃取机理用。

1.3 色谱-质谱条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱:ZORBAX RRHD SB-C18柱;柱温:40 ℃;进样量:10 μL。流动相A为0.5 mmol/L醋酸铵水溶液,流动相B为乙腈;流速:0.4 mL/min。定容液为0.5 mmol/L醋酸铵水溶液-乙腈(95:5,v/v)。电喷雾离子源正离子模式(ESI⁺)下的洗脱梯度:0～3 min,5%B～30%B; 3～5 min,30%B～40%B; 5～7 min,40%B～50%B; 7～9 min,50%B～60%B; 9～12 min,60%B～5%B。电喷雾离子源负离子模式(ESI^-)下的洗脱梯度:0～3 min,40%B～50%B; 3～5 min,50%B～60%B; 5～8 min,60%B～40%B。

1.3.2 质谱条件

ESI源;毛细管电压:3.0 kV;鞘流气温度:350 ℃;鞘流气流速:12 L/min;干燥气温度:350 ℃;干燥气流速:6 L/min;采集方式为多反应监测(MRM)。有6个化合物使用ESI⁺模式,其余3个化合物使用ESI^-模式。离子化模式选择和提取离子选择均以灵敏度高、稳定性好为前提条件。为保证定量分析的稳定性,定量时应分别进行正、负模式的MRM扫描。表 1为优化的质谱参数。

表 1 (Table 1)

表 1 9种NSAIDs的质谱多反应监测参数 Table 1 MRM parameters for the 9 non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) NSAID Ionization mode Retention time/min Parent ion(m/z) Daughter ion (m/z) Fragmentor/V Collision energy/eV Cell accelerator voltage/V Acetaminophen ESI+ 2.31 152.1 110.0 78 13 4 (AMP) 65.1 33 Antipyrine ESI+ 3.16 189.1 77.1 78 45 4 (APR) 56.1 41 Phenacetin ESI+ 3.92 180.1 138.1 82 12 7 (PNT) 110.1 20 Piroxicam ESI+ 5.31 332.1 121.0 72 20 7 (PXC) 95.0 16 Benorilate ESI+ 5.63 314.1 272.0 26 5 4 (BNR) 152.1 17 Meloxicam ESI+ 6.75 352.1 141.0 45 17 4 (MXC) 115.0 17 Aspirin ESI- 1.05 137.0 93.0 42 16 4 (ASP) 65.0 18 Nimesulide ESI- 3.52 307.1 229.1 52 5 4 (NIM) 122.0 33 Ibuprofen (IBF) ESI- 4.59 205.0 161.1 20 5 4

表 1 9种NSAIDs的质谱多反应监测参数 Table 1 MRM parameters for the 9 non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs)

1.4 样品前处理步骤

准确称取2.00 g肉类组织,加入2.0 g无水硫酸钠和10 mL乙腈-磷酸(200:1,v/v)溶液,以12000 r/min的转速匀浆2 min。于-4 ℃以8000 r/min的转速冷冻离心15 min,取上清液于蒸发瓶中。残渣用10 mL乙腈-磷酸(200:1,v/v)溶液重复提取一次,涡旋1 min,于-4 ℃以8000 r/min的转速冷冻离心15 min,取上清液,合并两次上清液,在45 ℃下于旋转蒸发仪上蒸干。加入2 mL定容液,超声溶解,再加1 mL定容液,涡旋1 min充分溶解,然后加3 mL乙腈饱和的正己烷,涡旋30 s,转移至10 mL离心管中,以4000 r/min的转速离心5 min,除去油脂杂质,将下清液转移到盛有5 mg Fe₃O₄-G的试管中,将其放在振荡器上振荡30 min,在瓶底放一块磁铁聚集分离Fe₃O₄-G,弃去上清液,加入1.0 mL丙酮-乙酸乙酯(1:1,v/v),涡旋1 min,磁性分离后将上清液转移到新的玻璃试管中。洗脱操作重复3次,合并收集所有洗脱液于玻璃试管中并用氮气吹干,随后用1 mL定容液溶解,供LC-MS/MS分析。

2 结果与讨论

2.1 石墨烯和磁性石墨烯的表征

为了对比石墨烯磁化前后的形貌,采用SEM对石墨烯(图 1a)以及Fe₃O₄-G(图 1b)的表面形态进行了表征。从图 1a可以看出,石墨烯具有均匀多孔、褶皱的丝绸状片层结构,这有效地增大了其表面积,为NSAIDs提供了大量的可吸附位点。从图 1b可以看出,Fe₃O₄颗粒均匀地覆盖在石墨烯表面,这使得石墨烯具有了超磁性,Fe₃O₄的粒子直径约为10～70 nm,一些纳米粒子稍微有些聚合。对比两图可以发现,石墨烯的基本结构并没有发生变化,仍以多孔褶皱状存在,因此可以大量负载NSAIDs分子。

图 1

Fig. 1

图 1 (a)石墨烯和(b)磁性石墨烯的扫描电镜图 Fig. 1 Scanning electron microscope (SEM) images of (a) graphene and (b) magnetic graphene (Fe3O4-G)

在室温下对Fe₃O₄-G的磁学性能进行了表征。图 2中Fe₃O₄-G的磁滞回曲线表明Fe₃O₄-G微粒具有大的饱和磁化强度(53.1 emu/g)和超顺磁性,这一特征使其成为一种高效的磁性吸附剂。与外部磁场接触后,Fe₃O₄-G颗粒可完全并快速地从样品溶液中分离出来。

图 2

Fig. 2

图 2 磁性石墨烯的磁滞回曲线 Fig. 2 Magnetization curve of Fe3O4-G

2.2 萃取机理的探讨

Fe₃O₄-G对NSAIDs的萃取过程存在若干种作用力。首先,NSAIDs是一类具有苯环的芳酸类药物,可与Fe₃O₄-G中的石墨烯形成π-π共轭体系,NSAIDs结构中有供电子能力的N、S、O等也可与Fe₃O₄-G结构中的大π键形成共用电子对,从而促进NSAIDs的吸附。此外Fe₃O₄-G分子还有未被还原的-COOH基团,也可以与电负性强的原子形成氢键作用力。另外根据Afkhami等^[25]的研究,Fe₃O₄-G中Fe₃O₄的存在可使Fe₃O₄-G的表面带有羟基,与NSAIDs分子中的极性基团如-COOH或-OH形成分子间氢键作用力。为了进一步考察Fe₃O₄-G中Fe₃O₄和石墨烯对NSAIDs富集的贡献,本试验比较了Fe₃O₄纳米离子与Fe₃O₄-G分别对9种NSAIDs(质量浓度:0.1～3 μg/L)的萃取回收率(见图 3)。Fe₃O₄纳米离子与Fe₃O₄-G对9种NSAIDs的萃取回收率分别为1.4%～13.5%和83.3%～100.7%,说明Fe₃O₄纳米离子对NSAIDs有一定的吸附作用,但吸附作用很微弱,因此石墨烯与NSAIDs之间的吸附作用仍然是萃取过程中的主要作用力。

图 3

Fig. 3

图 3 Fe3O4纳米离子与Fe3O4-G对9种NSAIDs回收率的影响 Fig. 3 Effect of Fe3O4 nanoparticles and Fe3O4-G on the recoveries of the nine NSAIDs

2.3 提取过程的优化

目前报道的NSAIDs残留分析中,多数选用乙腈和乙酸乙酯作为提取溶剂,也有文献^{[8, 26-28]}提出利用化学水解法促进提取,从而将NSAIDs与动物组织中的蛋白质分离以达到萃取的目的。本研究首先考察了乙腈和乙酸乙酯的提取效果,发现乙腈对9种NSAIDs的提取效率优于乙酸乙酯。进一步考察了水解作用对9种NSAIDs提取效率的影响。选取的萃取试剂包括盐酸溶液(0.5 mol/L)、氢氧化铵溶液(质量分数为10%)和乙腈-磷酸(200:1,v/v)溶液。样品在37 ℃恒温水槽中水解3 h后用乙腈提取。提取结果表明:在碱性水解条件下,由于皂化反应的影响,NSAIDs的提取效率不高;在酸性水解条件下,NSAIDs的提取效率较高,这可能是由于水解作用的影响^[9]。酸化乙腈对少数NSAIDs的提取效率虽然不如酸性水解时高,但对9种NSAIDs依然具有较高的提取效率,因此选取乙腈-磷酸(200:1,v/v)溶液作为提取试剂。

2.4 磁性分散微固相萃取过程的优化

为了达到最佳萃取效果,提高Fe₃O₄-G的萃取效率,对萃取时间、样品溶液的pH值及洗脱溶剂的种类及用量等条件进行了优化,每个试验条件平行测定3次。取100 mL稀释400倍的混合标准溶液用于检测。

2.4.1 萃取时间的影响

考察了Fe₃O₄-G对9种NSAIDs在5、15、30、60、120和180 min时吸附动力学的变化过程,并计算其萃取效率(见图 4a)。在5～30 min,NSAIDs的萃取效率随着萃取时间的增加逐渐增加,30 min时萃取效率达到84%～95%后几乎不再变化,Fe₃O₄-G基本达到萃取平衡,所以萃取时间定为30 min。

2.4.2 pH值的影响

溶液的pH值可影响NSAIDs和Fe₃O₄-G的表面电荷及密度,进而影响其萃取效率。本试验在pH 2.0～12.0的范围内考察了样品溶液的pH值对萃取效率的影响(见图 4b)。其中AMP的萃取效率随溶液pH值升高缓慢增大,这是由于在酸性条件下,Fe₃O₄-G分子中未被水合肼还原的-COOH与AMP中的-OH以及-NH可以形成氢键作用力;但随着溶液从酸性变为碱性,-COOH失去氢质子变成-COO^-,氢键作用力减弱,与AMP分子中的-NH之间形成了静电作用力,增强了AMP在Fe₃O₄-G表面的吸附。因此,AMP在碱性条件下具有高的萃取效率。

图 4

Fig. 4

图 4 (a)萃取时间、(b)溶液pH值和(c)洗脱剂种类对9种NSAIDs萃取效率的影响 Fig. 4 Effect of (a) the extraction time,(b) pH value of the solvent and (c) the nature of elution solvent on the extraction efficiencies of the 9 NSAIDs

APR、PNT、BNR、ASP、NIM和IBF 6种NSAIDs在酸性溶液中萃取效率较高。其中ASP和IBF分子结构中含有-COOH。在酸性环境中,ASP和IBF上的-COOH与Fe₃O₄-G表面的-COOH形成氢键。当溶液逐渐变为碱性时,Fe₃O₄-G、ASP和IBF上的-COOH失去H质子成为-COO^-,分子间氢键被破坏。吸附在Fe₃O₄-G表面的ASP和IBF分子被释放,使吸附效率降低。因此,酸性环境下更有利于Fe₃O₄-G对ASP和IBF的吸附。另外两种化合物PXC和MXC随溶液pH值改变萃取效率变化不大。

从前面的数据可以看出:pH从2.0变化到12.0时,9种NSAIDs的萃取效率约为70%～95%,虽然pH值的变化对NSAIDs化合物与Fe₃O₄-G表面的氢键作用力产生影响,但萃取效率的变化并不是很显著,这也说明NSAIDs和Fe₃O₄-G表面的作用力以π-π堆积作用为主。综合考虑pH对9种NSAIDs萃取效率的影响,选择样品溶液pH值为4.0。

2.4.3 洗脱条件的选择

为了将NSAIDs尽量完全地从Fe₃O₄-G萃取剂上洗脱下来,本试验考察了甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯和丙酮-乙酸乙酯(1:1,v/v)5种有机溶剂的洗脱效果(见图 4c)。丙酮和乙酸乙酯对大多数NSAIDs的萃取效率相对较高,但丙酮无法实现对IBF和ASP的高效洗脱,乙酸乙酯无法实现对APR、PNT和MXC的高效洗脱；而丙酮-乙酸乙酯(1:1,v/v)混合溶剂对9种NSAIDs均能实现较完全的洗脱,其洗脱效果明显好于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯单独进行洗脱的效果。由于9种NSAIDs的极性有差异,选用混合溶剂进行洗脱时比采用单一溶剂能获得更满意的回收率。因此本试验选取丙酮-乙酸乙酯(1:1,v/v)作为洗脱剂。

另外还考察了洗脱剂的用量对NSAIDs洗脱效果的影响。采用少量多次的原则,分3次洗脱,每次洗脱溶剂的用量分别为1、2和3 mL,结果发现在上述洗脱方法下洗脱体积对洗脱效果影响不大,因此采用丙酮-乙酸乙酯(1:1,v/v)洗脱3次,每次用量为1 mL。

2.5 Fe₃O₄-G分散微固相萃取与其他固相萃取柱的比较

2.5.1 净化能力的比较

比较了Fe₃O₄-G分散微固相萃取与Sep-Pak Vac NH₂和Oasis HLB固相萃取柱对猪肉、鸡肉和牛肉样品净化能力的差异,并通过计算其基质效应(matrix effect,ME)进行评价。ME是指样品中除了目标分析物以外的其他成分对待测物测定值的影响,也就是指基质对分析方法准确性的干扰^[29]。基质效应通过计算空白提取液待测物的峰面积与标准纯样液中待测物峰面积之比来获得^[30]。其数值越接近1,说明基质效应越弱,净化效果越好。ME＞100%表明是基质增强效应,ME＜100%表明是基质抑制效应。

3种固相萃取方法所获得的基质效应比较结果如表 2所示,添加水平为10倍LOD。采用Sep-Pak Vac NH₂柱净化后获得的ME为38.71%～76.54%,对9种NSAIDs表现出较强的基质抑制效应。Sep-Pak Vac NH₂这类硅胶基质的吸附剂对极性污染物的富集效果不够理想,无法实现对NSAIDs的有效分离。采用Oasis HLB柱净化后获得的ME为16.72%～106.8%,Oasis HLB柱对PXC表现出基质增强效应,对其余NSAIDs表现出很强的基质抑制效应。经Fe₃O₄-G萃取后,NSAIDs的ME为89.72%～109.0%,对PXC化合物的基质效应与Oasis HLB柱相差不大,但对其他化合物的基质效应明显优于前两种色谱柱。从总体来看Fe₃O₄-G对3种畜禽肉样品的净化效果最好,有效地降低了基质效应。因此,Fe₃O₄-G分散微固相萃取可作为有效的前处理方法来富集分离NSAIDs药物残留。

表 2 (Table 2)

表 2 猪肉、鸡肉和牛肉样品中不同固相萃取材料对9种NSAIDs的基质效应(n=3) Table 2 Matrix effects (MEs) of the nine NSAIDs obtained from different SPE columns in pork,chicken and beef samples (n=3) NSAID Pork/% Chicken/% Beef/% Fe3O4-G Oasis HLB Sep-Pak Vac NH2 Fe3O4-G Oasis HLB Sep-Pak Vac NH2 Fe3O4-G Oasis HLB Sep-Pak Vac NH2 AMP 99.41 16.72 47.91 101.5 21.28 75.95 101.7 18.71 52.61 APR 98.81 36.72 49.39 100.2 38.59 73.30 90.14 41.50 52.89 PNT 97.71 57.21 48.54 97.33 40.80 70.16 90.24 93.68 57.18 PXC 96.99 100.0 45.80 95.10 106.8 76.08 97.79 106.3 53.12 BNR 89.76 89.97 44.44 92.64 87.65 66.09 89.72 47.38 55.02 MXC 94.05 59.02 44.64 100.5 63.74 67.04 97.02 61.53 54.60 ASP 109.0 27.74 54.74 97.50 32.31 75.07 108.1 31.14 57.03 NIM 104.5 80.28 51.95 103.5 56.52 76.18 105.4 87.25 62.23 IBF 102.5 48.72 38.71 100.5 56.57 76.54 104.7 52.16 46.56

表 2 猪肉、鸡肉和牛肉样品中不同固相萃取材料对9种NSAIDs的基质效应(n=3) Table 2 Matrix effects (MEs) of the nine NSAIDs obtained from different SPE columns in pork,chicken and beef samples (n=3)

2.5.2 实际样品处理效果的比较

为了比较Fe₃O₄-G与Sep-Pak Vac NH₂和Oasis HLB固相萃取柱处理实际样品的能力,选取一份含有AMP残留的阳性猪肉样品,在优化的试验条件下,分别使用3种固相萃取材料进行提取净化,测得的AMP残留分别为1.6、0.6和0.1 μg/kg,色谱图见图 5。可见Fe₃O₄-G萃取材料提取AMP的色谱峰明显,且干扰峰较少,说明Fe₃O₄-G萃取材料的富集能力强,Fe₃O₄-G萃取材料提取净化猪肉样品中NSAIDs的效果优于Sep-Pak Vac NH₂和Oasis HLB固相萃取柱。

图 5

Fig. 5

图 5 (a)Fe3O4-G、(b)Sep-Pak Vac NH2和(c)Oasis HLB分别净化处理含有AMP的阳性猪肉样品的色谱图 Fig. 5 Chromatograms of (a) Fe3O4-G,(b) Sep-Pak Vac NH2 and (c) Oasis HLB in the purification of AMP positive pork sample

2.5.3 方法性能评价

为了评估本研究中Fe₃O₄-G萃取方法对NSAIDs的富集能力,比较了已报道的几种NSAIDs检测中萃取方法的性能差异^{[2, 8, 9, 31-34]},包括富集材料用量、NSAIDs种类、研究基体、基质效应、回收率及分析性能,结果见表 3。与文献方法相比,本方法中萃取材料Fe₃O₄-G用量少,基质效应低,回收率较高。这可能是由于NSAIDs是强极性芳酸类污染物,传统的固相萃取柱对NSAIDs的负载能力有限。而Fe₃O₄-G独特的共轭体系和大的比表面积使其对具有苯环结构的NSAIDs产生强的π-π堆积作用和吸附作用力,克服了极性NSAIDs化合物难以富集分离的问题。

表 3 (Table 3)

表 3 Fe3O4-G与其他固相萃取方法富集NSAIDs性能的比较 Table 3 Comparation of Fe3O4-G and the other SPE methods for the enrichment of NSAIDs Extraction material Material amount/mg Types of NSAIDs Matrix Matrix effect/% Recovery/% Performance Fe3O4-G 5 9 pork,chicken and beef 89.7-109.0 83.3-104.5 high recovery and good purifying muscle effect C18[31] 1000 14 animal serum and plasma - 47.8-100.9 lower recovery for salicylic acid Sep-Pak Alumina 1710+500 10 swine,horse and -75.0-10.0 54.0-135.0 complicated purification N+C18[8] chicken muscle process Florisil[2] 2000 4 mutton muscle - 65.3-99.6 narrow applicability Oasis HLB[9] 150 30 swine muscle 12.2-129.4 61.7-125.7 significant matrix effects Sep-Pak Silica[32] 1000 18 swine liver - 53.8-92.7 low recovery Oasis HLB[33] 60 4 river water and - 81.0-102.0 narrow applicability wastewater Oasis MAX[34] 30 5 human serum - 93.3-102.5 only for oxicam NSAIDs  “-” indicates that the cited reference did not discuss the matrix effect.

表 3 Fe3O4-G与其他固相萃取方法富集NSAIDs性能的比较 Table 3 Comparation of Fe3O4-G and the other SPE methods for the enrichment of NSAIDs

2.6 Fe₃O₄-G的重复利用

对Fe₃O₄-G萃取材料的使用寿命进行了研究。将使用后的Fe₃O₄-G用乙腈-丙酮(1:1,v/v)清洗3次,然后用去离子水清洗两次,于真空干燥箱中烘干后再次重复如上实验,结果发现反复使用10次后对9种NSAIDs依然具有较高的萃取效率。

2.7 线性关系、定量限、回收率和精密度

以目标物定量离子峰面积(Y)为纵坐标、以质量浓度(X,μg/L)为横坐标绘制标准曲线,实验结果见表 4。9种NSAIDs的线性相关系数在0.9980～0.9992之间。以S/N=3计算LOD,9种NSAIDs的LODs为0.2～8.2 μg/kg。以S/N=10计算LOQ,9种NSAIDs的LOQs为0.5～25.4 μg/kg。

表 4 (Table 4)

表 4 9种NSAIDs的平均回收率、相对标准偏差、相关系数、回归方程、检出限和定量限(n=6) Table 4 Mean recoveries,relative standard deviations,correlation coefficients,regression equations,LODs and LOQs of the nine NSAIDs (n=6) NSAID Added/(μg/kg) Mean recovery/% RSD/% Correlation coefficient Regression equation LOD/(μg/kg) LOQ/(μg/kg) AMP 2.5 94.7 1.2 0.9989 Y=2014X+7257 0.8 2.5 5.0 100.6 4.0 25.0 93.8 3.6 APR 0.5 86.0 6.2 0.9989 Y=558X+1273 0.2 0.5 1.0 87.7 5.1 5.0 90.3 3.3 PNT 0.9 90.7 1.3 0.9989 Y=1272X+3003 0.3 0.9 1.8 92.3 1.7 9.0 89.2 3.4 PXC 2.8 90.7 6.4 0.9980 Y=566X+3018 0.9 2.8 5.6 91.3 3.2 28.0 95.7 1.5 BNR 0.8 84.7 5.9 0.9992 Y=193X+1206 0.3 0.8 1.6 88.3 2.9 8.0 88.7 4.3 MXC 2.9 91.3 3.3 0.9983 Y=493X+2491 0.9 2.9 5.8 100.3 4.0 29.0 104.5 5.5 ASP 3.7 102.6 6.8 0.9982 Y=943X+1615 1.2 3.7 7.4 97.3 3.6 37.0 101.3 3.3 NIM 3.1 89.3 3.4 0.9990 Y=642X+10026 1.0 3.1 6.2 90.7 1.7 31.0 94.2 2.2 IBF 25.4 83.7 3.0 0.9990 Y=263X+1006 8.2 25.4 50.8 83.3 2.8 254.0 86.2 4.0  Y: the peak area of quantification ion; X: the mass concentration of the analyte (μg/L).

表 4 9种NSAIDs的平均回收率、相对标准偏差、相关系数、回归方程、检出限和定量限(n=6) Table 4 Mean recoveries,relative standard deviations,correlation coefficients,regression equations,LODs and LOQs of the nine NSAIDs (n=6)

在LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ添加水平下各进行6次试验,9种NSAIDs的平均回收率为83.3%～104.5%,相对标准偏差(RSDs)为1.2%～6.8%。图 6为空白猪肉样品中添加10倍LOQ的9种NSAIDs化合物的提取离子流色谱图。可见磁性分散微固相萃取结合LC-MS/MS测定NSAIDs具有良好的灵敏度和重现性。满足国家标准^[35]中动物源产品药物残留检测的相关要求。

图 6

Fig. 6

图 6 猪肉空白样品中添加水平为10倍LOQ的9种NSAIDs的提取离子流色谱图 Fig. 6 Extracted ion current chromatograms of the nine NSAIDs in blank pork sample spiked at the 10LOQ level

2.8 实际样品的检测

应用本文所建立的方法对日常送检的50份猪肉、鸡肉和牛肉样品中的9种NSAIDs进行了检测,结果表明,在1份猪肉样品中检测到AMP残留,其含量小于定量限。其他样品中均未检测到NSAIDs残留。

3 结论

基于自制的Fe₃O₄-G纳米复合材料的磁性分散微固相萃取技术,建立了结合LC-MS/MS用于畜禽肉产品中9种NSAIDs药物残留检测的方法。结果表明,作为磁性固相萃取吸附剂,Fe₃O₄-G对9种NSAIDs表现出良好的富集能力和负载量,可重复利用,对畜禽肉产品的净化除杂能力优于Sep-Pak Vac NH₂和Oasis HLB固相萃取柱。本方法灵敏度高,可获得满意的回收率、精密度和重复性,符合多残留检测的要求,可为畜禽肉中NSAIDs残留量的测定提供一种新的技术支持。

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