非法添加成分是指在农药制剂中人为添加标称有效成分以外的农药成分。近年来,我国加强了对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的管理,对甲胺磷等高毒农药全面禁止生产和使用,对克百威等农药限制在蔬菜、水果等作物上使用[1, 2]。而有些不法商家为了增加防治效果、降低登记和生产成本、牟取暴利,在产品中非法添加高毒、禁限用的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂[3, 4]。使用含有非法添加杀虫剂的农药制剂可能造成农药残留超标,影响农产品质量安全,导致作物发生药害,给农民造成经济损失,对生态环境造成污染。近年来,农药制剂中非法添加成分已引起各级农业主管部门的高度重视,成为监管的重要对象。
我国有超过1100种农药应用于农业生产[5],农药制剂中已有的检测方法主要针对某一种或多种有效成分的含量检测,主要有气相色谱(GC)法[6]、液相色谱(LC)法[7]、光谱法[8, 9]等。非法添加成分具有很强的隐蔽性和随机性,常规的GC法和LC法无法应用于非法添加成分的检测。目前,文献报道的农药非法添加成分的检测方法有气相色谱-质谱(GC-MS)法[10]、高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法[11]。GC-MS法不适用于难气化或者高温下容易分解的农药,HPLC-MS/MS法虽然灵敏度高,选择性和特异性好,然而不能对化合物进行精确相对分子质量(Mr)的测定,不能建立标准的质谱数据库,在定性检测方面尚有一定的欠缺[12]。超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF MS)依据所测得化合物的精确相对分子质量,可以对化合物进行精确定性,从而避免误检和漏检[13],并且可以建立标准的质谱数据库,能够对未知样品进行快速、准确的筛查。目前,UPLC-Q-TOF MS广泛应用于中成药和保健品[14]、食品添加剂[15]、兽药[16-18]和水产品[19, 20]等多个领域非法添加成分的筛查。作者尚未见到有应用UPLC-Q-TOF MS方法筛查农药制剂中非法添加有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的文献报道。本研究建立了可湿性粉剂(wettable powder,WP)、乳油(emulsifiable concentrate,EC)、悬浮剂(suspension concentrate,SC)3种农药制剂中48种有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的快速筛查方法,为打击在农药制剂中非法添加杀虫剂提供了有力的技术支持。
Agilent 1290超高效液相色谱仪/6530四极杆-飞行时间质谱仪,MassHunter工作站及定性分析软件,MassHunter Workstation Personal Compound Database and Library(PCDL)个人谱图数据库软件(美国Agilent公司); Zorbax C18柱(100 mm×1.8 mm,2.1 μm,美国Agilent公司);超纯水机(美国Millipore公司)。
克百威(carbofuran)、丁硫克百威(carbosulfan)、硫双威(thiodicarb)、杀线威(oxamyl)、特丁硫磷(terbufos)、二嗪磷(diazinon)、灭线磷(ethoprophos)、甲拌磷(phorate)、硫线磷(cadusafos)、马拉硫磷(malathion)、喹硫磷(quinalphos)、双硫磷(temephos)、稻丰散(phenthoate)等13种标准品购自上海市农药研究所;甲萘威(carbaryl)、甲胺磷(methamidophos)、灭多威(methomyl)、速灭威(metolcarb)、乙酰甲胺磷(acephate)、涕灭威(aldicarb)、异丙威(isoprocarb)、仲丁威(fenobucarb)、残杀威(propoxur)、氧乐果(omethoate)、敌敌畏(dichlorvos)、久效磷(monocrotophos)、甲基硫环磷(phosfolan-methyl)、乐果(dimethoate)、杀螟丹(cartap)、抗蚜威(pirimicarb)、地虫硫磷(fonofos)、敌百虫(trichlorfon)、水胺硫磷(isocarbophos)、乙嘧硫磷(etrimfos)、辛硫磷(phoxim)、杀扑磷(methidathion)、苯线磷(fenamiphos)、甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)、敌瘟磷(edifenphos)、氯唑磷(isazofos)、三唑磷(triazophos)、治螟磷(sulfotep)、甲基吡啶磷(azamethiphos)、甲基异柳磷(isofenphos-methyl)、毒死蜱(chlorpyrifos)、毒虫畏(chlorfenvinphos)、蝇毒磷(coumaphos)、伏杀硫磷(phosalone)、丙溴磷(profenofos)等35种标准品购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。甲醇、乙腈为LC-MS纯试剂,甲酸为色谱纯试剂,实验用水为超纯水。
48种杀虫剂单标准溶液的配制:称取农药标准品10 mg(精确至0.1 mg),置于25 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容。
实验样品从市场随机抽取。
色谱柱为Zorbax C18柱;色谱柱温度为35 ℃;进样量为1 μL。流动相:A相为0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相为乙腈;流动相流速为0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0～3.0 min,10%B～40%B; 3.0～7.0 min,40%B～90%B; 7.0～12.0 min,90%B; 12.0～12.5 min,90%B～10%B。
离子源:电喷雾离子(ESI)源,正离子模式;扫描范围:一级质谱m/z 150～500,二级质谱m/z 50～500;雾化气:氮气;雾化气流量:11 L/min;喷雾气压力:3.4×105 Pa;干燥气温度300 ℃;毛细管电压:3500 V;碎裂电压140 V;二级质谱碰撞能量分别为:5、10、20和40 V。UPLC-Q-TOF MS配置了双喷雾器电喷雾源,采集数据时可以连续导入参比溶液,对仪器质量轴进行实时校正,参比离子为m/z 121.0509和m/z 922.0098。
采用Agilent公司的PCDL软件建立了48种有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂的一级质谱数据库。取标准溶液稀释至2 mg/L,按照1.2和1.3节的液相色谱和质谱条件进样。采集一级质谱数据(TOF-MS模式),得到目标化合物的保留时间、精确质量数等信息,通过在PCDL软件中输入每种农药的中英文名称、分子式、精确相对分子质量和保留时间,建立了48种杀虫剂的一级精确质量数据库。
一级质谱数据库建立完成后,对48种杀虫剂再次进样测定,采集二级质谱图,通过PCDL软件建立48种农药的二级质谱库,二级质谱库中包含母离子、保留时间、不同碰撞能量(5、10、20和40 V)下的二级质谱图等信息。
我国登记和使用较多的农药制剂有可湿性粉剂、乳油、悬浮剂3种剂型,本实验对不同剂型的样品分别进行处理。
准确称取0.25 g样品置于25 mL容量瓶中,加入15 mL甲醇,超声溶解10 min,冷却至室温。用甲醇定容至25 mL,然后转移到50 mL离心管中,以3500 r/min的速度离心5 min,吸取1 mL上清液至10 mL容量瓶中,加入4 mL乙腈,用水定容至10 mL,过0.22 μm滤膜后进样测定。
准确称取0.25 g乳油样品,置于25 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,吸取1 mL溶液至10 mL容量瓶中,加入4 mL乙腈,用水定容至10 mL,过0.22 μm滤膜后进样测定。
准确称取0.25 g悬浮剂样品,置于25 mL容量瓶中,加入5 mL水,振摇,使样品均匀分散在水中。然后加入15 mL甲醇,超声溶解10 min,冷却至室温。用甲醇定容至25 mL,吸取1 mL溶液至10 mL容量瓶中,加入4 mL乙腈,用水定容至10 mL,过0.22 μm滤膜后进样测定。
农药制剂在加工的过程中,会根据剂型的不同加入不同的助剂。所以,根据剂型的不同,样品的前处理方法也略有不同。
可湿性粉剂在加工的过程中需要加入载体(如硅藻土、高岭土)和助剂(如润湿剂、分散剂)等。在样品处理过程中,载体一般不溶解于甲醇,可通过离心除去。助剂在甲醇中有一定的溶解性,但不影响对农药的提取。可湿性粉剂可以直接加入甲醇后超声提取。
乳油样品在加工的过程中加入了大量的有机溶剂和助溶剂,如甲醇、乙腈、丙酮等溶剂,由于称取的样品量较少,这些溶剂均可以溶解于甲醇中,对样品提取没有影响。
悬浮剂在加工的过程中加入了一些特殊的助剂如分散剂、润湿剂等,如直接加入甲醇,样品容易聚集,不利于提取。因此在样品中先加入5 mL水,使样品均匀分散在水中,再加入甲醇超声溶解提取。
对于这3种剂型的农药制剂,在提取过程中,一些干扰物质如润湿剂、分散剂等也会被提取到甲醇溶液中,这些物质对分离和测定有一定的影响,但是由于非法添加杀虫剂的含量较高,样品经过提取后需要稀释才能进样分析,干扰物质也同时被稀释,从而减少了对分析测定的影响。经过比较,不经净化处理的样品对测定基本没有影响,可直接进样分析,从而减少了样品前处理造成的损失,提高了回收率。
一般检测农药常用乙腈-水或甲醇-水两种混合溶剂体系作为流动相,首先对这两种体系作流动相进行了对比。结果表明,使用乙腈-水体系做流动相时,48种杀虫剂的色谱峰形较好,峰形对称,响应值也高于以甲醇-水为流动相时的响应值,采用乙腈-水体系的压力较低,有利于色谱柱的寿命和仪器的保护。之后考察了酸对分离和灵敏度的影响,结果表明,以乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液为流动相得到了最优的峰形和色谱分离效果。在流动相中加入0.1%(v/v)甲酸,有助于提高化合物的离子化效率,提高灵敏度。因此选择以乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相。
采用正离子扫描模式,优化了48种杀虫剂的准分子离子峰,选择强度大的准分子离子峰可以提高分析的灵敏度和质谱数据库检索的稳定性与得分。经过优化,在ESI+模式下,水胺硫磷[M+Na]+的强度大于[M+H]+的强度,其余47种农药的[M+H]+强度最大。如表 1所示，为了实现对48种杀虫剂的谱库检索定性检测,所获得的二级质谱图在高质量区和低质量区的碎片都非常重要,因此,每种杀虫剂均获得4个不同碰撞能量下的二级质谱图,在进行谱库检索时,低碰撞能量的质谱图有利于判断主要碎片,而高碰撞能量的质谱图可以得到更多质谱碎片信息,能够更准确地实现对化合物的定性。根据试验结果选择4个碰撞能量(5、10、20和40V),可以实现每种杀虫剂在高质量区和低质量区获得足够的质谱碎片信息。48种农药的准分子离子[M+H]+或者[M+Na]+的实测Mr和通过Mr计算软件计算出的每种杀虫剂的理论Mr值见表 1。按照前述优化的条件对48种杀虫剂的混合标准溶液进行检测,得到总离子流图(见图 1)。
先对样品进行一级质谱全扫描,通过一级质谱数据库对采集到的一级质谱图进行自动检索,软件根据实测离子与数据库中的保留时间、精确质量、同位素分布和同位素比例等因素的匹配度进行综合评分,将检索得分≥85的样品确定为阳性样品。再利用二级质谱的碎片离子对阳性样品进一步确证。样品经过二次进样测定,对阳性样品中疑似非法添加的杀虫剂进行二级质谱扫描,将采集到的二级质谱图通过已建立的二级质谱数据库进行检索,根据离子精度、同位素比例、同位素丰度等因素进行综合评分,将得分≥75的农药确定为非法添加的杀虫剂。
为了考察本文所建立的筛查方法对48种杀虫剂筛查结果的可靠性,采用已建立的一级质谱数据库和二级质谱数据库对样品中添加了48种杀虫剂的可湿性粉剂、乳油、悬浮剂样品进行自动检索,结果见表 1。
配制0.5～20 mg/L范围的标准溶液,以化合物的准分子离子峰作为定量离子,在本文所述的色谱条件和质谱条件下进行测定,以提取离子色谱图的峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X,mg/L)为横坐标进行回归分析。结果表明,48种杀虫剂的线性相关系数R2均大于0.99,说明本方法适用于农药制剂中48种杀虫剂的定量分析。对筛查出的非法添加杀虫剂进行定量分析时,使用宽度为20×10-6(20 ppm)的质量偏差对一级全扫描总离子流图提取离子色谱图,采用外标法以提取离子色谱峰的峰面积进行定量分析。
以定量离子10倍信噪比(S/N)的响应值对应的质量浓度为方法定量限(LOQ);以一级质谱数据库检索得分≥85和二级质谱数据库检索得分≥75的筛查最低质量浓度作为方法的检出限(LOD)(见表 2)。选择可湿性粉剂、乳油、悬浮剂空白样品进行加标回收试验,选取0.5、1.0和5.0 mg/kg 3个添加水平,每个水平重复测定3次,48种杀虫剂在3种剂型中的加标回收率为86.3%～101.5%,相对标准偏差(RSDs)为1.7%～4.0%(见表 2)。
从上海郊区9个区(县)的农资门店抽取了100份样品,应用本方法进行快速筛查及含量分析,结果见表 3。在100个样品中,有9个样品检出非法添加的杀虫剂,9份样品的一级质谱检索得分≥85,二级质谱检索得分≥75,非法添加成分的含量均大于1%(质量分数)。
建立了可湿性粉剂、乳油、悬浮剂等3种农药制剂中48种杀虫剂的UPLC-Q-TOF MS筛查方法。该方法具有快速、定性准确等优点,能有效避免样品的误检和漏检,可以满足农药制剂中非法添加成分的快速筛查和定量要求。本次抽取的100份样品中筛查出了我国在蔬菜、水果等作物上禁止或者限制使用的农药,如克百威、灭多威、马拉硫磷等,这些农药使用后,可能引起作物药害、农产品残留超标等一系列严重后果,危害到人民群众的身体健康和农民的经济利益。通过对非法添加成分的快速筛查,能够从源头加强农药质量的管理,确保农产品质量安全和农民的利益,为相关的监管部门提供技术支持。
2016,
Vol. 34 Issue (9): 880-887
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