离子色谱-柱切换技术同步测定饮料中的三氯蔗糖、葡萄糖、果糖和蔗糖


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	陈宁

	张培敏

	吴述超

	朱岩

陈宁^1,2, 张培敏¹, 吴述超³, 朱岩^1,2

1. 浙江大学化学系, 浙江杭州 310028;
2. 浙江省微量有毒化学物健康风险评估技术研究重点实验室, 浙江大学, 浙江杭州 310028;
3. 浙江省地质矿产研究所, 浙江杭州 310007

收稿日期：2016-05-26

基金项目：国家自然科学基金项目（21405141）；国家重大科学仪器设备开发专项（2012YQ09022903）；浙江省自然科学基金项目（LZ16B050001，LY15B050001，S16H180002）；浙江省微量有毒化学物健康风险评估技术研究重点实验室（2014006，2014007）；国土资源部黏土矿物重点实验室开放基金（2014-K03）.

通讯联系人： Tel:(0571)88273637,E-mail:zhuyan@zju.edu.cn

摘要：建立了一种离子色谱-柱切换-安培检测技术同步测定饮料中三氯蔗糖、葡萄糖、果糖和蔗糖的方法。以CarboPac PA10阴离子交换保护柱和分析柱进行分离，用水和250 mmol/L NaOH梯度淋洗，脉冲安培检测。弱保留糖类在25 mmol/L NaOH流动相淋洗下分离检测，通过柱切换将保护柱切换至分析柱后，同时切换至250 mmol/L NaOH淋洗，三氯蔗糖仅通过较短的保护柱分离，4种糖类能够得到同步检测。4种糖类在0.01~20 mg/L范围内有良好的线性关系和较低的检出限，重复性好，样品测定的回收率分别为90.38%~102.88%（三氯蔗糖）、95.56%~102.75%（葡萄糖）、101.66%~114.33%（果糖）和105.03%~106.49%（蔗糖）。该方法可广泛应用于食品中强保留物质的测定。

关键词：离子色谱柱切换三氯蔗糖

Simultaneous determination of sucralose, glucose, fructose and sucrose in beverage by ion-exchange chromatography with column-switching

CHEN Ning^1,2, ZHANG Peimin¹, WU Shuchao³, ZHU Yan^1,2

1. Department of Chemistry, Zhejiang University, Hangzhou 310028, China ;
2. Key Laboratory of Health Risk Appraisal for Trace Toxic Chemicals of Zhejiang Province, Zhejiang University, Hangzhou 310028, China ;
3. Zhejiang Institute of Geology and Mineral Resources, Hangzhou 310007, China

Received: 2016-05-26

Foundation Item: National Natural Science Foundation of China (No. 21405141); National Important Project on Science Instrument (No. 2012YQ09022903); Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (Nos. LZ16B050001, LY15B050001, S16H180002); Key Laboratory of Health Risk Appraisal for Trace Toxic Chemicals of Zhejiang Province (Nos. 2014006, 2014007); Open Foundation of the Key Laboratory of Clay Minerals, the Ministry of Land and Resources of China (No. 2014-K03).

^* Corresponding author. Tel:(0571)88273637,E-mail:zhuyan@zju.edu.cn

Abstract: A new method of simultaneous determination of sucralose, glucose, fructose and sucrose in beverage has been established using ion-exchange chromatography coupled with column-switching and pulsed amperometric detection. A CarboPac PA10 guard column and a CarboPac PA10 analytical column, along with the mixtures of pure water and 250 mmol/L NaOH solution in different ratio acting as mobile phase in the gradient elution were used in the pulsed amperometric detection. After the separation and detection of saccharides with weak retention through elusion with 25 mmol/L NaOH, we switched the guard column to analytical column, in which sucralose can be separated through the comparatively short guard column while the four saccharides can be detected simultaneously. In this study, four saccharides had good linear relationships in 0.01-20 mg/L and the recoveries were 90.38%-102.88% (sucralose), 95.56%-102.75% (glucose), 101.66%-114.33% (fructose), 105.03%-106.49% (sucrose) with high sensitivity and good reproducibility. This method can be widely used in the determination of components with strong retention in food.

Key words: ion-exchange chromatography column-switching sucralose

三氯蔗糖是一种人工合成的新型甜味剂,有研究指出,三氯蔗糖的甜度是蔗糖的600倍,而在代谢过程中,90%左右的三氯蔗糖都不会被人体吸收^[1-3],因而一度被认为是人类发明的最完美和最具竞争力的高甜度甜味剂。之前并没有证据表明三氯蔗糖在人体代谢过程中会产生毒副作用,但最近有研究指出其可能造成人体的代谢紊乱^[4]。由于其强保留的特性,针对现有测定方法中的难点,构建一个能够快速准确测定食品和饮料中三氯蔗糖的方法对于目前的研究工作具有重要意义。

目前,三氯蔗糖的检测方法主要有气相色谱-质谱联用(GC-MS)法^[5]和高效液相色谱(HPLC)法^[6-12]等。这些方法对于三氯蔗糖的测定往往存在前处理繁琐、难以达到定量要求等弊端。离子色谱(IC)是高效液相色谱的一种,由于其具有检测灵敏度高、分析速度快等优点,被广泛用于水溶性体系中阴、阳离子的测定^{[13, 14]}。柱切换技术作为一种在线样品前处理技术被广泛应用于离子色谱^[15-20]。本文建立了离子色谱-柱切换-脉冲安培检测技术联用同步测定饮料中的三氯蔗糖、葡萄糖、果糖和蔗糖的方法。采用一根短的保护柱作为强保留物质(三氯蔗糖)的分析柱,成功实现了三氯蔗糖和弱保留糖类(葡萄糖、果糖、蔗糖)的同步分离、分析。该方法步骤简单,实用性强,配合具有高灵敏度和良好选择性的金电极安培检测器使用,可用于食品、饮料中糖类的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ICS-3000离子色谱仪,配有一个四元梯度泵,一个25 μL定量环及两个六通阀,一套ED50电化学安培检测器和Chromeleon 6.8色谱工作站(美国Thermo Fisher公司); IonPac AG-11HC高效阴离子交换保护柱(50 mm×4 mm)、CarboPac PA1保护柱(50 mm×4 mm)、CarboPac PA10保护柱(50 mm×4 mm)和CarboPac PA10分析柱(250 mm×4 mm)均购于美国Thermo Fisher公司;Millipore净水器(美国Millipore公司); 0.22 μm尼龙滤膜(杭州汇普化工仪器有限公司); 99.999%高纯N₂(杭州今工特种气体有限公司)。

葡萄糖、果糖、蔗糖、三氯蔗糖标准样品购于美国阿拉丁工业公司;质量分数为50%的NaOH溶液购于美国Thermo Fisher公司。

4种糖标准储备溶液的配制:每种分别准确称取0.100 g,用二次去离子水于100 mL容量瓶中定容,得到1 000 mg/L的标准储备溶液,保存于4 ℃冰箱内备用。使用时用二次去离子水稀释,配制成不同浓度的标准混合工作液。

实际样品购于超市,为常见的运动型饮料。

1.2 色谱分析条件

色谱柱:CarboPac PA10保护柱和CarboPac PA10分析柱;柱温:30 ℃;进样体积:25 μL;流动相:NaOH;流速:1 mL/min。将保护柱、分析柱按照图 1所示顺序连接,其中阀1(Valve 1)为进样阀,阀2(Valve 2)为切换阀。在连接时尽可能缩短连接管路以减少死体积。采用柱切换技术,淋洗液浓度和二次阀切换时间数据见表 1。

图 1 柱切换系统装置图 Fig. 1 Configuration of the column-switching system

表 1 柱切换系统操作条件 Table 1 Operation procedure of the column-switching system

1.3 样品预处理

糖易溶于水,使用二次去离子水将样品稀释至一定倍数,超声10 min,经0.22 μm尼龙滤膜过滤,待测。

1.4 定量方法

采用外标法定量,按照优化后的色谱条件对一系列不同质量浓度的糖标准溶液进行检测,同一质量浓度平行检测6次,对峰面积和质量浓度做线性拟合。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 分离柱的选择

为防止强保留基质进入较长的分离柱,首先用保护柱进行测试,同时为检测分离柱的分离性能,比较了不同保护柱作为三氯蔗糖的分析柱,分别为大交换容量的CarboPac PA1柱、CarboPac PA10柱和相对较低交换容量的IonPac AG-11HC柱。

测试后发现,IonPac AG-11HC柱对三氯蔗糖没有保留,与水负峰一同出峰;CarboPac PA1和CarboPac PA10保护柱在250 mmol/L NaOH淋洗下,能在10 min内完成三氯蔗糖的分离、检测。再比较CarboPac PA1和CarboPac PA10保护柱配合分离柱的分离效果,发现CarboPac PA1柱在分析单糖时耗时较长,不利于分离效率的提高,故选用CarboPac PA10保护柱与分离柱。

2.1.2 流动相浓度的选择

在分离糖类时,由于葡萄糖、果糖、蔗糖等弱保留糖类和三氯蔗糖的保留能力相差极大,用低浓度NaOH淋洗时,对三氯蔗糖几乎没有影响。试验测得50 mmol/L NaOH淋洗2 h时,三氯蔗糖不出峰。因此考虑先确定弱保留糖类的淋洗液浓度。考察了葡萄糖、果糖、蔗糖在15、20、25和30 mmol/L NaOH淋洗时的保留情况(见表 2)。在15～25mmol/L 范围内,随着淋洗液浓度的提高,各色谱峰的保留时间随之缩短。当淋洗液浓度增至30 mmol/L时,果糖峰出现一定程度后移,与蔗糖的色谱峰出现重叠,分离度变差,无法分离。从淋洗液消耗和分离度角度考虑,25 mmol/L NaOH能使得3种糖得到较好的分离,因此选用25 mmol/L NaOH作为初步淋洗的条件。

表 2 不同浓度NaOH流动相下糖标准溶液的保留时间和分离度 Table 2 Retention time and resolution for the sugar standard solutions with different concentrations of the NaOH mobile phase

2.1.3 柱切换时间的确定

实际样品中的葡萄糖、果糖、蔗糖在保护柱中先于三氯蔗糖冲出,由于柱切换同时结合淋洗液浓度梯度的切换,因此在确保其他3种糖组分完全收集的情况下再进行柱切换测定三氯蔗糖比较合适。

在实际样品和标准混合工作液(标准样品)中,18.5 min时葡萄糖、果糖、蔗糖均得以分离、检测,故本试验确定18.5 min为柱切换时间,由Chromeleon 6.8软件控制切换,可保证弱保留糖类被完全收集而三氯蔗糖仍保留于保护柱中。由图 2可知,在柱切换后,同步切换淋洗液浓度,三氯蔗糖能在基线平稳后出峰,得以定量,证明该实验方案可行。

图 2 离子色谱-柱切换技术测定实际样品和标准样品(20 mg/L葡萄糖、蔗糖、三氯蔗糖、10 mg/L果糖)的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of a real sample and the standard sample (20 mg/L glucose,sucrose,sucralose,10 mg/L fructose) separated by ion exchange chromatography with column-switching

2.2 方法的验证

如表 3所示,取25 μL系列糖标准混合工作溶液进样,按优化后的色谱条件进行检测,同一浓度平行检测6次,计算峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSDs)。以峰面积为y、质量浓度为x(单位为mg/L)做线性方程。线性方程、检出限(LODs,S/N=3)以及线性范围等结果见表 3。

表 3 糖标准溶液的线性方程、线性范围、相关系数(r²)、检出限及相对标准差(n=6) Table 3 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients (r²),limits of detection (LODs) and relative standard deviations (RSDs) of the sugar standard solutions (n=6)

2.3 实际样品检测

将该方法应用于实际样品的检测。样品购于超市,为常见的运动型饮料。由于为水溶性样品,因此无需复杂的前处理,按1.3节方法处理后,稀释1 000倍直接进样,在优化的实验条件下进行测定,采用外标法定量,实际样品和标准样品的色谱图见图 2。取适量实际样品,平行添加3份糖标准溶液,加标回收数据见表 4。

表 4 饮料样品中4种糖类的加标回收率(n=3) Table 4 Spiked recoveries of the four sugars in beverage samples (n=3)

3 结语

本文建立了离子色谱-柱切换技术结合脉冲安培检测器测定实际样品中三氯蔗糖、葡萄糖、果糖和蔗糖的方法,并将其应用于实际样品的检测。该方法具有前处理步骤少、重现性好、线性范围宽、结果可靠等优点,对于今后系统性测定食品中强保留组分提供了理论依据,可广泛应用于食品安全等领域样品的检测。

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