色谱  2016, Vol. 34 Issue (10): 964-967   PDF    
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刘玉秀
喻宏伟
离子色谱法测定甘油磷酸制剂中的β-甘油磷酸根和L-苹果酸根
刘玉秀, 喻宏伟     
瑞士万通中国北京中心实验室, 北京 100101
收稿日期：2016-07-04
通讯联系人： E-mail:bj.liuyx@metrohm.com.cn
摘要：建立了离子色谱等度洗脱检测甘油磷酸制剂中的 β-甘油磷酸根和L-苹果酸根的分析方法。实验采用Metrosep A Supp7离子色谱柱（250 mm×4.0 mm，5 μm）分离，3.6 mmol/L碳酸钠（Na2CO3）溶液等度洗脱，流速为0.7 mL/min，柱温为35℃，电导检测器测定，外标法定量。该方法可将甘油磷酸制剂中的 α -甘油磷酸根与 β-甘油磷酸根完全分离。β-甘油磷酸根和L-苹果酸根的加标回收率为90.73%~106.27%。该方法简单、快速、灵敏，适用于甘油磷酸制剂中 β-甘油磷酸根和L-苹果酸根的检测。
关键词： 离子色谱法     β-甘油磷酸根     L-苹果酸根     甘油磷酸制剂    
Determination of β-glycerophosphate and L-malate in glycerol phosphate preparations by ion chromatography
LIU Yuxiu, YU Hongwei     
Lab of Competence Center, Metrohm China Limited, Beijng 100101, China
Received: 2016-07-04
* Corresponding author. E-mail:bj.liuyx@metrohm.com.cn
Abstract: An analytical method for the determination of β-glycerophosphate and L-malate in glycerol phosphate preparations was established by ion chromatography with isocratic elution. α -Glycerol phosphate was completely separated from β-glycerol phosphate in the glycerol phosphate preparations. A Metrosep A Supp7 column (250 mm×4.0 mm, 5 μm) was used for separation with the eluent of 3.6 mmol/L Na2CO3 at a flow rate of 0.7 mL/min. The column temperature was 35℃. With this method, good accuracy and precision were obtained. The recoveries of the method ranged from 90.73% to 106.27%. The method is simple, rapid, sensitive, and suitable for the determination of β-glycerophosphate and L-malate in glycerol phosphate preparations.
Key words: ion chromatography (IC)     β-glycerophosphate     L-malate     glycerol phosphate preparations    

甘油磷酸制剂属营养药,主要作为补药和辅助剂用于营养不良和再生障碍性贫血等症状的辅助治疗。药物中主要成分的定性分析和准确定量对药物的质量安全至关重要。本文重点测定甘油磷酸制剂中的β-甘油磷酸根和L-苹果酸根的含量。甘油磷酸钠的分析方法有分光光度法[1, 2]、原子吸收分光光度法[3]和离子色谱法[4-7]等。在甘油磷酸钠的制备过程中,由于磷酸的取代位置不同,可生成α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠。α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠的性质较为接近,二者的结构式见图 1。常规检测方法很难将α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠分开,而梯度洗脱结合离子色谱法可以将其分离[7]。本实验采用等度洗脱-离子色谱法将α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠完全分离,使β-甘油磷酸根在检测过程中不受α-甘油磷酸根的干扰,并可根据需要同时对2种甘油磷酸根进行定量分析。

图 1 α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠的结构式 Fig. 1 Structures of α-sodium glycerophosphate and β-sodium glycerophosphate

苹果酸是甘油磷酸制剂中重要的有机酸成分,常见的检测方法有衍生化气相色谱法[8]、离子色谱法[9, 10]、HPLC-紫外检测法[11]、离子排斥-紫外检测法[12-14]。气相色谱法需进行衍生反应,操作繁琐;HPLC法不能同时测定其他离子态物质;离子排斥法采用的分离柱同样不适于其他离子态物质的同时检测。本文建立了离子色谱电导法同时测定β-甘油磷酸根和L-苹果酸根,二者完全分离且不受其他阴离子的干扰。该方法快速、准确,可用于药物制剂中β-甘油磷酸根和L-苹果酸根的完全分离和检测。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

940 Professional离子色谱仪配在线真空脱气机、柱温箱、超微填充嵌体抑制器、二氧化碳抑制器和电导检测器,858 Professional自动样品处理系统,MagIC Net 3.1工作站(瑞士万通公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

碳酸钠(Na2CO3)为优级纯(德国Merck公司);浓硫酸(浓H2SO4)、L-苹果酸均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司); β-甘油磷酸钠为分析纯(美国Sigma公司);磷酸根标准溶液(1 g/L,中国计量科学研究院)。α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠混合物为分析纯(北京硕康医药科技有限公司)。实验用水均为超纯水(电阻率＞18.2 MΩ\5cm,25 ℃)。

实验所测1#和 2#样品采用2种不同配方所制(北京硕康医药科技有限公司)。

1.2 仪器条件

色谱柱:Metrosep A Supp7 (250 mm×4.0 mm,5 μm)(瑞士万通公司);淋洗液:3.6 mmoL/L Na2CO3溶液;抑制器:超微填充嵌体抑制器,再生溶液为50 mmoL/L H2SO4,清洗溶液为超纯水溶液;检测器:电导检测器;进样量:20 μL;流速:0.7 mL/min;柱温:35 ℃。

1.3 标准溶液的配制

称取0.1 g β-甘油磷酸钠和L-苹果酸于100 mL容量瓶中,用超纯水完全溶解后定容至刻度,摇匀,分别配制质量浓度为1 g/L的β-甘油磷酸根和L-苹果酸根标准储备液。分别逐级稀释标准储备液,配制质量浓度为2、5、10、20、40 mg/L的混合标准溶液。

分别称取0.1 g α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠混合物于100 mL容量瓶中,用超纯水溶解定容,配制质量浓度为1 g/L的混合储备液。量取1 mL混合储备液至100 mL容量瓶中,配制质量浓度为10 mg/L的α-甘油磷酸根和β-甘油磷酸根混合对照溶液。

取1 mL 1 g/L磷酸根标准溶液至100 mL容量瓶中,用超纯水定容至刻度,配制质量浓度为10 mg/L的磷酸根溶液。

1.4 样品前处理

1# 样品稀释100倍,2# 样品稀释25倍，用0.22 μm滤膜过滤,采用自动样品处理器进样。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化

由于甘油磷酸制剂样品中存在性质相近的α-甘油磷酸根和β-甘油磷酸根,因此采用高选择性的Metrosep A Supp7阴离子交换柱进行分离,优化后的淋洗液为3.6 mmoL/L Na2CO3溶液。随着柱温的升高,2种甘油磷酸根的分离度逐渐降低；降低柱温,分离度逐渐增加；但当柱温降至35 ℃以下时,柱压升高,整体保留时间延后。因此本实验选择色谱柱的温度为35 ℃。β-甘油磷酸根和L-苹果酸根混合标准溶液(10 mg/L)的色谱图见图 2,二者在36 min内洗脱完全。

图 2 β-甘油磷酸根和L-苹果酸根混合标准溶液(10 mg/L)的色谱图 Fig. 2 Chromatogram of β-glycerophosphate and L-malate mixed standard solutions (10 mg/L)

在最优色谱条件下,1#样品稀释100倍后的色谱图见图 3。与α-甘油磷酸根和β-甘油磷酸根的混合溶液及磷酸根标准溶液的色谱图进行比较,发现所测物质间无干扰。α-甘油磷酸根和β-甘油磷酸根的色谱峰峰形对称,可达到基线分离。在优化的色谱条件下,α-甘油磷酸根的存在不会干扰β-甘油磷酸根的含量测定,且可在工艺检测有需求时同时对二者进行检测。

图 3 1#样品稀释100倍的色谱图 Fig. 3 Chromatogram of sample 1# which was diluted for 100 times
2.2 线性关系和检出限

在优化的色谱条件下,对β-甘油磷酸根和L-苹果酸根标准溶液进行分析,以峰面积(Y)为纵坐标,质量浓度(X,mg/L)为横坐标建立标准曲线。计算β-甘油磷酸根和L-苹果酸根峰面积的RSD(n=7)。β-甘油磷酸根和L-苹果酸根的线性方程、线性范围、相关系数(r)和检出限(LOD,S/N＞3)见表 1。

表 1 β-甘油磷酸根和L-苹果酸根混合标准溶液的线性方程、线性范围、相关系数(r)、检出限和相对标准偏差(n=7) Table 1 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients (r),LODs and RSDs of β-glycerophosphate and L-malate mixed standard solution (n=7)
2.3 精密度试验

样品按1.4节处理后,在最优色谱条件下进行分析。实际样品中β-甘油磷酸根和L-苹果酸根的平均含量和RSD(n=3)见表 2。

表 2 实际样品中β-甘油磷酸根和L-苹果酸根的含量和相对标准偏差(n=3) Table 2 Contents and RSDs of β-glycerophosphate and L-malate in real samples (n=3)
2.4 加标回收率试验

为验证该方法的准确性,对样品稀释液进行加标回收率试验,分别添加不同质量浓度的β-甘油磷酸根和L-苹果酸根,样品的平均回收率为90.73%～106.27%(n=3)(见表 3)。

表 3 样品稀释液中β-甘油磷酸根和L-苹果酸根的加标回收率(n=3) Table 3 Spiked recoveries of β-glycerophosphate and L-malate in sample diluents (n=3)
3 结论

采用离子色谱-抑制电导检测法快速、准确地测定了甘油磷酸制剂中β-甘油磷酸根和L-苹果酸的含量,同时对α-甘油磷酸根与β-甘油磷酸根进行完全分离。该方法操作简单、选择性高、重现性好,适用于药物制剂中相关离子的检测。

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